(INFORME)
2004
INTRODUCCIÓN
La identificación bacteriana se puede realizar por medio de una serie de análisis que
necesitan de diferentes cultivos y procedimientos para llegar a identificar las especies
bacterianas que contaminan los alimentos o las aguas.
OBJETIVO GENERALES
OBJETIVOS ESPECIFICOS
Analizar los respectivos resultados y por medio de estos hacer una previa
interpretación.
1. TEORÍA RELACIONADA
Metabolismo Bacteriano
El metabolismo puede dividirse para su mejor estudio en tres aspectos diferentes pero
íntimamente ligados; el catabolismo que es la suma de reacciones exergónicas que
permiten liberar la energía contenida en los nutrientes o sustratos y ser acumuladas en
forma de ATP, u otros compuestos, el metabolismo intermedio que es el conjunto de
reacciones de los productos de hidrólisis del catabolismo y algunos nutrientes son
transformados en ácidos orgánicos, esteres fosfóricos y otros compuestos como
aminoácidos, y el anabolismo que es la parte del metabolismo implicado en la síntesis e
macromoléculas (ácidos nucleicos, proteínas, sustancias de reserva y otros, todos
reacciones endergónicas).
Ensayos Bioquímicos
Existen diferentes sistemas que facilitan la realización de tales ensayos, porque proponen
el mejor conjunto de pruebas bioquímicas para la identificación de un grupo bacteriano,
porque simplifican la interpretación de un resultado utilizando un valor numérico, porque
proveen los reactivos listos para su uso o porque son totalmente automatizables.
Las pruebas o ensayos bioquímicos, son pruebas simples que se han desarrollado para
demostrar en forma clara una determinada característica bioquímica como presencia o
ausencia de una determinada actividad enzimática, grupo de enzimas o determinada vía
metabólica, crecimiento a una determinada temperatura, crecimiento en presencia de
inhibidores, etc. No significan de ninguna manera un estudio profundo del metabolismo
bacteriano.
Para llevarlas a cabo, se pueden utilizar diferentes sistemas de trabajo (medio de cultivo,
indicador, revelador, etc.) que puede ser diferente aún para el mismo ensayo si se trata de
diferentes microorganismos. Por ejemplo se debe suplir con factores de crecimiento el
medio de cultivo para estudiar la fermentación de distintos azúcares cuando se sabe que
el microorganismo en estudio es exigente. A la determinación de la especie se puede
llegar según diversos sistemas (manuales de identificación, comerciales, etc.).
* OXI/FERM TUBE II, (Becton Dickinson). Es un sistema listo para usar para la
identificación de bastones gram (-), aerobios o anaerobios facultativos, oxidasa (+).
Consiste en un tubo de plástico de 12 medios de cultivo que permite la realización
simultánea de 14 pruebas bioquímicas.
En todos los casos se debe tener un cultivo fresco (18-24 hrs. de incubación) en un medio
en que el microorganismo se desarrolla en forma óptima, a pH, fuerza iónica, atmósfera y
temperatura adecuados. Siempre que se prepara un nuevo lote de medio de cultivo para
una prueba, deben llevarse a cabo los correspondientes controles de calidad, sembrando
en dicho medio una cepa positiva y otra negativa para ese test.
Si bien existe una gran variedad de pruebas bioquímicas empleadas con fines de
identificación, se enumerarán a continuación solo las que se utilizan más frecuentemente,
agrupadas según el tipo de ensayo y se denominan según su nombre corriente.
a) oxidasa
b) catalasa
OF (óxido-fermentación)
Crecimiento en caldo tioglicolato
Fermentación de carbohidratos
a) citrato
b) malonato
c) hipurato para coliformes
a) asimilación
b) denitrificación
a) indol
b) H2S
c) Fenilalanina
d) Lisina, arginina, ornitina
e) Urea
5) Ensayos combinados
6) Detección de exoenzimas
a) lecitinasa
b) proteasas, coagulasa
c) amilasas
d) celulasas
e) desoxirribonucleasas
f) acción de microorganismos sobre la sangre (hemolisinas)
7) Misceláneos
a) KCN
b) Bilis
c) producción de pigmentos
a) Temperatura
b) NaCl
c) Antibióticos
2. FLUJOGRAM AS
Observar resultados
2.2 CITRATO
Observar resultados
2.3 INDOL
Agitar
Observar resultados
Observar resultados
2.5 DESCARBOXILASA
Observar resultados
Agitar
Observar resultados
Agitar
Observar resultados
Extraer colonias
Colocar en portaobjetos
Agregar H2O2
Observar resultados
2.9 UREASA
Observar resultados
2.10 GELATINAZA
Observar resultados
TABLA DE RESULTADOS
En la prueba TSI (hierro tres azucares) el medio está constituido por tres azucares:
lactosa, glucosa y sacarosa, de las cuales la lactosa y la sacarosa se fermentan en medio
aerobio y la glucosa en medio anaerobio. Al inocular el microorganismo (Pseudomona) se
observó una coloración café-amarillo en el pico de flauta lo cual indica la producción de
ácido por la fermentación de los tres azucares y negro en la profundidad que demuestra la
formación de H2S, además se observó un rompimiento del medio lo que indica la
desprendimiento de gas (CO 2 y H2). (ver anexo 1)
