BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Obat Generik dan Paten

Obat adalah bahan atau paduan bahan yang digunakan untuk

mempengaruhi atau menyelidiki sistem fisiologi atau keadaan patologi dalam

rangka penetapan diagnosa, pencegahan penyakit, penyembuhan penyakit,

pemulihan, dan peningkatan kesehatan termasuk kontrasepsi dan sediaan biologis

(Depkes RI, 2005).

Obat generik adalah obat dengan nama resmi yang telah ditetapkan dalam

Farmakope Indonesia dan INN WHO (International Non-proprietary Names

World of Health Organization) untuk zat berkhasiat yang dikandungnya di mana

obat generik hanya menggunakan nama yang sesuai dengan zat berkhasiat yang

dikandungnya walaupun diproduksi oleh pabrik yang berlainan (Depkes RI,

1989).

Obat paten adalah obat baru yang ditemukan oleh peneliti yang

mempunyai hak penuh/hak paten yang dikeluarkan WHO untuk obat yang

dihasilkannya. Obat dengan nama dagang yaitu nama pemberian pabrik yang

membuatnya di mana obat paten menggunakan nama dagang yang bermacam-

macam, tergantung pabrik yang memproduksi walaupun jenis obatnya sama.

Kemasannya dibuat mewah untuk menarik pembeli dan tiap pabrik

mempromosikannya dengan nama dagang masing-masing secara gencar melalui

berbagai cara sehingga harganya lebih mahal dari pada obat generik karena

perbedaan di promosi dan kemasannya (Depkes RI, 1989).

Universitas Sumatera Utara

2.2 Tablet Kotrimoksazol

Tablet Kotrimoksazol merupakan campuran dari Sulfametoksazol dan

Trimetoprim. Tablet Kotrimoksazol mengandung Sulfametoksazol C 10 H 11 N 3 O 3 S

dan Trimetoprim, C 14 H 18 N 4 O 3 , tidak kurang dari 93,0% dan tidak lebih dari

107,0% dari jumlah yang tertera pada etiket (DitJen POM, 1995).

2.2.1 Sifat Fisikokimia

2.2.1.1 Sulfametoksazol

Rumus struktur : H2 N SO 2 NH
N

O CH 3

Rumus molekul : C 10 H 11 N 3 O 3 S

Berat molekul : 253,28

Pemerian : serbuk hablur, putih sampai hampir putih, praktis

tidak berbau

Kelarutan : praktis tidak larut dalam air, dalam eter dan dalam

kloroform, mudah larut dalam aseton dan dalam

larutan natrium hidroksida encer, agak sukar larut

dalam etanol.

2.2.1.2 Trimetoprim

Rumus struktur :
NH 2 OCH 3
N
H2 N CH 2 OCH 3
N
OCH 3
Rumus molekul : C 14 H 18 N 4 O 3

Berat molekul : 290,36

Universitas Sumatera Utara

 Pemerian : hablur atau serbuk hablur,putih sampai krem, tidak

berbau

Kelarutan : sangat sukar larut dalam air, larut dalam

benzilalkohol, agak sukar larut dalam kloroform dan

dalam methanol, sangat sukar larut dalam etanol dan

dalam aseton, praktis tidak larut dalam eter dan

dalam karbon tetraklorida.

2.2.2 Mekanisme kerja

Aktivitas antibakteri kombinasi sulfametoksazol dan trimetoprim

berdasarkan kerjanya pada dua tahap yang berurutan pada reaksi enzimatik untuk

pembentukan asam tetrahidrofolat. Sulfonamida manghambat masuknya PABA

ke dalam molekul asam folat dan trimetoprim menghambat terjadinya reaksi

reduksi dari dihidrofolat menjadi tetrahidrofolat. Tetrahidrofolat penting untuk

reaksi-reaksi pemindahan satu atom C, seperti pembentukan basa purin (adenine

dan guanine), timidin dan beberapa asam amino (metinin, glisin). Sel-sel mamalia

menggunakan folat jadi yang terdapat dalam makanan dan tidak mensintesis

senyawa tersebut. Trimetoprim menghambat enzim dihidrofolat reduktase

mikroba secara sangat selektif. Hal ini penting, karena enzim tersebut juga

terdapat pada sel mamalia (Mariana, 1995).

2.2.3 Farmakokinetika

Pada pemberian oral preparat kombinasi dengan dosis tunggal,

trimetoprim diabsorpsi lebih cepat daripada sulfametoksazol. Trimetoprim cepat

didistribusikan ke dalam jaringan dan relatif sedikit terikat pada protein plasma

dengan adanya sulfametoksazol. Obat masuk ke dalam otak dan saliva dengan

Universitas Sumatera Utara

mudah. Pemberian 400 mg sulfametoksazol dengan 80 mg trimetoprim tiga kali

sehari, kadar steady state minimal di dalam darah dari masing-masing obat kira-

kira 20 dan 1 μg/ml, yakni perbandingan optimal yang dicari (Mariana, 1995).

