Resistensi Antibiotik dan Kerentanan Terhadap Beberapa Langkah Pengawet

Makanan Pembusukan dan Patogen mikro-organisme dari rempah-rempah

2. Bahan dan Metode

2.1. Organisms
Strain bakteri yang digunakan diisolasi sebelumnya dari rempah-rempah yang
berbeda dikumpulkan dari outlet ritel di India (Banerjee dan Sarkar, 2003a). Sementara
Cl. Perfringens strain yang dipelihara dalam medium daging dimasak (Kat. No M149;
HiMedia Laboratories Pvt Ltd,. Mumbai, India), semua jenis lainnya dipertahankan pada
Trypton kedelai agar (TSA; HiMedia M290) miring pada 4 C, withsu bculturing setelah
setiap 6 bulan.
2.2. Kerentanan terhadap antibiotik
Hal yang mempengaruhi metode difusi ditentukan oleh disk agar (Himedia,1998).
Biakan 3 koloni yang berumur 24-h dipindahkan menjadi sekitar 5ml kaldu kedelai
tryptone (TSB; HiMedia M011) dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 6-8 jam sampai
kaldu menjadi agak keruh. Swab kapas steril (HiMedia) dicelupkan kedalam inokulum
dan dioleskan secara merata padaagar Mueller-Hinton (HiMedia M173) (TSA untuk Ci.
perfringens) plat (ketebalan 4mm). Setelah kering dalam 15 menit, uji kerentanan
berbagai antibiotik diterapkan secara aseptik. Disk tersebut disimpan setidaknya berjarak
30 mm dengan pusatnya. Plat diinkubasi pada suhu 37oC selama 14-19 jam (dalam
HiMedia AnaeroHiGas Pack System LE002, untuk Cl. Perfringens). Kelengkapan zona
penghambatan diukur secara rinci. Lembar instruksi HiMedia diikuti untuk menafsirkan
ukuran zona.
2.3 Inaktivasi Panas Pembentukan spora
Metode yang dijabarkan oleh Johnson et all (1982) dianut. Plat agar (FNA)
diperkaya dengan nutrisi merupakan unggulan dengan suspensi dari B. Cereus yang
tumbuh di TSB pada suhu 30oC selama 24 jam, dan terbalik untuk tambahan pada suhu
30oC selama 24 jam. Kemudian plat ditahan pada suhu 4oC selama 24 jam.
Pertumbuhan pada masing-masing plat dihentikan di 10 ml air dingin penyulingan oleh
gesekan dengan gelas kaca. Suspensi disentrifugasi sebanyak 8 kali pada 9500 x g selama
8 menit. Antara masing-masing sentrifugasi, cairan yang supernatant dibuang, dan cairan
pada 60ml air dingin disuling. Cairan terakhir yang tersisa disuling dalam air dingin.
Pemilihan untuk media sporulasi maksimum, plat agar anaerob (HiMedia M288),
agar perifringens (PA; HiMedia M579), ditambah daging masak dengan agar 20g1 -1 dan
cairan medium thioglycolate (FTM; HiMedia M009) ditambah dengan agar agar 20g1-1
merupakan permukaan unggul dengan Cl. Perfringens dan diinkubasi secara anaerob
pada suhu 37oC selama 5 hari. Toples kemudian disimpan pada suhu 4oC selama 5 hari.
Jumlah spora dan sel vegetatif dilakukan dengan menggunkan kamar hitung neubauer
pada kontras objektif. Medium menunjukkan persentase tertinggi sporulasi untuk
penyusunan suspensi spora. Suspensi kerja spora disiapkan berikut protokol seperti yang
dijelaskan untuk persiapan suspensi spora B. Cereus, dan takluk dengan panas pada suhu
80oC selama 30 menit.
Untuk B. Cereus, tabung dengan 9ml brain-heart infusion broth dengan 10 g
glokosa 1-1 ditempatkan dalam water bath dan dipanaskan hingga 91 C, 94 C, 97 C, dan
100 C. Temperatur pada water bath dan tabung tidak diinokulasi dipantau. Ketika
temperatur tabung dipantau mencapai tingkat yang diperlukan, 1 ml suspensi spora B.
