Anda di halaman 1dari 9

MAKALAH TEKNOLOGI ENZIM

ENZIM SEBAGAI BAGIAN BAHAN/REAGEN PENTING DALAM


DIAGNOSE PENYAKIT
(PENGUKURAN KOLESTEROL DENGAN BANTUAN ENZIM KOLESTEROL
OKSIDASE HASIL ISOLASI DARI BAKTERI Pseudomonas sp.)

Disusun Oleh:
Anggy Anggraeni Wahyudhie (0808505002)

JURUSAN FARMASI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS UDAYANA
BUKIT JIMBARAN
2010
BAB I

PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang

Kolesterol adalah suatu metabolit yang mengandung lemak sterol yang ditemukan pada
membran sel dan disirkulasikan dalam plasma darah. Kolesterol merupakan jenis khusus dari
lipid/lemak yang disebut sebagai steroid. Steroid ini memiliki struktur kimia khusus yaitu
terdiri dari 4 cincin atom karbon (Swastini dan Astuti, 2007).

Gambar struktur steroid

Walaupun kolesterol merupakan salah satu turunan dari lemak, tetapi kolesterol dan
lemak memiliki substansi yang berbeda. Sutau makanan bisa saja tinggi kandungan lemaknya
tetapi bebas kolesterol, contohnya minyak zaitun ataupun sebaliknya makanan lain bisa
rendah kandungan lemaknya tetapi tinggi kandungan kolesterolnya.

Dilihat dari struktur kimianya, kolesterol merupakan senyawa lemak yang kompleks.
Sebagian besar kolesterol yang beredar di dalam tubuh manusia dihasilkan oleh hati yang
mencapai 80% dari total kolesterol, sisanya sebanyak 20% diperoleh dari makanan. Meski
kolesterol tampak jahat bagi tubuh manusia karena dapat menyebabkan berbagai macam
penyakit misalnya stroke dan jantung, sebenarnya kolesterol memiliki banyak kegunaan
dalam tubuh diantaranya berperan dalam produksi hormon seks dan membentuk dinding sel.
Kolesterol tidak larut dalam cairan darah, untuk itu agar dapat dikirim ke seluruh tubuh,
kolesterol dikemas bersama protein menjadi partikel yang disebut lipoprotein.
Kolesterol terdiri dari 2 jenis yaitu LDL (Low Density Lipoprotein) dan HDL (High
Density Lipoprotein). Kolesterol LDL adalah kolesterol yang mengangkut paling banyak
kolesterol di dalam darah. LDL sering disebut sebagai kolesterol jahat karena kadar LDL
yang tinggi akan menyebabkan pengendapan kolesterol dalam arteri sehingga kolesterol LDL
menjadi faktor resiko utama penyakit jantung koroner dan merupakan target utama dalam
pengobatan hiperkolesterolemia. Sedangkan kolesterol HDL mengangkut lebih sedikit
kolesterol daripada LDL sehingga kolesterol HDL lebih sering disebut sebagai kolesterol
baik karena dapat membuang kelebihan kolesterol jahat di dalam pembuluh arteri dan
dikembalikan ke dalam hati untuk diproses dan dibuang, sehingga kolesterol HDL ini mampu
mencegah kolesterol mengendap di dalam arteri dan memproteksi dari penyakit
aterosklerosis (terbentuknya plak pada dinding pembuluh darah). Selain LDL dan HDL,
terdapat pula satu jenis lemak yang berbahaya yaitu trigliserida. Trigliserida merupakan salah
satu jenis lemak yang dapat mempengaruhi kadar dari kolesterol karena semakin tinggi kadar
trigliserida dalam darah atau organ dalam tubuh maka kadar kolesterol juga semakin
meningkat. Faktor-faktor yang mempengaruhi meningkatnya kadar trigliserida dalam darah
seperti kegemukan, minum minuman beralkohol, terlalu banyak mengkonsumsi gula dan
lemak serta mengalami radang pankreas (Anonim, 2008).

Jumlah kolesterol yang berada di dalam tubuh harus dijaga agar tetap seimbang dan
sesuai dengan kebutuhan sehingga tubuh akan tetap sehat, salah satunya dengan tidak terlalu
sering makan makanan yang mengandung kolesterol sehingga kadar kolesterol dalam darah
tidak akan meningkat. Batas normal kadar kolesterol dalam tubuh adalah antara 160 hingga
200 mg/dl dengan ambang normal sebesar 200-239 mg/dl (Anonim, 2008). Untuk
mengetahui berapa kadar kolesterol dalam tubuh dalam upaya mengontrol kesehatan tubuh
maka diperlukan suatu metode untuk mengukur jumlah dari kolesterol tersebut, salah satunya
dengan menggunakan enzim sebagai reagensia diagnosis kolesterol yang dimanfaatkan
sebagai bahan untuk mencari petanda (marker) suatu senyawa sehingga keberadaan petanda
tersebut dapat diketahui dan diukur berapa jumlahnya. Enzim yang digunakan sebagai
reagensia dalam diagnosis kolesterol adalah enzim kolesterol oksidase, dimana enzim ini
akan membantu dalam menemukan keberadaan dari kolesterol dalam darah sehingga dapat
diukur kadarnya. Berkaitan dengan fungsinya sebagai reagensia dalam diagnosis, maka
enzim kolesterol-oksidase perlu mengalami isolasi dan pemurnian dari sumbernya sebelum
digunakan sebagai reagen. Tujuan dilakukan isolasi dan pemurnian adalah untuk
mendapatkan enzim spesifikasi yang bebas dari molekul-molekul pengotor yang dapat
mempengaruhi kerja dari enzim koleterol-oksidase saat berperan sebagai reagensi diagnosis.

