Anda di halaman 1dari 18

Terpenoid adalah kelas beragam produk alami yang memiliki banyak fungsi dalam

kerajaan tumbuhan dan kesehatan manusia dan gizi. keragaman kimia mereka telah
menyebabkan lebih dari 40.000 penemuan struktur yang berbeda, dengan beberapa kelas
yang berfungsi sebagai agen farmasi penting, termasuk antikanker paclitaxel agen (Taxol)
dan terpenoid indole alkaloid yang diturunkan. Banyak senyawa terpenoid ditemukan
dalam hasil yang rendah dari sumber-sumber alam, budaya tanaman sehingga sel telah
diselidiki sebagai strategi produksi alternatif. rekayasa metabolik tanaman utuh dan kultur
sel tanaman merupakan alat yang efektif untuk meningkatkan baik menghasilkan
terpenoid dan mengubah distribusi terpenoid untuk properti yang diinginkan seperti yang
disempurnakan, aroma rasa atau warna. kemajuan terbaru dalam mendefinisikan jalur
metabolik terpenoid, terutama dalam metabolisme sekunder, pengetahuan tentang
peraturan peningkatan akumulasi terpenoid, dan penerapan pendekatan sistem biologi
tanaman muncul, telah memungkinkan rekayasa metabolik produksi terpenoid. Tulisan
ini membahas tentang keadaan saat ini pengetahuan tentang metabolisme terpenoid,
dengan fokus khusus pada produksi yang penting terpenoid farmasi aktif metabolik
sekunder dalam kultur sel tanaman. Strategi untuk mendefinisikan jalur dan langkah-
langkah mengungkap tingkat-mempengaruhi dalam metabolisme global, dan menerapkan
informasi ini untuk rekayasa metabolik sukses terpenoid, ditekankan.

Terpenoid, juga dikenal sebagai isoprenoidnya, mungkin adalah keluarga yang


paling beragam produk alami disintesis dari tanaman, melayani berbagai fungsi fisiologis
dan sosial penting. Lebih dari 40.000 terpenoid yang berbeda telah diisolasi dari tanaman,
hewan dan mikroba species1, 2. terpenoid tanaman diklasifikasikan sebagai metabolit
primer yang diperlukan untuk fungsi selular dan pemeliharaan, atau metabolit sekunder
yang tidak terlibat dalam pertumbuhan dan perkembangan. terpenoid metabolik primer
meliputi giberelin, karotenoid dan sterol, yang melayani fungsi dasar seperti modulasi
pertumbuhan sel dan perpanjangan tanaman, harvestation ringan dan photoprotection, dan
permeabilitas membran dan kontrol fluiditas. terpenoid metabolik sekunder yang sering
komersial menarik karena menggunakan mereka sebagai peningkat rasa dan warna, bahan
kimia pertanian, dan medicinals. Berbagai macam terpenoid (Gbr. 1) telah menunjukkan
aktivitas farmasi terhadap penyakit manusia seperti cancer3, 4, 5 (misalnya, taxanes,
termasuk paclitaxel dari spp Taxus., Dan terpenoid indol alkaloid (TIA), termasuk
vincristine dan vinblastine dari Catharanthus roseus), malaria (misalnya, artemisinin dari
Artemisia annua), dan HIV3 (misalnya, kumarin, termasuk calanolide A dari lanigerum
Calophyllum). Karena pentingnya komersial terpenoid, penerapan strategi rekayasa
metabolisme untuk kedua meningkatkan pasokan (misalnya, produksi terpenoid
medicinally dinilai baik dari tumbuhan alami atau melalui kultur sel tanaman; lihat di
bawah) penyakit dan meningkatkan sifat produk (misalnya, dan ketahanan terhadap hama
dalam tanaman, wangi ditingkatkan pada tanaman berbunga, rasa ditingkatkan dalam
buah-buahan dan sayuran) adalah penting sosial besar. Kajian ini akan menyoroti baik
kemajuan yang menarik dan tantangan masih harus dipenuhi dalam produksi dan
rekayasa terpenoid dalam tanaman dan kultur sel tanaman, dengan fokus pada terpenoida
farmasi aktif.

