Aula Prática 03:

ESTERILIZAÇÃO E DESINFECÇÃO. TÉCNICAS DE ESTERILIZAÇÃO PELO

CALOR SECO, ÚMIDO E FILTRAÇÃO.

1. Introdução
Os microorganismos estão amplamente distribuídos em nosso ambiente, presente no
ar, no solo, nas águas nas superfícies externas e internas do organismo humano, dos animais
e vegetais; assim sendo, o estudo sistemático de um microorganismo isolado, técnicas
médicas (como cirurgia asséptica), e preparação e preservação de alimentos, e muitas outras
situações requerem métodos que permitam a destruição ou a remoção dos microorganismos
indesejáveis.

2. Controle de microrganismos
Os germes podem ser removidos, inibidos ou mortos por agentes físicos ou químicos
através de uma grande variedade de técnicas cada uma com seu mecanismo de ação e tendo
seu limite próprio de aplicação prática. Entretanto, antes de discutir tais processos, convém
compreender alguns termos empregados para conceituar os agentes físicos e químicos
destinados ao controle dos microorganismos.
• Esterilização: é o processo de destruição de todas as formas de vida microscópica. Os
termos estéril, esterilização e esterilizar referem-se à destruição de todos os
microorganismos
• Desinfecção: é o processo de destruição dos agentes infecciosos, através de um
desinfetante definido como um agente, geralmente químico, que mata as formas
vegetativas, mas não as formas esporuladas de microorganismos patogênicos. O termo
é comumente utilizado para as substâncias aplicadas em objetos inanimados.
• Anti-séptico: é uma substância que se opõe à “sépsis” ou previne o crescimento ou
ação de microorganismos pela destruição dos mesmos ou pela inibição de seu
crescimento ou atividade. Usualmente está associado a substâncias aplicadas ao corpo
do homem, isto é, tecidos vivos, por exemplo: anti-sepssia da pele e feridas com álcool
70%.
• Degermação: é a redução do número de microorganismos da pele pelo uso de sabão
e escovação ou aplicação de sabão ou solução contento anti-séptico.
• Saneador: é um agente que reduz a população microbiana até níveis aceitáveis, de
acordo com as exigências da saúde pública. Normalmente é um agente químico que
mata 99,9% das formas vegetativas das bactérias. Os saneadores são comumente
aplicados a objetos inanimados e são geralmente, empregados no tratamento diário de
equipamentos e utensílios de leiteiras, assim como de copos, pratos e talheres em
restaurantes.
• Germicida (microbicida): é uma agente que mata as formas vegetativas, mas não
necessariamente, as formas esporuladas. Na prática, um germicida é quase a mesma
coisa que um desinfetante, embora o termo germicida, seja ordinariamente usado para
todos os tipos de germes (ou micróbios) e para qualquer aplicação.
• Bactericida: é um agente que mata as bactérias. Os termos fungicida, viricida e
esporicida se referem aos agentes que matam respectivamente, fungos, vírus e
esporos.
• Bacteriostase: é uma condição na qual se previne o crescimento de bactérias
(adjetivo: bacteriostático). De maneira semelhante o fungistático descreve o agente que
inibe o desenvolvimento dos fungos. Aqueles agentes que têm, em comum, a
capacidade de inibir o crescimento de microorganismos, são designados, coletivamente
como agentes microbiostático.
• Agente antimicrobiano: é aquele que interfere com o crescimento, ou atividade dos
microorganismos. Na linguagem comum, o termo significa inibição do crescimento e, de
acordo com o tipo de germes sobre os quais agem, recebem a designação de
antibacterianos, antifúngicos. Alguns agentes antimicrobianos são usados no
tratamento de infecções, então são chamados de agentes terapêuticos.
 3. Esterilização e desinfecção em laboratório de microbiologia