1.2 Rumusan Masalah

1. Mengapa enzim kolesterol oksidase penting terutama kaitannya dengan bidang farmasi untuk
dieksplorasi/dimurnikan/diisolasi/diidentifikasi?

2. Bagaiman cara enzim kolesterol oksidase berkaitan dengan metode yang digunakan untuk
dieksplorasi/dimurnikan/diisolasi/diidentifikasi dari bakteri Pseudomonas fluorescens?

3. Bagaimana hasil yang diperoleh dari eksplorasi/pemurnian/isolasi/identifikasi dari enzim


kolesterol oksidase?

1.3 Tujuan

1. Untuk mengetahui manfaat mengeksplorasi/memurnikan/mengisolasi/mengindentifikasi


enzim kolesterol oksidase dalam bidang farmasi.

2. Untuk mengetahui metode yang digunakan untuk mengeksplorasi/ memurnikan/


mengisolasi/ mengindentifikasi enzim kolesterol oksidase dari bakteri Pseudomonas
fluorescens.

3. Untuk mengetahui hasil yang diperoleh dari eksplorasi/pemurnian/isolasi/identifikasi dari


enzim kolesterol oksidase.
BAB II

PEMBAHASAN

2.1 Peranan Enzim Kolesterol Oksidase dalam bidang Farmasi

Enzim merupakan suatu protein fungsional yang berfungsi untuk mempercepat laju suatu
reaksi tanpa mengalami perubahan struktur. Enzim memiliki peranan yang penting dalam
bidang kesehatan khususnya dalam bidang farmasi misalnya enzim dapat digunakan sebagai
reagen dalam diagnosis. Contoh dari enzim yang digunakan sebagai reagen dalam diagnosis
adalah enzim kolesterol oksidase. Enzim ini berfungsi untuk menemukan keberadaan dari
kolesterol di dalam darah sehingga dapat dilakukan pengukuran kadar kolesterol tersebut.

Dalam peranannya sebagai penanda adanya kandungan kolesterol dalam darah, enzim
kolesterol oksidase mengkatalisis oksidasi kolesterol (5-cholesten-3β -ol) menjadi 4-
cholesten-3-one dengan mereduksi oksigen menjadi hidrogen peroksida yang kemudian
akan dideteksi oleh enzim peroksidase sehingga dapat dihitung kadar dari kolesterol
tersebut.
Penggunaan enzim kolesterol oksidase dalam pengukuran kadar kolesterol sangat penting
dalam bidang farmasi, sebab pasien dapat mengetahui kadar kolesterol yang terkandung di
dalamnya tubuhnya sehingga bisa mencegah diri dari penyakit-penyakit disebabkan oleh
kandungan kolesterol berlebih seperti penyakit stroke dan jantung. Oleh sebab itu metode
kolorimetri enzymic yang menggunakan enzim kolesterol oksidase (COD) merupakan
metode yang relatif sederhana, sensitif, spesifik dan cepat, sehingga cocok digunakan untuk
pengujian rutin.

2.2 Proses Isolasi, Identifikasi dan Pemurnian Enzim Kolesterol Oksidase

Mikroorganisme yang memproduksi kolesterol-oksidase yaitu Pseudomonas dp. diisolasi