Terpenoid biosynthesis

Terpenoid adalah sebuah kelas senyawa turunan dari prekursor isopentenil difosfat
universal (IPP) dan allylic isomer nya dimethylallyldiphosphate (DMAPP), juga disebut
unit isoprena (Skema 1). Terpenoid blok bangunan kemudian dibentuk melalui
kondensasi gugus IPP tambahan melalui prenyltransferases. Monoterpenoid berasal dari
geranyl pirofosfat (GPP, C10), seskuiterpenoid berasal dari farnesyl pirofosfat (FPP,
C15), dan diterpenoids berasal dari pirofosfat geranylgeranyl (GGPP, C20). terpenoid
rangka Bahkan lebih tinggi mungkin melalui larutan intermediet ini untuk gugus
prekursor yang lebih besar. Sebagai contoh, sterol berasal dari triterpenoid squalene
(C30), yang berisi enam unit isoprena melalui kondensasi dua molekul FPP, dan
karotenoid (C40) sebagian besar dibentuk melalui kondensasi dua molekul GGPP untuk
menghasilkan senyawa-isoprena delapan unit . Setelah pembentukan terpenoid blok
bangunan asiklik struktural (misalnya, GPP, FPP, GGPP), synthases terpene bertindak
untuk menghasilkan kerangka terpena karbon utama. Tambahan transformasi sering
melibatkan oksidasi, reduksi, isomerisasi, dan enzim konjugasi menghias atau mengubah
kerangka utama dengan kelompok fungsional yang bervariasi untuk menghasilkan
keluarga terpenoid sangat beragam senyawa.
isopentenil difosfat (IPP) dan difosfat dimethylallyl (DMAPP) mengembun untuk
membentuk prekursor orde tinggi terpenoid, termasuk difosfat geranyl prekursor
monoterpenoid (GPP), yang farnesyl difosfat prekursor sesquiterpenoid (FPP) dan
geranylgeranyl difosfat prekursor diterpenoid (GGPP). Dua molekul mengembun FPP
untuk membentuk prekursor squalene triterpenoid, dan dua molekul mengembun GGPP
untuk membentuk tetraterpenoids orde tinggi.
Dua jalur yang berbeda menghasilkan C5 universal prekursor IPP dan DMAPP
(Skema 2). The mevalonate klasik (MVA) jalur ditemukan pada 1950-an dan dianggap
satu-satunya sumber prekursor IPP terpenoid dan DMAPP. Jalur MVA aktif pada bakteri,
tanaman, hewan dan jamur dan fungsinya dalam sitosol untuk umum memasok prekursor
untuk produksi seskuiterpen dan triterpen. Baru-baru ini, percobaan label pada bakteri
dan tanaman menunjukkan adanya jalur alternatif untuk menyediakan IPP dan DMAPP
(untuk review pada tumbuhan lihat ref 6,. 7, 8). Jalur ini, yang dinamakan setelah
prekursor berkomitmen pertama, 2-C-metil-D-erythritol-4-fosfat (MEP, jalur ini juga
kadang-kadang disebut sebagai jalur DXP), adalah plastidial di alam dan yang umumnya
digunakan untuk prekursor pasokan untuk produksi monoterpenoid, diterpenoids dan
tetraterpenoids. Meskipun interaksi antara jalur-jalur adalah sebagian besar masih belum
ditemukan, bukti terbaru telah mengungkapkan pertukaran intermediet antara sitosol dan
plastid9, 10, 11. Sebaliknya, studi isotop pelabelan dalam tembakau mendeteksi sedikit
pertukaran metabolit antara kompartemen di biosynthesis12 seskuiterpena. rekayasa
metabolik jalur tersebut akan mendapat manfaat secara signifikan dari pemahaman yang
lebih lengkap tentang ini kompartementalisasi dan transportasi.

(Waktu) Melalui mevalonate sitosol (MVA) jalur. HMGR, koenzim 3-hydroxy-3-


methylglutaryl reduktase A; IDI, isomerase difosfat isopentenil. (Kanan) Melalui jalur
plastidic MEP. DXS, sintase 1-deoksi-D-xylulose-5-fosfat; DXR, 1 reductoisomerase-
deoksi-D-xylulose-5-fosfat, HDS, sintasa difosfat 4-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenil;
IDS, isopentenil difosfat: sintase difosfat dimethylallyl, IDI, isomerase difosfat
isopentenil. panah putus-putus menunjukkan lebih dari satu langkah.