Cereus ditambahkan ke tabung pertama. Setiap interval 5 menit, 1 ml suspensi spora
ditambahkan ke tabung berikutnya di dalam water bath. Kontrol adalah yang terakhir
ditambahkan suspensi spora. Semua tabung dipindahkan segera dari waterbath setelah
penambahan suspensi spora pada kontrol. Setelah dinginkan pada suhu kamar, tabung
yang diencerkan berturut-urut pada tingkat desimal diduling menggunakan air dingin
steril. Pengenceran yang tepat digunakan untuk menghitung palt di nutrien agar yang
kemudian diinkubasi pada suhu 35 C selama 24 jam. Nilai D ditentukan dari tmbal balik
negatif dari percobaan individu menggunakan bgian linier dari kurva log cfu terhadap
waktu. Diplot pada skala semi log. Nilai z ditentukan dengan pemetaan nilai log d
terhadap masing-masing suhu.
Untuk Cl. Perfringens, tabung dengan 9ml FTM ditempatkan di waterbath dan
dipanaskan ingga 100 C. Setelah perlakuan panas yang telah dijelaskan sebelumnya,
pengenceran yang sesuai telah tersebar di plat PA dan dilapisi dengan media yang sama.
Plat kemudian diinkubasi secara anaerob pada suhu 35 C selama 48 jam.
2.4 efek dari pengawetan pangan pada pertumbuhan
Ph nutrient broth steril FTM disesuaikan denagn tingkat yang berbeda
menggunakan 2 N HCl atau 2 N NaOH dan pH meter. Kultur saat 24 jam (0,1 ml)
ditambahkan pada masing-masing tabung dan labu mengandung media 10ml.
Pertumbuhan diukur secara turbidimetrik pada 580 nm menggunaan
spectrofotokalorimeter. Plat NA ditambah konsentrasi yang berbeda dari sodium klorida,
filter steril asam benzoat, filter steril asamsorbat, di plot dengan kultur 18 jam
menggunakan 2 m dia lup.
Larutan steril yang mengandung 4x104 IU Nisaplin /ml disiapkan dengan
melarutkan 0,4 g nisaplin dalam 10 ml dengan0,02 N HCl (ph 1,85) dan ph dinaikan
hingga 3 diikuti oleh autoklaf pada 0,7 kg/cm2 selama 20 menit dan filtrasi melewati
kertas saring steril whatwan no 41. NA yang dicairkan bercampur dengan volume larutan
nisin untuk mendapatkan konsentrasi yang diinginkan dan dituangkan ke plat. Kultur
yang segar (18 jam)terlihat di plat (5 plot per plat). Untuk Cl. Perifingens plat PA
diinokulasi secara inkubasi anaerob pada suhu 35 C selama 24 jam.
Untuk mempelajari efek gabungan dari tiga variabel (ph, sodium klorida, dan
asam benzoat), dengan tiga tingkat dari sodium klorida dan asam benzoat (tak ada data)
pada 2 ph berbeda, 18 kombinasi perbedaan telah disiapkan. Sodium klorida pada
penambahan jumlah ditambahkan hingga 16 ml dimodifikasi untuk mendapatkan
konsentrasi yang diinginkan. Setelah proses autoklaf, asam benzoat disterilkan (3mg/ml)
ditambahkan ke sodium klorida steril dan ph akhir di naikkan dengan 2 N HCl dan 2 N
NaOh steril.
Cl. Prefringens 16-C2, suatu strain enterotoksigenik tumbuh pada 37 C selama 20
jam dalam medium daging yang dimasak dengan pemanasan pada 75 C selama 20 menit.
Kultur panas (0,8 ml) ditambahkan pada masing-masing set dan diinkubasi pada 37 C
selama 24 jam. Pertumbuhan dipantau secara turbidimetrik pada 580 nm. Untuk
pengujian kadar enteroksin, kultur disentrifugasi pada 900 x g selama 20 menit pada 4 C
dan supernatant digunkan untuk uju kadar racun menggunakan PET-RPLA peralatan
deteksi racun berikut lembar instruksi oxoid