dengan prosedur sebagai berikut. Suspensi tanah disebarkan kedalam plat agar-agar yang
berisi media isolasi, yang tersusun dari gliserol 1,0%, 0,5% larutan curam jagung, 0,1%
KH2PO4, NaNO3 0,1% dan 0,05% MgSO4 (pH 7.3) dan dipadatkan dengan agar-agar
1,5%. Pelat diinkubasi pada suhu 30° C selama 24 jam dan koloni bakteri yang muncul
direplikasi dengan menggunakan tusuk gigi kedalam plat medium isolasi. Plat replika
selanjutnya diinkubasi pada suhu 30° C selama 24 jam. Untuk mengidentifikasi kolesterol-
oksidase, digunakan metode pewarnaan koloni pada plat agar. Filter kertas dicelupkan ke
dalam kolesterol 0,5%, 1,76% 4-aminoantipyrine, 6% fenol dan 3000 unit/1 horseradish
peroksidase dalam 100 mM buffer kalium fosfat, pH 7,0 (KPB), ditempatkan pada koloni
yang tumbuh pada media agar dan diinkubasi pada 30 ° C. Aktivitas kolesterol oksidase
dalam koloni uji ditunjukkan dengan adanya warna merah karena pembentukan pewarna
quinoneimine.
Strain yang mampu menghasilkan warna merah dipilih dan dibudidayakan pada suhu 30°
C dalam 5 ml media isolasi cair dengan pengocokan konstan. Sel-sel dikumpulkan dengan
sentrifugasi dan culture broth diuji untuk aktivitas ekstraselular kolesterol oksidase. Media
yang digunakan untuk pemurnian enzim adalah medium nutrisi (1,0% pepton, 0,4% ekstrak
ragi, 0,1% glukosa, 0,5% NaC1, pH 7,2) dan sel ditumbuhkan pada suhu 30° C selama 24
jam dengan pengocokan timbal balik dalam erlenmeyer flask 3-1 yang mengandung 1000 ml
media.
Pemurnian enzim kolesterol oksidase dilakukan pada suhu 00 – 50 C, kecuali dinyatakan
khusus. Proses pemurnian kolesterol oksidase dilakukan dalam tiga tahap yaitu tahap
persiapan larutan enzim kasar, tahap kromatografi kolom DEAE cellulose, serta tahap
kromatografi kolom afinitas kolesterol.
Pada tahap persiapan larutan enzim kasar, culture broth (10 1) di sentrifugasi pada 10000
rpm selama 10 menit. Kemudian supernatan bersih yang didapatkan selanjutnya digunakan
untuk pemurnian enzim.
Pada tahap kedua yaitu kromatografi kolom DEAE cellulose, culture broth (10200 mg
protein, 10 1) secara langsung diload pada kolom DEAE cellulose yang diequilibrasi dengan
10 mM KPB. Kolom dicuci secara ekstensif dengan 500 ml larutan buffer yang sama. Enzim
kolesterol-oksidase tidak akan mampu diserap pada kolom di bawah kondisi yg
ditetapkan. Selanjutnya fraksi aktif dikumpulkan dan kemudian dipekatkan melalui
ultrafiltrasi pada sebuah Pellicon Membran PTGC OLC M2.
Pada tahap ketiga yaitu tahap kromatografi kolom afinitas kolesterol, kolesterol
komersial direkristalisasi dengan menggunakan etanol 50%. Selanjutnya kolesterol yang
telah direkristalisasi tersebut digunakan sebagai adsorben enzim. Kolesterol oksidase yang
berkonsentrasi (508 mg protein, 100 ml) diload ke dalam kolom afinitas kolesterol (1,2 × 30
cm) yang diequilibrasi dengan 10 mM KPB. Setelah kolom tersebut dicuci dengan 100 ml 10
mM KPB, kolesterol oksidase kemudian dielusi dengan 0,1% Triton X-100 dalam 10 mM
KPB. Untuk menghapus kolesterol dan Triton X-100 dari dalam larutan enzim, eluat
dilewatkan pada kolom-G 150 Sephadex (1,6 x 90 cm) yang diequilibrasi dengan 10 mM
KBP. Fraksi aktif digabungkan, dan dipekatkan seperti tahap sebelumnya dan dapat
digunakan untuk karakterisasi kolesterol oksidase.

2.3 Hasil Pemurnian Enzim Kolesterol Oksidase

Tabel dibawah ini berisi tentang jumlah dari enzim kolesterol oksidase yang berhasil
dimurnikan dari tiap langkah dalam proses pemurnian.

.
BAB III

KESIMPULAN

Enzim merupakan suatu protein fungsional yang berfungsi untuk mempercepat laju suatu
reaksi tanpa mengalami perubahan struktur, contoh enzim yang digunakan yang digunakan
dalam bidang farmasi adalah enzim kolesterol oksidase yang berperan sebagai reagensia dalam
pengukuran kadar protein dalam tubuh. Sebelum digunakan sebagai reagen, enzim kolesterol
oksidase mengalami isolasi terlebih dari sumbernya yaitu Pseudomonas sp. kemudian
diidentifikasi dan terakhir dimurnikan dengan langkah-langkah pemurnian yaitu culture broth
(larutan enzim kasar), kromatografi kolom DEAE-cellulose dan kromatografi kolom afinitas
kolesterol sehingga dihasilkan enzim kolesterol oksidase spesifikasi.
DAFTAR PUSTAKA

Anonim. 2008. Majalah Farmacia Edisi Desember 2008 (Vol.8 No.5) (cited at December 10,
2010). Available at: www.majalah-farmacia.com/rubrik/one_news.asp.
Lee, Sang-young.,Rhee, Hae-ik.,Tae, Weon-chan., Shin, Jeong-chul and Park, Boo-kii.1989.
Purification and Characterization of Cholesterol Oxidase from Pseudomonas sp. and
Taxonomic Study of the Strain. Appl Microbiol Biotechnol 31:542-546.
Swastini, D.A dan Astuti, K.W. 2007. Buku Ajar Mata Kuliah Farmakognosi. Jurusan Farmasi
Fakultas MIPA Universitas Udayana: Bukit Jimbaran