Terpenoid supply and study via plant cell culture

Meskipun beberapa terpenoid dihasilkan relatif jumlah besar dari sumber alam
(misalnya, minyak atsiri, resin dan malam), sering kali bernilai tinggi produk terpenoid
ditemukan dalam kelimpahan yang rendah di alam, dengan terpenoid sekunder biasanya
kurang dari 2-3% dari total berat kering. Sebagai contoh, sekitar 10.000 kg kulit kering
harus menyediakan 1 kg paclitaxel13, yang diterjemahkan menjadi harvestation dari kulit
2-4 pohon dewasa untuk memasok paclitaxel cukup untuk mengobati patient14 tunggal.
Ekstraksi dari sumber alami juga sangat bervariasi tergantung pada lokasi sumber
tanaman, dan musim panen, dan dapat dipengaruhi oleh kondisi lingkungan yang tidak
terduga. Karena tingginya nilai produk ini terpenoid yang diturunkan dan tidak dapat
diandalkan saat panen dari sumber-sumber alam di pertemuan kedua perawatan pasien
dan kebutuhan evaluasi klinis, upaya signifikan telah diarahkan terhadap pengembangan
proses produksi terbarukan dan ramah lingkungan. rute alternatif untuk memasok
terpenoid mencakup total sintesis kimia, semisynthesis dari prekursor terisolasi, rekayasa
genetika jalur tanaman di host mikroba, dan budaya tanaman sel (misalnya lihat ref. 15).
Setiap metode menawarkan keuntungan yang berbeda dan kekurangan tergantung pada
sistem tertentu yang menarik. Total sintesis tidak bergantung pada bahan lapangan-
dewasa, tapi sering kompleks melibatkan kimia menggunakan pelarut yang kasar dan
biasanya menghasilkan hasil produk rendah, seperti halnya untuk paclitaxel (ditinjau
dalam ref. 16) dan artemisinin17 pasokan.
Pengalihan jalur biosintesis terpenoid ke host mikroba menawarkan keuntungan
seperti kimia ramah lingkungan, penggunaan sumber karbon murah, dan kemampuan
manipulasi genetika untuk meningkatkan yields18 (lihat Tabel 1 untuk perbandingan sel
bakteri dan tanaman). Selain itu, sel mikroba lebih bisa dikembangkan untuk digunakan
dalam proses skala besar. sel kecil relatif tidak sensitif terhadap tegangan induksi melalui
impeller pencampuran dalam bioreaktor. Menggandakan kali secara signifikan lebih
pendek dan karena itu kali budaya dapat diminimalkan, meningkatkan throughput dan
mengurangi kesempatan untuk kontaminasi. Tahap produksi biasanya uncoupled dari fase
pertumbuhan untuk produk mikroba, sehingga sistem dua fasa dengan formulasi media
yang optimal untuk pertumbuhan dan produksi dapat digunakan. metabolit tanaman
kadang-kadang bersamaan dengan fase pertumbuhan eksponensial budaya, seperti halnya
dengan paclitaxel19, dan karena itu dua-tahap budaya tidak selalu memungkinkan.
Meskipun keuntungan yang jelas untuk sel rekayasa mikroba untuk suplai terpenoid,
beberapa tanaman terpenoid jalur metabolisme yang terlalu kompleks untuk mentransfer
efisien atau sebagian undefined, dan karena itu jalur yang lengkap tidak dapat dibentuk
kembali dalam sistem mikroba. Selain itu, sitokrom P450 (CYP450) hydroxylases sering
terlibat dalam dekorasi kerangka karbon metabolit terpenoid kompleks (misalnya,
paclitaxel dan taxanes terkait), dan ekspresi mitra redoks untuk enzim P450 tantangan
untuk sintesis terpenoid yang maju di systems20 mikroba. Dengan demikian, produksi
pada spesies asli kadang-kadang diperlukan, dan dalam kultur sel keadaan adalah pilihan
yang layak.
kultur sel tanaman memberikan alternatif, ramah lingkungan terbarukan untuk
penyediaan metabolit sekunder. Berbeda dengan panen alam, kondisi budaya dapat secara
ketat dikontrol untuk memenuhi ketat AS Administrasi Makanan dan Obat persyaratan.
Manipulasi proses dan kondisi lingkungan dan / atau rekayasa metabolisme dari jalur
kunci dapat secara signifikan meningkatkan selektivitas dan hasil baik. Selain itu,
senyawa baru dapat disintesis melalui salah satu peraturan yang dikendalikan dari jalur
biosintesis yang melekat atau direkayasa jalur metabolik. Kultur sel tanaman telah
dieksplorasi dalam produksi senyawa terpenoid dan terpenoid yang diturunkan banyak,
terutama bernilai tinggi produk farmasi seperti TIA dari Catharanthus roseus21, taxanes
dari Taxus sp.15, 22, 23, dan artemisinin dari Artemisia annua24. Cell budaya juga telah
diteliti untuk produksi agen farmasi aktif lainnya seperti shikonin dari Lithospermum
erythrorhizon25, berberin dari Coptis japonica26,, 27 camptothecin dari kedua
Camptotheca acuminata27, 28 dan Nothapodytes foetida29, dan hypericins dari
Hypericum perforatum30. Banyak proses telah dikembangkan dengan menggunakan
tanaman kultur suspensi sebagai akibat dari kemudahan dalam skala-up dan penerapan
strategi optimasi tradisional dikembangkan untuk sistem sel mikroba dan mamalia.
Namun, produksi metabolit sekunder seringkali lebih tinggi pada jaringan dibedakan;
sehingga budaya akar rambut yang telah berubah secara genetik dengan Agrobacterium
spp. juga telah secara luas used31, 32. Taxus spp. Kultur suspensi sel merupakan
keberhasilan teknologi kultur sel di Amerika Serikat dengan kelayakan terbukti dengan
Bristol-Myers Squibb dan Phyton Biotech, Inc (sebuah perusahaan DFP Farmasi) dalam
memasok paclitaxel untuk perumusan Taxol Bristol-Myers Squibb's. Selain itu, Samyang
Genex telah dikomersialisasikan proses untuk produksi paclitaxel melalui sel tanaman
culture33. kultur sel tanaman tidak hanya berguna dalam penyediaan terpenoid yang
berharga, tapi juga bisa sangat berharga dalam mengisolasi gen yang sebelumnya tak
dikenal metabolisme terpenoid. Contoh terbaik adalah penjelasan dari jalur biosintesis
paclitaxel (lihat di bawah untuk informasi lebih lanjut).
Sebuah tantangan utama untuk penggunaan komersial biasa teknologi kultur sel
tanaman variabilitas dalam akumulasi produk. Tidak seperti sistem mikroba, di mana
produktivitas diprediksi, sistem budidaya tanaman menunjukkan variasi yang signifikan
dalam pembentukan produk. Bahkan, keragaman telah dikutip sebagai isu yang paling
penting yang dihadapi penggunaan spp Taxus. sel budaya untuk penyediaan komersial
paclitaxel34. Tingkat tertinggi dari akumulasi paclitaxel telah diamati untuk berbeda
dengan sepuluh kali lipat antara garis sel dan di dalam baris sel sampel atas time35.
Karena sifat tanaman divisi seluler dan ketahanan lamella tengah yang kaya pektin yang
semen sel bersama-sama, agregat mengandung mana saja dari approx2-50 sel yang khas
dalam kultur sel tanaman. Karena ukuran dari agregat sel tanaman, yang dapat mencapai
2 mm, microenvironments heterogen berkaitan dengan oksigen dan ketersediaan hara
diciptakan dalam suatu agregat. Sel menuju pusat suatu agregat secara metabolisme dan
morfologi yang berbeda dari sel-sel di dekat pinggiran sebuah aggregate36. Kehadiran
microenvironments tersebut (di mana Taxus spp metabolisme sel. Diubah) dalam budaya
yang sama dapat berkontribusi terhadap variabilitas diamati dalam hasil paclitaxel.
Sebagian besar penelitian saat diarahkan pemahaman variabilitas dengan menganalisis
budaya rata-rata total (yaitu, sampling sebuah batch seluruh sel dan rata-rata lebih dari
mereplikasi batch). Laboratorium kami baru-baru ini mengembangkan metode analisis
aliran populasi cytometric untuk karakteristik heterogenitas dalam Taxus spp. sel
cultures36, 37, 38, 39, 40. Sebagai informasi lebih banyak ditemukan pada tingkat sel
tunggal untuk kultur jaringan tanaman, populasi bisa lebih baik direkayasa untuk
meningkatkan produktivitas dan stabilitas terpenoid.