2.2.4 Efek samping

Biasanya berupa gangguan kulit dan gangguan lambung-usus,

stomatitis. Pada dosis tinggi efek sampingnya juga berupa demam dan gangguan

fungsi hati dan efek-efek darah (neutropenia, trombositopenia). Oleh karena itu,

penggunaan lebih dari dua minggu hendaknya disertai dengan pengawasan darah

(Tjay dan Rahardja, 2002).

2.2.5 Dosis

Dosis dewasa untuk sebagian besar penyakit infeksi adalah 2 tablet setiap

12 jam selama 10 sampai 14 hari. Pada tifus dan infeksi parah diberikan 3 tablet

setiap 12 jam selama maksimum 14 hari. Pemberian pada anak-anak di bawah 12

tahun tidak dianjurkan (Mariana, 1995).

2.3 Teori Kromatografi

Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan berdasarkan partisi

cuplikan antara fase gerak dan fase diam. Fase gerak (mobile phase) dapat berupa

gas atau cairan dan fase diam (stationery phase) dapat berupa cairan atau padatan.

Kromatografi dapat juga didefinisikan sebagai suatu proses migrasi diferensial

dimana komponen-komponen cuplikan ditahan secara selektif oleh fase diam

(Sastrohamidjojo, 1985).

Kromatografi pertama kali dikembangkan oleh seorang ahli botani Rusia

Michael Tswett pada tahun 1903 untuk memisahkan pigmen berwarna dalam

Universitas Sumatera Utara

tanaman dengan cara perkolasi ekstrak petroleum eter dalam kolom gelas yang

berisi kalsium karbonat (CaCO 3 ). (Johnson dan Stevenson, 1991).

2.3.1 Pembagian Kromatografi

Kromatografi dapat dibedakan atas berbagai macam, tergantung pada

pengelompokannya. Berdasarkan pada mekanisme pemisahannya, kromatografi

dibedakan menjadi : (a) kromatografi adsorbsi; (b) kromatografi partisi; (c)

kromatografi pasangan ion; (d) kromatografi penukar ion (e) kromatografi

eksklusi ukuran dan (f) kromatografi afinitas (Johnson dan Stevenson, 1991 dan

Rohman, 2007).

Berdasarkan pada alat yang digunakan, kromatografi dapat dibagi atas: (a)

kromatografi kertas; (b) kromatografi lapis tipis, yang kedua sering disebut

kromatografi planar; (c) kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dan (d)

kromatografi gas (KG) (Johnson dan Stevenson, 1991 dan Rohman, 2007).

2.3.2 Migrasi dan Retensi Solut

Kecepatan migrasi solut melalui fase diam ditentukan oleh perbandingan

distribusinya (D) dan besarnya D ditentukan oleh afinitas relatif solut pada kedua

fase (fase diam dan fase bergerak). Dalam konteks kromatorgafi, nilai D

didefinisikan sebagai perbandingan konsentrasi solut dalam fase diam (Cs) dan

dalam fase gerak (Cm).

Cs
D=
Cm

Jadi semakin besar nilai D maka migrasi solut semakin lambat; dan semakin kecil

nilai D migrasi solut semakin cepat. Solut akan terelusi menurut perbandingan

distribusinya. Jika perbedaan perbandingan distribusi solut cukup besar maka

campuran-campuran solut akan mudah dan cepat dipisahkan (Rohman, 2007).

Universitas Sumatera Utara

2.3.3 Pemisahan pada kolom

Kolom merupakan bagian terpenting dari keseluruhan peralatan

kromatografi karena proses pemisahan campuran komponen terjadi di dalamnya.

Kemampuan kolom untuk memisahkan suatu campuran komponen disebabkan

karena fase diam yang terdapat di dalamnya dapat mengadakan interaksi dengan

berbagai komponen dengan kekuatan yang cukup berbeda satu sama lain sehingga

masing-masing komponen akan keluar dari kolom dengan waktu retensi yang

berbeda juga.

Ukuran interaksi suatu senyawa dengan fase diam dinyatakan sebagai

faktor kapasitas (k’) yang dinyatakan dengan persamaan :

t r − to
k’ =
to

dimana t r adalah waktu retensi komponen yang ditahan oleh kolom dan t o adalah

waktu retensi komponen yang tidak ditahan oleh kolom (Lily Wati, 1997).

Faktor kapasitas yang relatif besar menunjukkan adanya interaksi yang

relatif kuat antara komponen dengan fase diam sehingga komponen tertahan kuat

di dalam kolom dan sebaliknya faktor kapasitas yang relatif kecil menunjukkan

interaksi yang relatif lemah atau komponen hanya sedikit tertahan di dalam

kolom.

Suatu kolom dikatakan selektif apabila kolom tersebut mempunyai

kemampuan menahan berbagai komponen dengan kekuatan yang cukup berbeda

sehingga faktor kapasitas dari masing-masing komponen juga berbeda. Suatu

campuran komponen dapat dipisahkan dengan sempurna di dalam kolom yang

mempunyai selektivitas yang cukup tinggi.