3.1. Agentes físicos:

Os processos físicos são geralmente empregados para a esterilização de vidraria, materiais

em geral, meios de cultura e soluções. Os mais comuns são o calor seco, calor úmido e
filtração.
• Calor seco: Destrói os microorganismos por oxidação de seus constituintes químicos.
O forno de Pasteur é uma estufa elétrica equipada com termostato e ventilador para
promover o aquecimento rápido, controlado e uniforme da câmara. Os artigos nela
colocados são aquecidos por irradiação do calor, das paredes laterais e da base, cuja
distribuição deve ser a mais uniforme possível. Sendo o calor seco menos penetrante
do que o calor úmido, o processo requer temperaturas mais elevadas e tempo de
exposição mais prolongado, geralmente em torno de 140 e 180ºC durante 1 ou 2 horas.
Este é o processo indicado para esterilizar vidraria, instrumento de corte ou de ponta,
passíveis de serem oxidados pelo vapor, e materiais impermeáveis como ceras,
pomadas e óleos. OPERAÇÃO: Deve-se aquecer a estufa, com temperatura
devidamente ajustada, antes da colocação do material. Os materiais devem estar
limpos e muito bem protegidos. O tempo de esterilização deve ser contado a partir do
instante em que o termômetro voltar a acusar a temperatura escolhida após a
colocação dos artigos na câmara.
• Flambagem: Constitui um processo nos quais os instrumentos são expostos à chama
do bico de Bunsen, até se tornarem rubros. Geralmente é utilizada para a esterilização
de alças e agulhas de semeadura.
• Calor úmido: Representa o processo mais prático e seguro para fins de esterilização.
O calor sob forma de vapor d`água sob pressão proporciona temperaturas mais
elevadas que as obtidas por ebulição, assim os germes são destruídos pela coagulação
de suas proteínas. Este processo é empregado principalmente para a descontaminação
de materiais (para descarte ou reutilização) e esterilização de soluções, meios de
cultura, vidrarias em geral e outros materiais termorresistentes e que não sejam
afetados pela umidade. A AUTOCLAVE DE CHAMBERLAND é um recipiente cilíndrico
metálico horizontal ou vertical, com uma tampa pesada, preferencialmente de bronze, a
qual é parafusada ou apertada sob uma vedação de borracha. Compõe ainda o
equipamento um manômero e uma válvula de segurança onde se pode fazer o ajuste
de pressão. A água, de preferência destilada, é aquecida dentro do cilindro pelo
emprego de resistências elétricas de imersão. O nível da água de dentro do cilindro
deve ser examinado a cada operação e deve sempre estar acima das resistências. O
cilindro da autoclave é provido de uma saída lateral com válvulas, que serve para
esgotar a água, quando necessário efetuar eventuais limpezas. O material dentro da
autoclave que se destina à esterilização é acondicionado em cestas metálicas
perfuradas (para permitir a passagem do vapor). OPERAÇÃO: ligar o aparelho na rede
elétrica. Após a colocação do material dentro da autoclave, a tampa é fechada e a
torneira de remoção de ar ou vapor é deixada aberta para remover todo o ar. Quando
todo o ar for removido deixe que um fluxo de vapor fluente persista por cerca de 5
minutos, antes de fechar a torneira. A partir de então, a pressão interna irá aumentar e
chegar à pressão de esterilização usada que é 1 atm, correspondendo a temperatura
de 121ºC. Quando a temperatura requerida para a esterilização é alcançada, conta-se
o tempo (15 a 20 minutos) usando um relógio de laboratório (com alarme). Decorrido o
tempo, desliga-se o aparelho da corrente elétrica e mantêm-se a autoclave e a torneira
de ar e vapor fechada até o manômetro voltar ao ponto zero, pois quando a pressão da
autoclave é aliviada rapidamente, os líquidos dentro dos tubos e frascos fervem
violentamente, fazendo com que os tampões sejam arremessados para fora dos
mesmos.
 • Filtração: A esterilização também pode ser efetuada por meio de gases ou líquidos,
através de materiais capazes de reter microorganismos. Como exemplo de filtração de
gases, temos o tampão de algodão (“buchas, bonecos”) utilizado para fechar as bocas
dos tubos de ensaio e balões contendo meios de cultura. O algodão é suficientemente
poroso para permitir a entrada do ar, porém impede a penetração dos germes. Para a
esterilização de líquidos, existem filtros bacteriológicos fabricados com diferentes
materiais: (a) placa de asbesto (silicato de cálcio e magnésio/amianto), no filtro Seitz,
(b) terra de diatomáceas (sedimento amorfo, originado a partir de carapaças de
organismos unicelulares vegetais tais como algas microscópicas aquáticas) no filtro
Berkefeld, (c) porcelana, no filtro de Chamberland, (d) membranas de ésteres de
celulose, no filtro millipore e outros. O processo de filtração é empregado
principalmente para a esterilização de soluções que contenham substâncias
temolábeis. Para acomodar o filtro ou membrana filtrante geralmente utiliza-se um
suporte especialmente confeccionado para tal fim (aço inoxidável, plástico, vidro e
outros materiais), que por sua vez é adaptado a um recipiente para receber o filtrado. O
conjunto (equipo para filtração) é acondicionado em papel esterilizado. OPERAÇÃO:
Retirar o invólucro de papel que envolve o equipo de filtração e verter sobre o
compartimento onde se encontra o filtro, a solução a ser esterilizada. Para acelerar o
processo de filtração, aplica-se uma pressão negativa (bomba de vácuo) para grandes
volumes ou pressão positiva (seringa) para pequenos volumes.