Bioengineering of terpenoids in plant cell culture

Produksi terpenoid produk bernilai tinggi melalui kultur sel adalah proposisi yang
menarik, namun hasil yang rendah dan tingkat tinggi variabilitas dalam akumulasi
metabolit menyulitkan biasa menggunakan teknologi kultur sel tanaman untuk suplai
terpenoid pada skala besar. Meskipun telah ada kemajuan baru-baru ini kunci dalam
mendefinisikan jalur biosintesis terpenoid dan dalam memahami peraturan mereka (lihat
di bawah), masih ada berbagai tantangan yang terkait dengan sel-sel tumbuhan rekayasa
untuk meningkatkan akumulasi senyawa terpenoid: undefined terpenoid jalur biosintesis
metabolit sekunder, kebutuhan akan peraturan terkoordinasi langkah-langkah yang
mempengaruhi tingkat-ganda, kurangnya analisis sistem-lebar pada tanaman dan kultur
sel tanaman karena fakta bahwa genom tanaman begitu sedikit yang telah diurutkan,
ketidakmampuan untuk mentransfer informasi yang diperoleh dari studi keseluruhan-
tanaman dengan lingkungan kultur sel, variabilitas dalam terpenoid akumulasi produk
dari waktu ke waktu dan antar budaya sampel pada saat yang sama, kurangnya promotor
diinduksi tanaman, kesulitan dalam menerapkan metode tradisional transformasi genetik
untuk sistem kultur sel kunci, dan kompartemensi metabolisme terpenoid. Meskipun
tantangan ini, kemajuan signifikan telah dibuat dalam beberapa tahun terakhir untuk
mewujudkan tujuan metabolisme rekayasa terpenoid pada kultur sel tanaman. Bagian
berikut ini akan menyoroti kemajuan penting dan menyarankan strategi yang potensial
untuk metabolisme rekayasa terpenoid, dengan fokus khusus pada metabolit sekunder
obat yang sebagian besar kemajuan yang signifikan dalam teknologi kultur sel tanaman
telah dibuat.

Untuk insinyur jalur terpenoid, yang mempengaruhi tingkat-langkah harus diidentifikasi.


Paling sering keterbatasan tingkat terjadi di dalam jalur biosintetik. Karena banyak jalur
biosintesis terpenoid tetap sebagian undefined, berbagai metode telah digunakan untuk
mengidentifikasi gen terpenoid jalur biosintetik dan menjelaskan peraturan jalur: seleksi
mutan, membungkam gen, overekspresi gen melalui rekayasa genetik, makan prekursor,
penerapan inhibitor metabolik, dan enzim induksi dengan elisitasi (penggunaan senyawa
eksogen untuk menginduksi ekspresi gen). Salah satu yang paling umum diterapkan
Elisitor metabolisme terpenoid adalah asam jasmonic, atau metil ester yang jasmonat
metil. Sejak pertama kali diterbitkan penggunaan asam jasmonic sebagai penginduksi
biosintesis metabolit sekunder dalam kultur jaringan tanaman di 199241, telah terjadi
peningkatan yang stabil dalam jumlah publikasi yang mengandung 'tanaman' syarat dan
'asam jasmonic' baik atau ' metil jasmonat '(1.024 tahun 2002-2006 versus 1997-2000
versus 526 di 199 pada tahun 1992-1996; courtesy Web of Science, Thomson Scientific).
elisitasi Enzim adalah alat yang ampuh untuk mengidentifikasi langkah-langkah regulasi
dalam biosintesis terpenoid.