Universitas Sumatera Utara

 Faktor selektivitas (α) didefinisikan sebagai ukuran pemisahan dua

komponen yang dapat dinyatakan dengan persamaan :

k ' 2 t ' 2 t2 − tm
α= = =
k '1 t '1 t1 − t m

dimana k’ 1 = faktor kapasitas komponen 1; k’ 2 = faktor kapasitas komponen 2; t’ 1

= waktu retensi yang disesuaikan untuk komponen 1; t’ 2 = waktu retensi yang

disesuaikan untuk komponen 2; t 1 = waktu retensi komponen 1; t 2 = waktu retensi

komponen 2 dan t m = waktu retensi komponen yang tidak ditahan (garis depan

pelarut).

Faktor selektivitas (α) sebaiknya mempunyai harga lebih dari satu karena

pada harga α = 1 berarti k’ 1 = k’ 2 sehingga komponen 1 dan komponen 2 tidak

terpisahkan. Harga α hanya menunjukkan adanya pemisahan pada bagian atas

puncak kromatogram tanpa memperhitungkan kemungkinan terjadinya tumpang

tindih pada bagian bawah puncak. Untuk suatu harga α yang sama terdapat dua

kemungkinan yang berbeda jika dilihat dari puncak dimana pemisahan sempurna

jika dihasilkan puncak-puncak komponen yang relatif sempit dan sebaliknya jika

puncak-puncak komponen yang dihasilkan lebar maka kemungkinan akan terjadi

tumpang tindih sehingga pemisahan tidak sempurna (Lily Wati, 1997).

Lebar atau sempitnya puncak suatu komponen ditentukan oleh efisiensi

kolom yang digunakan yang merupakan ukuran kemampuan kolom untuk

mencegah atau mengurangi terjadinya pergantian puncak. Suatu kolom yang

efisien akan dapat menghasilkan puncak-puncak komponen yang relatif sempit

sehingga jumlah komponen yang dapat dipisahkan relatif banyak. Efesiensi suatu

kolom akan semakin tinggi jika jumlah pelat teori (N) yang dikandung semakin

banyak.

Universitas Sumatera Utara

 Efisiensi dinyatakan secara kuantitatif sebagai jumlah pelat teori (N) yang

dinyatakan dengan persamaan :

2
2  t 
2
 tr   tr 
N =   = 16  = 5,5 r 
σ  W   W 
 12 

Dimana σ = simpangan baku puncak, t r = jarak antara titik nol dengan titik potong

kedua garis singgung pada kedua sisi puncak komponen (waktu retensi), W =

lebar puncak pada alasnya yang ditentukan dengan memperpanjang garis

singgung puncak sampai memotong garis alas dan W 1/2 = lebar puncak pada

setengah tinggi.

Jumlah pelat teori berbanding lurus dengan panjang kolom, di mana

umumnya kolom yang lebih panjang mempunyai jumlah pelat yang lebih banyak,

tetapi penurunan tekanannya juga lebih besar. Karena panjang kolom bermacam-

macam, maka diperlukan ukuran keefisienan kolom yang tidak tergantung pada

panjang kolom. Tinggi atau jarak yang setara dengan dengan pelat teori, H atau

HETP (Height Equivalent to a Theoritical Plate), merupakan ukuran keefisienan

kolom yang lebih disukai karena memungkinkan perbandingan antara kolom yang

panjangnya berlainan dimana kolom yang mempunyai H yang kecil lebih baik. H

berkaitan dengan jumlah pelat teori dengan persamaan berikut :

L
H = HETP =
N

dimana L adalah panjang kolom (mm) dan N adalah jumlah pelat teori .

Ketiga parameter di atas mempunyai keterkaitan yang dapat

menggambarkan keberhasilan suatu pemisahan berupa ketergantungan resolusi

(R s ) yang dinyatakan dengan persamaan :

Universitas Sumatera Utara

 1  k '  α − 1 
Rs =    Ν
4  1 + k '  α 

(a) (b) (c)

dimana a = faktor kapasitas, b = faktor selektivitas, c = faktor efisiensi (Lily Wati,

1997).

Jika resolusi atau daya pisah 0,4 atau lebih kecil maka puncak tidak

menunjukkan secara jelas adanya 2 komponen atau lebih dan sebaliknya jika daya

pisah 0,5 atau lebih maka jumlah komponen yang ada dapat diidentifikasikan

dengan jelas. Tetapi umumnya untuk pekerjaan kualitatif atau kuantitatif yang

baik diperlukan daya pisah 1,5 atau lebih besar (Johnson dan Stevenson, 1991).