Outros agentes físicos empregados na esterilização e desinfecção:

CALOR SECO: Incineração.
CALOR ÚMIDO: Pasteurização, água fervente ou vapor fluente (contínuo ou fracionado).
RADIAÇÕES: de feixe eletrônico (raios catódicos); ionizantes (raios gama e raios x); não
ionizantes (ultravioleta); acústica (vibrações sônicas e ultrassônicas).

Testes de esterilidade:
Mesmo utilizando-se de processos eficazes para a esterilização de diferentes materiais,
nem sempre as condições são ideais, podendo haver eventuais falhas de ordem técnica, tais
como temperatura, pressão e tempo inadequados, comprometendo o processo de
esterilização. Portanto, é de fundamental importância que sejam realizados testes de
esterilidade para verificar se os materiais foram efetivamente esterilizados. Podem ser
empregados no controle de esterilidade, indicadores químicos e biológicos que permitem
verificar se os artigos atingiram no interior da câmara ou dos pacotes uma temperatura
compatível com a esterilização.
- Testes químicos: Utilizam-se substâncias que apresentam-se alteradas quando
submetidas a determinadas temperaturas. Ex: fita adesiva e anidrido succínico.
- Testes biológicos: São utilizados suspensões de esporos de Bacillus
stearothermophilus para o calor úmido como autoclave de Chamberland e Bacillus
 subtilis para calor seco (forno de Pasteur) ou para autoclave à óxido de etileno, que
deverão ser destruídos pela exposição a cada um dos processos a que estão
relacionados.

3.2. Agentes químicos

O uso de agentes químicos no laboratório de microbiologia, restringe-se à desinfecção

da área de trabalho, em particular a bancada, onde devem ser aplicados antes e depois da
manipulação de microorganismos e à anti-sepsia das mãos. Este hábito auxilia muito no
controle de contaminação pela redução dos microorganismos e à anti-sepsia das mãos. Este
hábito auxilia muito no controle da contaminação pela redução dos microrganismos presentes
no ambiente e pela destruição de microrganismos que podem eventualmente interferir nos
resultados dos estudos. Nenhum agente químico antimicrobiano único é o melhor ou ideal
para qualquer ou todas as finalidades. Isto não surpreende, levando em consideração a
variedade de condições sob as quais os agentes podem ser utilizados, as diferenças de seus
mecanismos de ação e os muitos tipos de células microbianas que deverão ser destruídas. Na
escolha de um agente químico antimicrobiano, devem ser considerados alguns fatores tais
como:
(a) A natureza do material a ser tratado (pele, utensílios); (b) tipos de microrganismos
(esporos ou forma vegetativa); (c) condições ambientais (temperatura, pH, tempo de
exposição, concentração do agente, presença de matéria orgânica, etc.).