Terpenoid biosynthesis for precursor supply

Sebuah strategi umum untuk sintesis rekayasa terpenoid adalah fokus pada
peningkatan fluks untuk meningkatkan kolam prekursor IPP dan DMAPP, dengan
kloning gen yang diperlukan dan pemahaman peraturan baik MVA dan jalur pasokan
MEP. Semua gen jalur telah diidentifikasi (ditinjau dalam ref 7,42.), Namun kontribusi
relatif dari enzim tertentu untuk mengendalikan fluks global melalui jalur dan antara
kompartemen untuk memasok terpenoid sebagian besar tidak diketahui. Banyak bukti
telah muncul tentang pengaruh enzim terisolasi pada akumulasi terpenoid (disajikan di
bawah), tetapi gambaran yang lengkap kontrol fluks yang dibutuhkan untuk rekayasa
metabolik yang optimal memerlukan penelitian atas sistem yang lebih luas, yang sejauh
ini masih kurang.
MVA jalur untuk pasokan dari IPP dan DMAPP. Meskipun banyak terpenoid
penting dan senyawa terpenoid yang diturunkan disintesis melalui kultur sel berasal dari
IPP dan DMAPP dihasilkan melalui jalur MEP, studi terbaru menunjukkan cross-talk
antara MVA dan jalur MEP menunjukkan bahwa rekayasa dari jalur MVA untuk
pembentukan IPP dapat berguna dalam pengendalian biosintesis terpenoid plastidial.
Jalur MVA klasik didefinisikan dengan baik, dan banyak penelitian telah menunjukkan
pentingnya koenzim 3-hydroxy-3-methylglutaryl A reduktase (HMGR). HMGR secara
ketat diatur dalam sistem tanaman, dan elisitor-induced HMGR gen telah diklon dan
dikarakterisasi dalam sistem berbagai tanaman termasuk tembakau, tomat, kentang, beras
dan terakhir pepper43, dengan induksi sering dikaitkan dengan biosintesis terpenoid
meningkat. Sebagai contoh, overekspresi HMGR menyebabkan peningkatan akumulasi
sterol tobacco44 dan tomato45. Kloning dan analisis ekspresi gen HMGR baru saja
dimulai di penting sistem kultur sel komersial. Sebuah gen HMGR dari media Taxus
milik keluarga kecil gen kloning yang menunjukkan homologi tinggi untuk HMGRs46
tanaman lainnya. Analisis ekspresi HMGR dalam budaya akar rambut A. annua L.
menunjukkan kontrol temporal, tetapi tidak berkorelasi dengan akumulasi artemisinin47.
Sebuah gen HMGR hamster itu overexpressed dalam C. roseus akar berambut, sehingga
pola diferensial akumulasi alkaloid, yang menunjukkan peran potensial dalam mengatur
biosynthesis48 HMGR alkaloid.
MEP jalur untuk pasokan dari IPP dan DMAPP. Penelitian yang ekstensif telah
dilakukan untuk menjelaskan MEP peraturan jalur (untuk ringkasan jalur dan hubungan
untuk sintesis terpenoid melihat ref 6,49,50 dan Skema 2.). Awal enzim jalur telah
terbukti mempengaruhi tingkat-di akumulasi terpenoid dalam berbagai sistem. Sebagai
contoh, berlebih dari 1-deoksi-D-xylulose-5-fosfat (DXP) sintase (DXS) berkorelasi
dengan meningkatnya akumulasi minyak atsiri di lavender51 transgenik, akumulasi
ginkgolide di Ginkgo biloba52, akumulasi karotenoid dalam Arabidopsis thaliana53 dan
beta-karoten akumulasi dalam Jacq54 kelapa sawit Elaeis guineensis. Ekspresi dari DXP
reductoisomerase (DXR) dalam peningkatan produksi minyak peppermint monoterpene
penting oleh 40-60% 55. tanaman transgenik A. thaliana dengan DXS diubah dan tingkat
enzim DXR dikumpulkan melalui penyaringan untuk ketahanan diubah menjadi inhibitor
metabolik dari jalur MEP. Downregulation dari DXR mengakibatkan fenotipe mewakili
terpenoid produksi menurun, sedangkan upregulation DXR mengakibatkan peningkatan
positif dalam terpenoid plastid-turunan seperti klorofil dan carotenoids56.
Pengaruh langkah-langkah terakhir dalam jalur MEP, yang dikatalisis oleh sintase
4-difosfat enzim 1-hidroksi-2-methyl-2-(E)-butenil (HDS) dan isopentenil difosfat:
sintase difosfat dimethylallyl (IDS), serta reaksi interkonversi antara IPP dan DMAPP,
yang dikatalisis oleh isomerase difosfat isopentenil (IDI), baru-baru ini diselidiki oleh
membungkam pasca-transkripsi menggunakan tembakau berdetak virus (TRV) 57.
Silencing dari HDS dan IDS menghasilkan tanaman dengan daun yang mengandung <4%
dari klorofil dan karotenoid tanaman kontrol. Selain itu, membungkam langkah
isomerisasi menghasilkan tanaman dengan pengurangan 80% pada pigmen dibandingkan
dengan kontrol. Hasil ini menunjukkan kegunaan membungkam gen dalam memahami
peraturan jalur terpenoid dan menyarankan bahwa IDI diperlukan untuk jalur MEP
berfungsi penuh.
Kloning dan analisis ekspresi gen jalur MEP baru-baru ini dimulai dalam sistem
kultur sel tanaman komersial penting. Enzim kelima di jalur MEP, sintasa 2,4-
cyclodiphosphate 2-C-metil-D-erythritol (MCS), baru-baru ini kloning dan ditandai dari
Taxus media58. Jalur MEP baru-baru ini terbukti fungsional dalam akar A. annua
cultures59. Klon untuk DXS dan DXR diisolasi dari perpustakaan DNA komplementer,
dan fungsi dikonfirmasi melalui analisis komplementasi di Escherichia coli. Baik umur
kultur dan tingkat cahaya dipengaruhi tingkat transkrip, dengan cahaya kontinyu yang
paling menguntungkan. Karena kultur sel banyak proses untuk penyediaan terpenoid
metabolik sekunder beroperasi dalam gelap untuk memaksimalkan produktivitas, plastida
selain kloroplas yang fungsional. Penelitian lebih lanjut tentang pengoperasian dan
pengaturan jalur MEP dalam plastida nongreen seperti amyloplasts, chromoplasts atau
proteinoplasts akan memberikan wawasan baru untuk rekayasa sistem kultur sel tanaman.
Inhibitor studi dengan fosmidomycin (menghambat jalur MEP oleh DXR
menghambat), mevinolin (menghambat jalur MVA oleh HMGR menghambat),
mevastatin (menghambat jalur MVA oleh HMGR menghambat), D, L-gliseraldehida
(DLG; inhibitor transportasi IPP ke dalam plastida) dan natrium pirofosfat (NAPP;
substrat analog IPP yang mengganggu dengan serapan plastid IPP) dilakukan pada Taxus
spp. kultur suspensi untuk menentukan kontribusi relatif dari jalur MVA dan MEP di
akumulasi taxane. Dalam penelitian dengan baccata Taxus, produksi taxane secara
signifikan lebih negatif dipengaruhi oleh penambahan fosmidomycin dibandingkan
dengan mevinolin, yang menunjukkan kontribusi yang lebih besar pasokan dari IPP, MEP
pathway60 61. Penurunan produksi taxane dengan penambahan mevastatin menunjukkan
bahwa jalur MVA dapat berkontribusi untuk IPP supply62. Penghambatan IPP
transportasi ke plastida mengakibatkan penurunan produksi taxane, khususnya dalam
budaya, stadium akhir period62 63 (yaitu, 14 hari), lagi-lagi menunjukkan beberapa
pasokan IPP dari jalur MVA. Inhibitor studi perlu dianalisis dengan hati-hati karena isu-
isu potensial dengan spesifisitas, kelarutan, penyerapan, dan transportasi untuk
memperbaiki kompartemen. Kontribusi persentase dari setiap jalur untuk pasokan IPP
untuk produksi taxane hanya dapat definitif ditentukan dari studi pelabelan, yang belum
dilakukan.