Dari persamaan di atas nampak jelas bahwa faktor-faktor yang

menentukan resolusi yaitu : selektivitas (α), jumlah lempeng (N), dan faktor

kapasitas (k’). Selektivitas dapat diubah dengan mengubah susunan fase diam dan

fase gerak. Menaikkan selektivitas akan menghasilkan salah satu puncak relatif

terhadap lainnya. Efisiensi suatu pemisahan ditunjukkan dengan faktor N yang

akan berubah dengan mengubah panjang kolom (L) atau kecepatan alir fase gerak.

Menaikkan faktor N suatu kolom akan menyebabkan penyempitan dua puncak

sehingga W menjadi kecil dan resolusinya menjadi lebih besar. Faktor k’ berubah

dengan mengubah kekuatan fase gerak. Misalkan, suatu pemisahan awal

memberikan harga k’ pada daerah 0,5-2. Penurunan nilai k’ akan menghasilkan

pemisahan yang jelas dan waktu retensi yang pendek, sementara itu kenaikan k’

akan memberikan resolusi yang lebih baik. Meskipun demikian, jika nilai k’ ini

dinaikkan maka akan menyebabkan tinggi puncak kromatogram akan turun dan

waktu pemisahan menjadi naik (Rohman, 2007).

Universitas Sumatera Utara

2.3.4 Profil Puncak dan Pelebaran Puncak

Selama pemisahan kromatografi, solut individual akan membentuk profil

konsentrasi yang simetris atau dikenal juga dengan profil Gaussian dalam arah

aliran fase gerak. Profil, dikenal juga dengan puncak atau pita, secara perlahan-

lahan akan melebar dan sering juga membentuk profil yang asimetrik karena

solut-solut melanjutkan migrasinya ke fase diam.

Adanya puncak, yang asimetris dapat disebabkan oleh hal –hal berikut:

• Ukuran sampel yang dianalisis terlalu besar. Jika sampel terlalu besar maka

fase gerak tidak mampu membawa solut dengan sempurna karenanya terjadi

pengekoran atau tailing.

• Interaksi yang kuat antara solut dengan fase diam dapat menyebabkan solut

sukar terelusi sehingga dapat menyebabkan terbentuknya puncak yang

mengekor.

• Adanya kontaminan dalam sampel yang dapat muncul terlebih dahulu

sehingga menimbulkan puncak mendahului (fronting) (Rohman, 2007).

Gambar 2. Profil-profil puncak

2.3.5 Analisa Kualitatif dan Kuantitatif

Analisis Kualitatif

Ada 3 pendekatan untuk analisa kualitatif yakni:

1. Perbandingan antara retensi solut yang tidak diketahui dengan data retensi

baku pembanding pada kondisi yang sama.

Universitas Sumatera Utara

 Untuk kromatografi yang menggunakan kolom (seperti KCKT dan KG),

waktu retensi (t R ) atau volume retensi (V R ) senyawa baku dan senyawa yang

tidak diketahui dibandingkan dengan cara kromatografi secara berurutan

dalam kondisi alat yang stabil dengan perbedaan waktu pengoperasian antara

keduanya sekecil mungkin.

2. Dengan cara spiking.

Untuk kromatografi yang melibatkan kolom, spiking dilakukan dengan

menambah sampel yang mengandung senyawa tertentu yang akan diselidiki

dengan senyawa baku pada kondisi kromatografi yang sama. Hal ini dilakukan

dengan cara: pertama, dilakukan proses kromatografi sampel yang tidak di-

spiking. Kedua, sampel yang telah di-spiking dengan senyawa baku dilakukan

proses kromatografi. Jika pada puncak tertentu yang diduga mengandung

senyawa yang diselidiki terjadi peningkatan tinggi puncak/luas puncak setelah

di-spiking dibandingkan dengan tinggi puncak/luas puncak yang tidak

dilakukan spiking maka dapat diidentifikasi bahwa sampel mengandung

senyawa yang kita selidiki.

3. Menggabungkan alat kromatografi dengan spektrometer massa.

Pada pemisahan dengan menggunakan kolom kromatografi, cara ini akan

memberikan informasi data spektra massa solut dengan waktu retensi tertentu.

Spektra solut yang tidak diketahui dapat dibandingkan dengan spektra yang

ada di data base komputer yang diinterpretasi sendiri. Cara ini dapat dilakukan

untuk solut yang belum ada baku murninya.

Universitas Sumatera Utara

Analisis Kuantitatif

Untuk menjamin kondisi yang digunakan dalam analisis kuantitatif stabil

dan reprodusibel, baik pada penyiapan sampel atau proses kromatografi, berikut

beberapa syarat yang harus dipenuhi dalam analisis kuantitatif:

• Analit (solut) harus telah diketahui dan terpisah sempurna dari kompomen-

komponen lain dalam kromatogram.

• Baku dengan kemurnian yang tinggi dan telah diketahui harus tersedia.

• Prosedur kalibrasi yang sudah diketahui harus digunakan.

Untuk kromatografi yang melibatkan kolom, kuantifikasi dapat dilakukan

dengan: luas puncak atau tinggi puncak. Tinggi puncak atau luas puncak

berbanding langsung dengan banyaknya solut yang dikromatografi, jika dilakukan

pada kisaran detektor yang linier.