Para la prueba Kliger, el medio ya se encontraba de un color café vino y con rompimiento,
al inocular la Pseudomona no mostró cambio alguno. Por lo tanto, no podemos sacar
conclusiones, de ahí que los resultados sean negativos, pues consideramos que el medio
no estaba en condiciones óptimas para realizar esta prueba. (ver anexo 2)
La prueba de Indol realizada con la E. Coli fue negativa, después de habérsele adicionado
el reactivo de kovacs, no presentó ningún anillo, lo que indica que el microorganismo no
desdobló el triptófano presente en el caldo peptona tripticasa para convertirlo en Indol.(ver
anexo 4)
En la prueba del nitrato, la reacción fue negativa lo que indica que no se ha producido
degradación alguna del nitrito o que este se ha reducido hasta nitrógeno o hasta
amoniaco.(ver anexo 12)
En la prueba de baird-parker, las colonias se observaron café oscuro con halos claros, por
lo tanto se considera un prueba positiva.(ver anexo 13)
En la prueba de Hektoen Enteric Agar, el resultado dió positivo, se vió una coloración
negra en las colonias, lo que indica que eran H2S positivas.(ver anexo 15)
Para la prueba de Endo C, se observó una coloración rojas en las colonias debido a que
el aldehído libera fucsina a partir de la combinación fucsina-sulfito, el resultado de esta
prueba fue positiva.(ver anexo 16)
PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS
El agar triple azúcar hierro es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la
capacidad de producción de ácido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un
único medio. También permite la detección de la producción de H2S. Es un medio útil para
la identificación de enterobacterias.
El agar se prepara en forma de pico de flauta. Esto determina que existan 2 cámaras de
reacción dentro del mismo tubo. La porción inclinada (pico) expuesta en toda su
superficie al oxígeno es aerobia y la porción inferior (fondo) está protegida del aire y es
relativamente anaerobia. La porción inclinada del tubo que está expuesta al oxígeno
atmosférico tiende a tornarse alcalina (roja por el rojo fenol) por la utilización aerobia de
las peptonas.
El medio está diseñado de tal forma que la glucosa se encuentra en una proporción 10
veces menor que la lactosa y la sacarosa. Si el TSI es inoculado con una bacteria
fermentadora de glucosa pero no de lactosa ni de sacarosa, la cantidad de ácido
producida por fermentación a partir de la glucosa será baja porque la concentración de
glucosa es baja. Al principio se producirá viraje del indicador al amarillo en tubo, pero al
continuar la incubación, el pico del tubo retornará al rojo por la degradación aerobia de las
peptonas antes descrita.
Interpretación
AGAR KLIGER
CITRATO
CRECIMIENTO MICROORGANISMOS
Positivo: medio de cultivo Citratos - positivos:
Azul oscuro Enterobacter, S. parathyphi, S. enteriditis, S.
typhimurium, Arizona.
Klebsiella, Serratia.
Negativo o inhibido Citratos – negativos:
Shigella, Escherichia, S. paratyphi y otros.
Interpretación
INDOL
El indol es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido triptófano. Las
bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptófano
con producción de indol, ácido pirúvico y amoníaco. La producción de indol es una
característica importante para la identificación de muchas especies de microorganismos.
Interpretación
El desarrollo de un vivo color rojo fucsia en la interfase del reactivo y el caldo, segundos
después de añadir el reactivo indica la presencia de indol y una prueba positiva.
ROJO DE METILO
Una de las características taxonómicas que se utilizan para identificar los diferentes
géneros de enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporción de productos de
fermentación que se originan por la fermentación de la glucosa. Se conocen 2 tipos
generales: La fermentación ácido-mixta y la fermentación del 2,3 butanodiol. En la
fermentación ácido mixta se forman fundamentalmente láctico, acético y succínico,
además de etanol, H2 y CO2. En la vía del butanodiol se forman cantidades menores de
ácido (acetato y succinato) y los principales productos son el butanodiol, etanol, H 2 y CO2.
El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo),
que se utiliza para visualizar la producción de ácidos por la vía de fermentación ácido
mixta.
Interpretación
DESCARBOXILASAS
Colonias Microorganismos
Negras – eventualmente con la zona LD-positivos: Salmonella y Edwardsiella.
limítrofe visible en tono violeta
Violeta LD-positivos y H2S negativos: Escherichia,
Klebsiella, Hafnia.
Amarillo sin alteración de color: crecimiento LD-negativos: Shigella, Citrobacter,
retardado. Enterobacter, Proteus.
VOGES-PROSKAUER
Interpretación
MOTILIDAD Y H2S
Medio de cultivo de ensayo para comprobar la formación del sulfuro, la formación de indol
y motilidad en el marco del diagnóstico de entero bacteriaceas. El medio de cultivo es
ampliamente recomendado para el análisis de alimentos.