Terpenoid secondary metabolite biosynthesis and regulation

Banyak tanaman jalur metabolit sekunder yang sebagian undefined, dan karena itu
penjelasan dari jalur dan regulasi yang diperlukan untuk biosintesis langsung lebih baik
dalam kultur sel tanaman. Bagian ini akan berfokus pada kemajuan dalam Taxus spp.
untuk produksi paclitaxel agen antikanker, meskipun strategi yang disajikan di sini
umumnya berlaku untuk sistem penting lainnya tanaman terpenoid metabolisme
sekunder.
Paclitaxel adalah diterpenoid siklik dan polyoxygenated mengandung substitusi
beberapa kelompok fungsional, cincin oxetane, dan suatu rantai samping phenylisoserine-
berasal. biosintesis Paclitaxel diawali dengan pembentukan GGPP dan putatively
melibatkan 19 steps64 tambahan. Jalur biosintetik taxane seperti yang saat ini dikenal
secara organisasi dapat dibagi menjadi langkah-langkah berikut (Skema 3): (1)
pembentukan prekursor taxane pertama berkomitmen, taxadiene; (2) penambahan
oksigen tujuh kelompok fungsional dan dekorasi inti karbon dengan reaksi asilasi, (3)
oksidasi fungsi keton dan pembentukan cincin oxetane; (4) perakitan dari rantai samping;
(5) konjugasi rantai sisi ke intermediate taxane (baccatin III kemungkinan) dan reaksi
modifikasi terakhir untuk menghasilkan sisi rantai yang mengandung taxanes seperti
paclitaxel. Awal bekerja di jalur langkah cerdas dilakukan pada jaringan tanaman secara
keseluruhan, tapi tantangan logistik spp Taxus. koleksi tanaman dan sifat lambat tumbuh
anakan mendorong peneliti untuk menggunakan Taxus spp. sel budaya sebagai sumber
terbarukan material65. Menggunakan pendekatan molekuler langsung, laboratorium
Croteau mengembangkan strategi yang sangat sukses untuk mengungkap langkah jalur
taxane biosintetik, yang melibatkan menggunakan sistem sel-bebas untuk menunjukkan
aktivitas enzim melalui penambahan substrat putatif dan penerapan prekursor makan
studi dengan baik tanaman atau kultur sel , diikuti oleh isolasi product65 metabolit.
Untuk mendapatkan cDNA pengkodean masing-masing enzim jalur, pencarian homologi
berbasis digunakan dalam hubungannya dengan perpustakaan tampilan diferensial
dihasilkan melalui perbandingan budaya unelicited dengan yang ditimbulkan dengan
metil jasmonate65.

DMAPP dan IPP dihasilkan dari jalur MEP plastidic dan pekat oleh GGPP sintase
(GGPPS) untuk membentuk GGPP. (1) komitmen pertama prekursor biosintesis taxane,
taksa-4 (5), 11 (12)-diena dihasilkan oleh sintase taxadiene (TS). (2) Serangkaian
hydroxylations P450 dan asilasi menghasilkan taxane putatif menengah. (3) Non-side-
rantai taxanes (termasuk baccatin III) yang dihasilkan baik melalui reaksi oksidasi dan
pembentukan cincin oxetane. (4) bagian rantai samping berasal dari alfa-fenilalanin. (5)
rantai samping ditambahkan ke prekursor taxane non-side-rantai putatif (III baccatin
mungkin), dan taxanes sisi paclitaxel dan lain rantai terbentuk. Ac, asetil; Bz, benzoil.
panah putus-putus menunjukkan lebih dari satu langkah.

Selain kesenjangan dalam pemahaman kita tentang jalur biosintesis paclitaxel,


aspek-aspek lain dari metabolisme paclitaxel tetap misterius. Dalam jalur ini, peraturan
dapat diselidiki dengan membandingkan program ekspresi gen waktu untuk taxane
akumulasi dalam kultur sel. Baru-baru ini, ekspresi gen sepuluh jalur dibandingkan dari
waktu ke waktu di kedua sel jasmonat-menimbulkan unelicited dan metil cultures66.
langkah Hilir dalam jalur telah diidentifikasi sebagai kandidat yang sangat baik untuk
menilai keterbatasan, karena transkrip tidak hadir dalam budaya unelicited sebagaimana
ditentukan baik melalui utara blotting dan RT-PCR. Data ini tambahan menetapkan
preferensi untuk satu cabang di pathway66 biosintesis taxane, sehingga memberikan
petunjuk lebih lanjut tentang cara terbaik untuk mengendalikan fluks metabolisme.
Namun, pertanyaan besar tetap. Sebagai contoh, beberapa gen yang bertanggung
jawab untuk oksigenasi dalam struktur cincin inti taxane belum teridentifikasi, dan
reductases CYP450 bertanggung jawab untuk elektron yang berganti ke hydroxylases
monooxygenases CYP450 atau belum ditandai. Selain itu, tidak ada unsur-unsur
peraturan yang berkaitan dengan metil jasmonat isyarat atau biosintesis paclitaxel, seperti
aktivator transkripsi, telah diklon dari spp Taxus. Di luar jalur biosintesis langsung,
langkah-langkah regulasi dalam metabolisme sekunder mungkin ada dalam transportasi
dan produk intermediet baik ke kompartemen intraselular atau ke ruang ekstraseluler
dalam kultur jaringan tanaman, atau produk degradasi baik dalam ruang intraseluler atau
ekstraseluler (Gbr. 2) . Transportasi dan degradasi paclitaxel in planta dan dalam budaya
tanaman sel juga tetap tidak diketahui. Sebuah membran plasma mengikat ATP-kaset-tipe
transporter ditemukan terlibat dalam sekresi terpenoid pertahanan dari sel
plumbaginifolia Nicotiana cultures67, dan analog protein transpor yang spesifik juga
dapat terlibat dalam sekresi taxane.
intermediet metabolisme primer sebagian besar diproduksi dalam sitosol dan
diangkut ke plastid untuk konversi melalui jalur metabolik sekunder. metabolit sekunder
yang diangkut dari plastid baik untuk penyimpanan atau sekresi pada media
ekstraseluler. metabolit sekunder Hidrofilik disimpan dalam kompartemen berair seperti
vakuola, sedangkan metabolit sekunder hidrofobik disimpan dalam dinding sel. Produk
bisa diturunkan baik intrasel maupun ekstrasel, dan metabolit degradatif dapat diangkut
masuk dan keluar dari sel dan digunakan kembali di kedua metabolisme primer dan
sekunder.