1. Metode tinggi puncak

Metode yang paling sederhana untuk pengukuran kuantitatif adalah

dengan tinggi puncak. Tinggi puncak diukur sebagai jarak dari garis dasar ke

puncak maksimum seperti puncak 1, 2, dan 3 pada gambar 3. Penyimpangan garis

dasar diimbangi dengan interpolasi garis dasar antara awal dan akhir puncak.

Gambar 3. Pengukuran tinggi puncak

Metode tinggi puncak hanya digunakan jika perubahan tinggi puncak

linier dengan konsentrasi analit. Kesalahan akan terjadi jika metode ini digunakan

Universitas Sumatera Utara

pada puncak yang mengalami penyimpangan (asimetris) atau jika kolom

mengalami kelebihan muatan.

2. Metode luas puncak

Prosedur penentuan luas puncak serupa dengan tinggi puncak. Suatu

teknik untuk mengukur luas puncak adalah dengan mengukur luas puncak sebagai

hasil kali tinggi puncak dan lebar pada setengah tinggi (W1/2 ). Tehnik ini hanya

dapat digunakan untuk kromatografi yang simetris atau yang mempunyai bentuk

serupa.

Saat ini integrator elektronik telah banyak digunakan untuk mengukur luas

puncak pada kromatografi cair kinerja tinggi dan pada kromatografi gas.

Integrator digital mengukur luas puncak dan mengubahnya dalam bentuk angka

(Johnson Stevenson, 1991 dan Rohman, 2007).

Baik tinggi puncak maupun luasnya dapat dihubungkan dengan

konsentrasi. Tinggi puncak mudah diukur, akan tetapi sangat dipengaruhi

perubahan waktu retensi yang disebabkan oleh variasi suhu dan komposisi

pelarut. Oleh karena itu, luas puncak dianggap merupakan parameter yang lebih

akurat untuk pengukuran kuantitatif (Ditjen POM, 1995).

Metode Kuantifikasi

1. Metode baku eksternal

Metode yang paling umum untuk menetapkan konsentrasi senyawa yang

tidak diketahui konsentrasinya dalam suatu sampel adalah dengan menggunakan

plot kalibrasi menggunakan baku eksternal.

Universitas Sumatera Utara

2. Metode baku internal

Baku internal merupakan senyawa yang berbeda dengan analit, meskipun

demikian senyawa ini harus terpisah dengan baik selama proses pemisahan.

Seringkali perlakuan sampel memerlukan tahapan-tahapan yang meliputi

derivatisasi, ekstraksi, filtrasi, dan sebagainya yang dapat mengakibatkan

berkurangnya sampel. Jika baku internal ditambahkan pada sampel sebelum

dilakukan preparasi sampel, maka baku internal dapat mengoreksi hilangnya

sampel-sampel ini.

Syarat-syarat suatu senyawa dapat digunakan sebagai baku internal adalah:

terpisah dengan baik dari senyawa yang dituju atau puncak-puncak lain;

mempunyai waktu retensi yang hampir sama dengan analit; tidak terdapat dalam

sampel; mempunyai kemiripan sifat-sifat dengan analit dalam tahapan-tahapan

penyiapan sampel; tidak mempunyai kemiripan secara kimiawi dengan analit;

tersedia dalam perdagangan dengan kemurnian tinggi; stabil dan tidak reaktif

dengan sampel atau dengan fase gerak; mempunyai respon detektor yang hampir

sama dengan analit pada konsentrasi yang digunakan (Johnson Stevenson, 1991

dan Rohman, 2007).

2.4 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Kromatogarfi cair kinerja tinggi (KCKT) merupakan sistem pemisahan

dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi karena didukung oleh kemajuan dalam

teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan detektor yang sangat sensitif

dan beragam sehingga mampu menganalisa berbagai cuplikan secara kualitatif

maupun kuantitatif, baik dalam komponen tunggal maupun campuran (Ditjen

POM, 1995).

Universitas Sumatera Utara

 Kegunaan umum KCKT adalah untuk: pemisahan sejumlah senyawa

organik, anorganik, maupun senyawa biologis, analisis ketidakmurnian

(impurities) dan analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap (non-

volatil). KCKT paling sering digunakan untuk: untuk menetapkan kadar senyawa-

senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat dan protein-

protein dalam cairan fisiologis, menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat

dan lain - lain.

2.4.1 Jenis-jenis Kromatografi

Menurut Johnson dan Stevenson (1991) dan Rohman (2007) jenis-jenis

kromatografi yaitu:

1. Kromatografi Cair-Padat (LSC)

Tehnik ini biasanya menggunakan fase diam silika gel atau alumina, meskipun

demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika gel sebagai fase diamnya.

Fase geraknya berupa pelarut non polar yang ditambah dengan pelarut polar

seperti air atau alkohol rantai pendek untuk meningkatkan kemampuan elusinya

sehingga tidak timbul pengekoran puncak, seperti n-heksana ditambah metanol.