- Principais agentes químicos usualmente empregados no laboratório de

microbiologia para desinfecção e anti-sepsia:
• Fenol: É o padrão conta o qual outros desinfetantes são avaliados em sua ação
bactericida. Embora ainda seja popular, muitos outros desinfetantes recentes são muito
mais eficazes e ativos em concentrações mais baixas. O fenol possui vários derivados
que são utilizados também na desinfecção, muitos dos quais são mais eficientes que o
próprio fenol.
Dependendo das concentrações utilizadas estas substâncias podem ser bactericidas ou
bacteriostáticas. Diminuem a atividade do fenol: pH alcalino, presença de matéria orgânica,
baixas temperaturas, e presença de sabão. UTILIZAÇÃO: soluções de fenol 2% a 5% podem
ser utilizadas na desinfecção de materiais como escarro, urina, fezes, utensílios e
instrumentos contaminados.
• Álcool: Não deve se considerar o álcool etílico como agente esterilizante, porque as
concentrações que agem sobre células vegetativas são praticamente inertes contra
esporos bacterianos. As concentrações de álcool etílico de 50 a 70% são eficazes
contra as formas vegetativas e freqüentemente se encontra a afirmação que o álcool a
70% é mais efetivo, do que o álcool a 100% de volume e peso. UTILIZAÇÃO: como
anti-séptico, pois não lesa a pele e também como desinfetante de instrumentos
médicos e odontológicos que não necessitam ser esterilizados.
• Iodo: O elemento é tradicionalmente utilizado como agente germicida na forma de
tintura de iodo. Existem várias preparações com iodo e a maioria delas possui iodo,
iodeto de potássio e álcool. Também existem as soluções aquosas. O iodo é também
empregado na forma de substâncias conhecidas como iodóforos. Um exemplo muito
utilizado é o complexo chamado PVP-I (Polivinil pirrolidona-I), também conhecido como
Polvidine. O iodo nestes complexos é liberado lentamente. Esta substância tem
vantagem sobre as soluções aquosas e alcóolicas pois não queima, não mancha os
tecidos, raramente provoca reações alérgicas, não interfere no metabolismo e mantém
ação residual.
- Outros agentes químicos utilizados para desinfecção e esterilização: Cloro,
compostos quaternários de amônio (cloreto de cetilpiridíneo, cloreto de benzalcônio),
glutaraldeído, esterilizantes gasosos (óxido de etileno, beta-propiolactona,
formaldeído), metais pesados (mercúrio, prata, cobre), corantes (verde brilhante, cristal
violeta, etc), ácidos e álcalis (ácido sulfúrico, ácido clorídrico, soda).
ROTEIRO DE DESENVOLVIMENTO DA PRÁTICA

1. Desinfecção da bancada de trabalho com álcool 70%. Lavagem das mãos.

2. Demonstração e treinamento em grupo da técnica de esterilização pelo calor úmido sob
pressão (autoclave).
3. Demonstração da técnica de esterilização pelo calor seco (Forno de Pasteur).
4. Demonstração da técnica de filtração (filtro Seitz, membrana filtrante).
5. Treinamento individual da técnica de flambagem de alças e agulhas de semeadura
bacteriológica e tubos de ensaio.

Fonte: Cardoso, C.L.; Nakamura, CV; Dias Filho, BP; Garcia, LB; Nakamura, TU; Yamada, SF,
Microbiologia – Manual de Aulas Práticas, Biologia, Centro de Ciências Biológicas – UEM, Maringá – Pr,
2007.