Nondirect pendekatan telah digunakan untuk menentukan gen biosintesis putatif


dan unsur-unsur peraturan di daerah lain metabolisme paclitaxel. Sebagai contoh, sebuah
strategi sekuensing acak dengan menggunakan sebuah perpustakaan cDNA paclitaxel-
terakumulasi telah mengidentifikasi sepuluh CYP450s baru di paclitaxel-mengumpulkan
cuspidata Taxus cells64. CYP450 klon ini memiliki kesamaan yang tinggi (> 75%) untuk
dikenal oxygenases CYP450 paclitaxel-terkait dan kesamaan rendah untuk hydroxylases
sitokrom tanaman lainnya, yang sangat berarti hubungan dengan paclitaxel biosintesis.
Untuk mengidentifikasi gen pengatur nonbiosynthesis-terkait, pendekatan yang lebih
global diperlukan. Analisis gen diferensial disajikan antara dua negara fisiologis
(misalnya, paclitaxel vs paclitaxel nonaccumulating mengumpulkan) dapat memberikan
banyak informasi tentang gen yang terlibat dengan mengatur keadaan tertentu. Sebagai
contoh, metode tampilan diferensial telah diterapkan untuk mengidentifikasi gen yang
berhubungan dengan paclitaxel biosynthesis68. populasi mRNA dibandingkan dari sel
chinensis Taxus sebelum dan setelah melakukan sintesis paclitaxel, dan satu klon
bertekad untuk secara khusus dinyatakan dalam fase paclitaxel-produksi budaya.
Meskipun gen diduga tidak lagi ditandai, studi ini menunjukkan potensi untuk
pendekatan skala besar untuk mengidentifikasi gen baru. metode tampilan Diferensial
juga telah digunakan untuk menjelaskan ekspresi gen alkaloid dalam sampel daun dan
akar dari C. roseus69, untuk menyelidiki interaksi simbiosis antara truncatula Medicago
dan Sinorhizobium meliloti70 dan untuk mengidentifikasi gen baru yang terlibat dalam
xylogenesis dari Eucalyptus71.

Progress in metabolic engineering of terpenoids in plants

Beberapa hasil yang paling menjanjikan telah diamati dengan ketersediaan rekayasa
prekursor melalui penargetan jalur MVA dan MEP (ditinjau dalam ref 72,73.). Terpenoid
rekayasa metabolik hilir langkah jalur metabolit sekunder telah lebih terbatas, sebagian
karena kurangnya jalur baik definisi dan pemahaman peraturan, tetapi beberapa
keberhasilan telah dilaporkan untuk taxanes, alkaloid dan artemisinin. Dalam salah satu
contoh diterbitkan pertama, sintesis skopolamin diinduksi di belladonna Atropa
memperkenalkan pada pengkodean gen hiosiamin-6beta-hydroxylase74. sintase Farnesyl
difosfat (FPPS) menghasilkan prekursor sesquiterpene FPP, dan berlebih dari gen kapas
FPPS dalam annua A. transgenik menghasilkan tiga-untuk menghasilkan empat kali lipat
lebih tinggi dari artemisinin di roots75 berbulu. Baru-baru ini, sebuah makalah yang
menarik menunjukkan bahwa penargetan amorpha sintase-4 coexpressed ,11-diena
(ADS) dan FPPS ke plastida dalam tembakau secara dramatis meningkatkan akumulasi
dari prekursor amorpha artemisinin-4 ,11-diene12. Salah satu sistem yang paling baik
dipelajari dan sukses dalam hal rekayasa metabolis TIA biosintesis di C. roseus, di mana
meningkatkan hasil alkaloid dan profil telah dicapai dengan berbagai kondisi
transformasi (untuk review terbaru lihat ref. 21).
Rekayasa genetika spp Taxus. suspensi sel dengan gen yang mempengaruhi tingkat-
putatif tidak mungkin karena kurangnya metode yang dapat diandalkan untuk transfer
gen. Namun, protokol transformasi Agrobacterium baru spp.-dimediasi baru-baru ini
telah didirikan untuk spp Taxus. suspensi budaya dengan transformasi yang stabil sampai
dengan 20 months76, yang sekarang memungkinkan rekayasa metabolik spp Taxus. sel
dengan gen peraturan yang berlaku. Selain dari laporan ini baru-baru ini, gen taxane jalur
fungsional biosintetik telah disajikan dalam kedua E. coli77 dan Saccharomyces
cerevisiae78, dan lima gen sekuensial telah diubah menjadi ragi tunggal host78.
Meskipun taxadiene antara jalur diamati, produk-produk berikut yang hidroksilasi
CYP450 pertama tidak detected78. Masalah ini dapat dikurangi dengan peningkatan
aktivitas redoks diperlukan. Coexpression dalam ragi dari reduktase CYP450 bersama
dengan hidroksilase CYP450 taxane biosintetik (10beta-hidroksilase) menghasilkan
peningkatan signifikan dalam aktivitas hidroksilase dibandingkan dengan ragi tidak
memiliki reductase79 cotransformed. Baru-baru ini, langkah pertama untuk sintesis
teknik paclitaxel dalam tanaman inang alternatif telah accomplished80, 81. Sebuah
sintase taxadiene terisolasi dari baccata T. konstitutif disajikan dalam thaliana A. untuk
menghasilkan taxadiene80. Pertumbuhan keterbelakangan dan penurunan pigmen
fotosintesis disarankan pengalihan total fluks dari jalur terpenoid lainnya. Sintase
taxadiene adalah tambahan konstitutif disajikan dalam buah tomat transgenik, mencapai
hasil yang lebih besar dari 600 kali lebih tinggi dari hasil maksimal yang dilaporkan
dalam A. thaliana81. Ekspresi enzim kunci jalur taxane biosintetik dalam sistem host
alternatif akan memungkinkan tidak hanya memasok intermediet jalur, tetapi juga sistem
untuk karakterisasi gen jalur baru ditemukan. Ekspresi dari jalur biosintesis lengkap
taxane di host alternatif sangat tidak mungkin diberikan kompleksitas jalur, jadi rekayasa
langsung di Taxus spp. adalah pendekatan yang paling menjanjikan untuk meningkatkan
pasokan paclitaxel.