Jenis KCKT ini sesuai untuk pemisahan-pemisahan campuran isomer struktur dan

untuk pemisahan solut dengan gugus fungsional yang berbeda.

2. Kromatografi Partisi (LLC)

Kromatografi jenis ini disebut juga dengan kromatografi fase terikat.

Kebanyakan fase diamnya adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau

fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah

hidrokarbon-hidrokarbon non polar seperti oktadesilsilana, oktilsilana, atau

dengan fenil.

Universitas Sumatera Utara

 Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilana (ODS atau

C 18 ) dan kebanyakan pemisahannya adalah dengan fase terbalik. Sedangkan fase

geraknya adalah campuran asetonitril atau metanol dengan air atau dengan larutan

buffer.

Kromatografi partisi (LLC), disebut “fase normal” bila fase diam lebih polar

dari fase gerak dan “fase terbalik” bila fase gerak lebih polar dari fase diam.

a. Kromatografi fase normal

Kromatografi fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak),

kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Fase

gerak ini biasanya tidak polar. Dietil eter, benzen, hidrokarbon lurus seperti

pentana, heksana, heptana maupun iso-oktana sering digunakan. Halida

alifatis seperti diklorometana, dikloroetana, butilklorida dan kloroform juga

digunakan. Umumnya gas terlarut tidak menimbulkan masalah pada fase

normal. (Munson, 1991 dan Rohman, 2007)

Fase diam yang digunakan dapat dilihat pada gambar dibawah ini:

Gambar 11. Jenis-jenis fase diam untuk tipe kromatografi fase normal

b. Kromatografi fase terbalik

Kromatografi fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak),

kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.

Universitas Sumatera Utara

 Kandungan utama fase gerak fase terbalik adalah air. Pelarut yang dapat

campur dengan air seperti metanol, etanol, asetonitril, dioksan, tetrahidrofuran

dan dimetilformamida ditambahkan untuk mengatur kepolaran fase gerak.

Dapat ditambahkan pula asam, basa, dapar dan/atau surfaktan. Mutu air harus

tinggi baik air destilasi maupun awamineral.

Fase diam yang digunakan dapat dilihat pada gambar dibawah ini :

Gambar 12. Jenis-jenis fase diam untuk tipe kromatografi fase terbalik

3. Kromatografi penukar ion

Tehnik ini tergantung pada penukaran (adsorpsi) ion-ion diantara fase gerak

dan tempat-tempat berion dari kemasan. Kebanyakan resin-resin berasal dari

polimer stiren divinilbenzen dimana gugus-gugus fungsinya telah ditambah.

Resin-resin tipe asam sulfonat dan amin kuarterner merupakan jenis resin

pilihan paling baik dan banyak digunakan. Keduanya, fase terikat dan resin

telah digunakan. Tehnik ini dipakai secara luas dalam life sciences dan dikenal

secara khas untuk pemisahan asam-asam amino. Tehnik ini dapat dipakai

untuk keduanya, kation-kation dan anion-anion.

4. Kromatografi eksklusi (EC)

Tehnik ini unik karena dalam pemisahan didasarkan pada ukuran molekul dari

solut. Kemasan adalah suatu gel dengan suatu permukaan berlubang-lubang

Universitas Sumatera Utara

 sangat kecil yang inert. Molekul-molekul kecil dapat masuk ke dalam jaringan

dan ditahan dalam fase gerak yang menggenang. Molekul-molekul yang lebih

besar tidak dapat masuk ke dalam jaringan dan lewat melalui kolom tanpa

ditahan.

5. Kromatografi Pasangan Ion (IPC)

Kromatografi ini merupakan bentuk khusus dari kromatografi cair-cair yang

digunakan untuk pemisahan senyawa atau cuplikan yang mengandung

komponen ion dan non ion, seperti garam ammonium kuarterner, sulfonat,

asam amino dan aminofenol. Kromatografi pasangan ion dilakukan dengan

kondisi yang serupa dengan kondisi pada kromatografi fase balik yaitu dengan

sistem pelarut campuran air dengan metanol atau asetonitril dan kolom seperti

oktadesilsilana yang terikat pada silika.

2.4.2 Komponen Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

detektor

kolom
injektor
pompa oven

data
Wadah processor
solven

Gambar 5. Bagan alat KCKT

2.4.2.1 Wadah Fase gerak

Wadah fase gerak terbuat dari bahan yang inert terhadap fase gerak. Bahan

yang umum digunakan adalah gelas dan baja anti karat. Daya tampung tandon

harus lebih besar dari 500 ml, yang dapat digunakan selama 4 jam untuk

kecepatan alir yang umumnya 1-2 ml/menit.