La motilidad se pone de manifiesto de turbidez difusa del medio de cultivo alrededor del
canal de la picadura. La motilidad se caracteriza por el crecimiento producido
exclusivamente a lo largo de dicho canal. La formación de H 2S se reconoce por el
ennegrecimiento de la zona de crecimiento, la demostración del indol se demostrará
mediante el reactivo según Kovacs. La formación del indol da lugar a una coloración rojo-
púrpura de la capa del reactivo.
Sirve para determinar si un organismo es móvil o inmóvil. Las bacterias tienen movilidad
por medio de sus flagelos que se encuentran principalmente entre los bacilos aunque
existen algunas formas de cocos móviles.
Entre las enterobacterias, la movilidad nos permite diferenciar el género Klebsiella (-) de
las restantes que suelen ser movilidad (+).
Dentro del género Bacillus, nos permite diferenciar B.anthracis (-) de otras especies
generalmente (+).
CAT ALASA
El peróxido de hidrógeno se forma como uno de los productos finales del metabolismo
oxidativo aeróbico de los hidratos de carbono. Si se deja acumular, el peróxido de
hidrógeno es letal para las células bacterianas. La catalasa transforma el peróxido de
hidrógeno en agua y oxígeno de acuerdo a la siguiente reacción:
Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes géneros:
Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+).
Bacillus (+) de Clostridium (-).
Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+, con las excepciones de
C.pyogenes y C.haemolyticum, ambos -) de Erysipelothrix (-)
Interpretación
UREASA
Colonias Microorganismos
Rojo-fucsia Urea – positivos:
Amarillo Proteus, Klebsiella, Enterobacter,
Citrobacter.
Urea – negativos:
Shigella, Salmonella, Escherichia,
Citrobacter, Enterobacter, Serratia,
Providencia.
GELATINAZA
Caldo Nitrato
La reacción negativa indica que no se ha producido degradación alguna del nitrito o que
este se ha reducido hasta nitrógeno o hasta amoniaco.
Este medio de cultivo contiene cloruro de lítio y telurito para la inhibición de la flora
acompañante, en tanto que el piruvato y la glicocola actúan favoreciendo selectivamente
el crecimiento de estafilococos.
Sobre el medio de cultivo, opaco por su contenido en yema de huevo, las colonias de
estafilococos muestran dos características diagnósticas por lipólisis y proteolisis, se
producen halos y anillos característicos y, debido a la reducción del telurito a teluro, se
desarrolla una colonia negra. La reacción con la yema de huevo y la reducción del telurito
se presentan con notable paralelismo con la coagulasa-positividad, y por tanto, pueden
utilizarse como índice de esta última.
Colonias Microorganismos
Negras, lustrosas, convexas, con borde Staphilococcus aureus.
extrecho blanquecino, rodeado por un halo
claro.
Negras, lustrosas, pero de forma irregular. Staphilococcus epidermis.
Crecimiento ocasional: muy pequeñas, Micrococcus.
pardas hasta negras, ausencia de halos de
clarificación.
Pardo-oscuras, mates, presencia a veces Bacillus.
de halos de clarificación.
Blancas sin halos de clarificación. Levaduras.
MacConkey
Este medio es ligeramente selectivo ya que la concentración de sales Biliares, que inhiben
el crecimiento de los microorganismos Gram positivos, es baja en relación con otros
medios similares. Se incluye también cristal violeta para inhibir el crecimiento de las
bacterias Gram positivas, especialmente estafilococos y enterococos.
LECTURA:
colonias lactosa (-): incoloras (= no hay fermentación de la Lactosa).
Salmonella, Shigella, Pseudomonas
Debido a los dos indicadores, azul de bromotimol y fucsina ácida, las colonias lactosa-
positivas muestran una expresiva diferencia cromática frente a las colonias lactosa-
negativas. Igual ocurre en el caso de colonias que fermentan lentamente la lactosa y más
fácilmente la sacarosa y la salicina, sustancias reaccionantes fácilmente fermentables, lo
que impide hallazgos de patógenos falsamente positivos. La combinación de tiosulfato,
como sustancia reaccionante, y una sal de hierro como indicador, da una coloración negra
a las colonias H2S positivas. Una mezcla de sales biliares inhiben a una gran parte de la
flora acompañante.
Endo-C Agar
Las placas con medio de cultivo son claras y casi incoloras. Si una placa con medio de
cultivo muestra, tras la solidificación, un tono rojo demasiado intenso, puede eliminarse
dicho exceso de rojo añadiendo algunas gotas de una solución recién preparada al 10%
de sulfito sódico anhidro.
Por la acción del oxigeno atmosférico y debido a la consiguiente oxidación del sulfito, el
medio de cultivo vertido en placas se vuelve paulatinamente rojo y, por lo tanto, inservible.
Incluso conservando en la oscuridad y a la temperatura de nevera, solo es utilizable
durante pocos días.
BIBLIOGRAFIA
http://bilbo.edu.uy/~microbio/identific02.html