Future directions in metabolic engineering of terpenoids

Meskipun kemajuan terbaru dan hasil yang menjanjikan di bidang teknik


metabolik terpenoid, masih ada berbagai daerah di mana kemajuan yang signifikan dapat
dibuat. upaya rekayasa metabolik akan ditingkatkan melalui analisis sistem-macam
tanaman dan kultur sel. jaringan reaksi tanaman secara signifikan lebih kompleks
daripada sistem mikroba. Jalur redundansi dan keterlibatan beberapa kompartemen
intraselular menyulitkan upaya fluks analisis. Manipulasi langkah enzimatik tunggal telah
menghasilkan kesuksesan yang tak terduga. Dalam rekayasa sintesis karotenoid, enzim
berkomitmen pertama, sintase phytoene (Psy), telah ditargetkan untuk rekayasa
metabolik. Namun, overekspresi Psy menyebabkan cacat pertumbuhan tomat akibat
pengalihan fluks dari giberelin synthesis82. Contoh ini menunjukkan pentingnya
memahami dampak keseluruhan dari manipulasi gen tunggal pada produk hilir tambahan.
Karena jalur metabolik sekunder seringkali undefined, pendekatan yang menjanjikan
untuk rekayasa metabolik efektif adalah penggunaan transkripsi, spesifik factors83 84.
Karena banyak metabolit sekunder yang berhubungan dengan pertahanan, peraturan
mereka erat terkoordinasi baik temporal dan spasial pada tumbuhan tingkat tinggi dan
mungkin kultur sel, dan faktor-faktor transkripsi dapat digunakan untuk mengendalikan
baik seluruh jalur atau cabang khusus untuk menghasilkan hasil yang diinginkan
terpenoid dan distribusi.
Saat ini, hanya dua genom tanaman telah benar-benar diurutkan-beras dan A.
thaliana-dan karena itu tradisional "omics" analisis pada tanaman dan kultur sel telah
sebagian besar terbatas pada sistem ini. Beberapa tantangan termasuk anotasi gen
tanaman yang hanya didasarkan pada urutan homologi gen yang diketahui atau fungsi
diprediksi systems85 lain. Misalnya, hanya 15% dari tanaman CYP450s putatif telah
ditandai biochemically85 fungsional. Oleh karena itu, penjelasan yang didasarkan pada
pengetahuan mutlak fungsi sangat terbatas. Karena terpenoid begitu beragam dan banyak
itu menantang untuk mengidentifikasi semua senyawa terpenoid dan terpenoid yang
diturunkan melalui analisis metabolomik dalam pabrik atau sistem sel kultur. Sebagai
contoh, lebih dari 350 taxanes telah isolated86, 87, dengan lebih dari 30 taxanes berbeda
secara bersamaan terakumulasi dalam sel culture88. Oleh karena itu, sebagian besar
metabolit analisis dengan spp Taxus. fokus pada identifikasi dan kuantifikasi taxane
metabolit kunci seperti paclitaxel dan baccatin III. Namun, identifikasi dan kuantifikasi
dari kolam metabolit lengkap taxane serta senyawa terpenoid yang diturunkan lain yang
hadir dalam kondisi tertentu dalam suatu budaya sel lebih lanjut akan memungkinkan
desain strategi untuk meningkatkan hasil taxanes yang diinginkan, yang menunjukkan
jalur harus dicegah dan yang jalur harus diinduksi. Integrasi genomik tanaman,
transcriptomik, proteomik dan dataset metabolomik adalah dalam masa pertumbuhan,
namun hasil awal yang promising85 dan kemajuan sedang dibuat dalam pemodelan
matematik plant metabolisme pathways89. Genome analisis fungsional genomik terutama
yang telah terbatas pada sistem tanaman model, tetapi baru-baru ini sebuah analisa yang
komprehensif profiling kedua transkrip (417) dan metabolit (178) dilakukan dalam sel C.
roseus cultures90. Gene-ke-gen dan jaringan gen-ke-metabolit yang dihasilkan, dan
mereka membantu mengungkap perbedaan regulasi di jalur utama metabolisme alkaloid.
Data ini dapat diterapkan untuk lebih memahami metabolisme sekunder dan regulasi
dalam sistem ini penting tanaman obat.
Secara keseluruhan, uang muka menarik dan penting telah dilakukan di kedua
karakterisasi dan pengalihan jalur metabolisme yang terlibat dalam sintesis terpenoid.
Manipulasi metabolisme tanaman melalui rekayasa metabolisme secara signifikan lebih
rumit daripada manipulasi sistem lebih mikroba dipelajari dengan baik, tetapi hal ini
menjadi semakin mungkin karena kemajuan dalam sistem analisis tanaman dan kultur sel.
Sel tanaman teknologi budidaya adalah platform yang sangat baik baik untuk penyediaan
senyawa terpenoid dan untuk identifikasi dan isolasi gen biosintesis baru dan peraturan
terpenoid. Saat ini, pasokan paclitaxel tergantung pada teknologi sel tumbuhan budaya
dan merupakan kisah sukses besar untuk teknologi ini muncul di Amerika Serikat.