Universitas Sumatera Utara

2.4.2.2 Pompa

Untuk menggerakkan fase gerak melalui kolom diperlukan pompa. Pompa

harus mampu menghasilkan tekanan 6000 Psi pada kecepatan alir 0,1 – 10

ml/menit. Pompa ada 2 jenis yaitu pompa volume konstan dan pompa tekanan

konstan. Pompa terbuat dari bahan yang inert terhadap semua pelarut. Bahan yang

umum digunakan adalah gelas baja antikarat dan teflon. Aliran pelarut dari pompa

harus tanpa denyut untuk menghindari hasil yang menyimpang pada detektor.

2.4.2.3 Injektor

Cuplikan harus dimasukkan ke dalam pangkal kolom (kepala kolom),

diusahakan agar sesedikit mungkin terjadi gangguan pada kemasan kolom.

Ada tiga jenis dasar injektor, yaitu:

a. Hentikan aliran/stop flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada

kinerja atmosfer, sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Tehnik ini

bisa digunakan karena difusi di dalam aliran kecil dan resolusi tidak

dipengaruhi.

b. Septum: Injektor-injektor langsung ke aliran fase gerak umumnya sama

dengan yang digunakan pada kromatografi gas. Injektor ini dapat

digunakan pada kinerja sampai 60-70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak

tahan dengan semua pelarut-pelarut kromatografi cair. Disamping itu,

partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat

menyebabkan penyumbatan.

c. Katup putaran (loop valve): ditunjukkan secara skematik dalam Gambar 6,

tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih

besar dari pada 10 µl dan sekarang digunakan dengan cara automatis

Universitas Sumatera Utara

 (dengan adaptor khusus, volume-volume lebih kecil dapat diinjeksikan

secara manual). Pada posisi LOAD, sampel loop (cuplikan dalam putaran)

diisi pada tekanan atmosfer. Bila katup difungsikan, maka cuplikan di

dalam putaran akan bergerak ke dalam kolom.

Gambar 6. Tipe injektor katup putaran

2.4.2.4 Kolom

Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu analisis

tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Kolom

dapat dibagi menjadi dua kelompok:

• Kolom analitik: diameter khas adalah 2-6 mm. Panjang kolom tergantung

pada jenis kemasan. Untuk kemasan pelikular, panjang yang lumrah

adalah 50-100 cm. Untuk kemasan poros mikropartikulat, umumnya 10-30

cm. Dewasa ini ada yang 5 cm

• Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan

panjang kolom 25 -100 cm.

Kolom umumnya dibuat dari stainless steel dan biasanya dioperasikan pada

temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi, terutama

untuk kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi. Kemasan kolom

tergantung pada mode kromatografi cair kinerja tinggi yang digunakan.

Universitas Sumatera Utara

2.4.2.5 Detektor

Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen cuplikan

dalam aliran yang keluar dari kolom. Detektor-detektor yang baik memiliki

sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah, kisar respons linier yang

luas, dan memberi tanggapan/respon untuk semua tipe senyawa.

Detektor yang paling banyak digunakan dalam kromatografi cair modern

kecepatan tinggi adalah detektor spektrofotometer UV 254 nm. Bermacam-

macam detektor dengan variasi panjang gelombang UV-Vis sekarang menjadi

populer karena mereka dapat digunakan untuk mendeteksi senyawa-senyawa

dalam rentang yang luas. Detektor indeks refraksi juga secara luas digunakan,

terutama dalam kromatografi eksklusi, tetapi umumnya kurang sensitif dari pada

detektor spektrofotometer UV. Detektor lainnya, antara lain: detektor fluorometer,

detektor ionisasi nyala, detektor elektrokimia dan lain-lain juga telah digunakan.

2.4.2.7 Fase Gerak

Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat

bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya

elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase

diam, dan sifat komponen-komponen sampel (Johnson dan Stevenson, 1991;

Munson, 1991 dan Rohman, 2007).

Dalam kromatografi cair komposisi pelarut atau fase gerak adalah satu

variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat keragaman yang luas dari

solven yang digunakan dalam semua mode kromatografi cair kinerja tinggi, tetapi

ada beberapa sifat-sifat yang diinginkan yang mana umumnya harus dipenuhi oleh

semua solven.

Universitas Sumatera Utara

 Fase gerak yang digunakan dalm KCKT harus murni, tidak ada

pencemar/kontaminan; tidak bereaksi dengan pengemas; sesuai dengan detektor;

melarutkan cuplikan; mempunyai viskositas rendah; mudah rekoveri cuplikan,

bila diinginkan; tersedia diperdagangan dengan harga yang pantas.

Umumnya, pelarut-pelarut dibuang setelah digunakan karena prosedur

pemurnian kembali membosankan dan mahal. Dari semua persyaratan di atas, 4

persyaratan pertama adalah yang paling penting.

Gelembung udara (degassing) yang ada harus dihilangkan dari pelarut,

karena udara yang terlarut keluar melewati detektor dapat menghasilkan banyak

noise sehingga data tidak dapat digunakan (Johnson dan Stevenson, 1991 dan

Rohman, 2007).

2.5 Uji Validasi

Validasi metode dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis akurat,

spesifik, reprodusibel, dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis. Suatu

metode analisis harus divalidasi untuk melakukan verifikasi bahwa parameter-

parameter kinerjanya cukup mampu untuk mengatasi problem analisis.

Parameter-parameter uji validasi antara lain :

a. Akurasi (kecermatan)

Merupakan ketelitian metode analisis atau kedekatan antara nilai terukur

dengan nilai yang diterima baik nilai konvensi, nilai sebenarnya, atau nilai

rujukan. Akurasi diukur sebagai banyaknya analit yang diperoleh kembali

pada suatu pengukuran dengan melakukan spiking pada suatu sampel.

Untuk pengujian senyawa obat, akurasi diperoleh dengan membandingkan

hasil pengukuran dengan bahan rujukan standar.

Universitas Sumatera Utara

 b. Presisi (keseksamaan)

Merupakan ukuran keterulangan metode analisis dan biasanya dinyatakan

sebagai simpangan baku relatif dari sejumlah sampel yang berbeda

signifikan secara statistik.

c. Batas deteksi (Limit of detection, LOD)

Merupakan konsentrasi analit terkecil dalam sampel yang masih dapat

dideteksi, meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi.

d. Batas kuantitasi (Limit of Quantitation, LOQ)

Merupakan konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat

ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi

operasional metode yang digunakan (Rohman, 2007).

2.6 Uraian Bentuk Sediaan Tablet

Tablet merupakan sediaan padat kompak, dibuat secara kempa cetak,

dalam bentuk tabung pipih atau sirkuler, kedua permukaannya rata atau cembung,

mengandung satu jenis obat atau lebih dengan atau zat tambahan (Depkes RI,

1979).

ediaan tablet mempunyai keuntungan dibandingkan dengan bentuk

sediaan lainnya karena memberikan dosis yang tepat pada pemakaiannya, mudah

pemakaian, cara pembuatannya sederhana, mudah pengemasan dan distribusinya.

Pada pembuatan tablet biasanya diperlukan bahan-bahan lain sebagai

bahan tambahan, seperti bahan pengisi, bahan pengikat, bahan pelicin, dan bahan

pengembang (Hoover et al, 1985).

Universitas Sumatera Utara

 Tablet dibuat dengan cara pengempaan campuran serbuk atau granul,

semakin kuat tekanan pengempaan maka tablet akan menjadi lebih kompak

karena permukaan partikel lebih rendah (Ansel, 1989).

2.7 Bahan tambahan dalam sediaan tablet

Komposisi umum dari tablet adalah zat berkhasiat, bahan pengisi, bahan

pengikat dan bahan pelicin. Kadang-kadang dapat ditambahkan pewangi

(flavoring agent), bahan pewarna (coloring agent), bahan pemanis dan bahan

tambahan lain yang cocok (Ansel, 1989).

2.7.2 Bahan pengisi

Bahan pengisi diperlukan bila dosis obat tidak cukup untuk membuat

sediaan. Pada bahan obat yang berdosis cukup tinggi, bahan pengisi tidak

diperlukan (misalnya aspirin, antibiotik tertentu). Bahan pengisi dapat juga

ditambah karena alasan kedua yaitu untuk memperbaiki daya kohesi sehingga

dapat dikempa langsung atau untuk memacu aliran. Bahan pengisi yang umumnya

digunakan adalah laktosa, sukrosa, mannitol, sorbitol, golongan amilum dan

avicel (Soekemi, dkk, 1987).

2.7.2 Bahan pengikat

Gunanya adalah untuk mengikat komponen-komponen tablet untuk

dijadikan granul dengan ukuran yang sama dan bentuk yang spheris setelah

dipaksakan melewati ayakan. Dengan adanya bahan pengikat, komponen tablet

akan mudah dibentuk menjadi granul, sehingga akan memudahkan pencetakan.

Bahan-bahan yang sering digunakan sebagai bahan pengikat yaitu amilum,

gelatin, akasia, Na alginat, sukrosa dan golongannya, CMC, Veegum dan lain-lain

(Soekemi, dkk, 1987).

Universitas Sumatera Utara

2.7.3 Bahan pengembang

Ditambahkan untuk memecahkan tablet menjadi partikel-partikel kecil

sehingga luas permukaan diperbesar dan absorpsi dipermudah. Bahan-bahan yang

biasa digunakan sebagai pengembang yaitu amilum, gom, derivat sellulosa,

alginat, dan lain-lain.

2.7.4 Bahan pelicin

Ditambahkan dengan maksud meningkatkan daya alir granul-granul pada

corong pengisi, mencegah melekatnya massa pada punch dan die, mengurangi

pergesekan antara butir-butir granul, mempermudah pengeluaran tablet dari die.

Bahan pelicin yang umumnya digunakan adalah talkum dan metalik stearat seperti

Mg atau Ca stearat (Soekemi, dkk, 1987).

Universitas Sumatera Utara