Anda di halaman 1dari 4

DEFINISI

Uji toksisitas subkronis adalah uji ketoksikan suatu senyawa yang diberikan dengan dosis berulang pada hewan uji
tertentu, selama kurang dari tiga bulan. Uji ini ditujukan untuk mengungkapkan spectrum efek toksik senyawa uji
serta untuk memperlihatkan apakah spectrum efek toksik itu berkaitan dengan takaran dosis (Donatus, 2001)
Pengamatan dan pemerikasaan yang dilakukan dari uji ketoksikan subkronis meliputi :

1. Perubahan berat badan yang diperiksa paling tidak tujuh hari sekali.
2. Masukan makanan  untuk masing-masing hewan atau kelompok hewan yang diukur paling tidak tujuh hari
sekali.
3. Gejala kronis umum yang diamati setiap hari.
4. Pemeriksaan hematologi paling tidak diperiksa dua kali pada awal dan akhir uji coba.
5. Pemeriksaan kimia darah paling tidak dua kali pada awal dan akhir uji coba.
6. Analisis urin paling tidak sekali.
7. Pemeriksaan histopatologi organ pada akhir uji coba.

(Loomis, 1978)
Hasil uji ketoksikan subkronis akan memberikan informasi yang bermanfaat tentang efek utama senyawa uji dan
organ sasaran yang dipengaruhinya. Selain itu juga dapat diperoleh info tentang perkembangan efek toksik yang
lambat berkaitan dengan takaran yang tidak teramati pada uji ketoksikan akut. Kekerabatan antar kadar senyawa
pada darah dan jaringan terhadap perkembangan luka toksik dan keterbalikan efek toksik. (Donatus, 2001)
Tujuan utama dari uji ini adalah untuk mengungkapkan dosis tertinggi yang diberikan tanpa memberikan efek
merugikan serta untuk mengetahui pengaruh senyawa kimia terhadap badan dalam pemberian berulang (Eatau dan
Klaassen, 2001)
Pengamatan gejala toksis :

1. Pengamatan fisik, perilaku, saluran cerna, kulit dan bulu.


2. Berat badan hewan uji.
3. Asupan makan atau minuman untuk masing-masing hewan uji atau kelompok

hewan uji.

1. Pemeriksaan fungsi organ secara biokimia melalui analisis urin (bobot jenis, protein total, volume urin,
glukosa, bilirubin) dilakukan pada awal dan akhir uji.
2. Pengamatan gejala klinis diperiksa melalui pengamatan fisik dalam jangka waktu setelah pemejanan tiap
hari selama 30 hari.

Sasaran uji ini adalah hispatologi organ (organ-organ yang terkena efek toksik), gejala-gejala toksik, wujud efek
toksik (kekacauan biokimia, fungsional, dan struktural) serta sifat efek toksik. Selain itu juga batas keamanan
toksikologi terutama KETT.
Tata cara pelaksanaannya adalah:

1. Pemilihan hewan uji, dapat digunakan roden (tikus) dan nirroden (anjing), sebaiknya dipilih hewan uji
yang peka dan memiliki pola metabolisme terhadap senyawa uji yang semirip mungkin dengan manusia.
Disarankan paling tidak satu jenis hewan uji dewasa, sehat, baik jantan maupun betina. Jumlah yang
digunakan paling tidak 10 ekor untuk masing-masing jenis kelamin dalam setiap kelompok takaran dosis
yang diberikan.
2. Pengelompokan, minimal ada empat kelompok uji yaitu 3 kelompok dosis dan 1 kelompok kontrol negatif.
Hal ini disebabkan karena untuk regresi minimal digunakan 3 data sehingga dapat dianalisis hubungan
dosis dengan efek.
3. Takaran dosis, bergerak dari dosis yang sama sekali tida menimbulkan efek toksis sampai dengan dosis
yang betul-betul menimbulkan efek toksik yang nyata. Minimal digunakan 3 peringkat dosis degan syarat
dosis yang tetinggi sebisa mungkin tidak mematikan hewan uji tetapi memberi wujud efek toksik yang
jelas (nyata). Sedangkan dosis terendah yang digunakan setingkat dengan ED50-nya.
4. Pengamatan, berupa wujud efek toksik atau spektrumnya, semua jenis perubahan             harus diamati.

Analisis dan evaluasi hasil:


-                data berat badan , asupan makanan dan minuman serta gejala-gelajala klinis digunakan untuk
mengevaluasi status kesehatan dan perkembangan patologi hewan uji akibat sediaan uji
-                hematologi darah dan urin digunakan untuk mengevaluasi perubahan fungsional sistem organ sebagai
perwujudan efek toksik…

 KASUS

Efek subkronik 2,3,7,8- tetrachlorodibenzo-p-dioxin dan reversibilitas pada tikus jantan galur Sprague-Dawley.

 METODE

Tikus jantan galur Sprague-Dawley (berat 200-225 g) dibagi menjadi 7 kelompok ( 1 kelompok untuk kontrol, 6
kelompok untuk variasi dosis). Tikus dikandangkan secara individual dalam kandang stainless steel tertutup dan
diberi makan serta minum secukupnya. Suhu ruang yang dipakai 25 0C dan kelembaban yang tidak dikontrol.
Setelah waktu adaptasi satu minggu, semua hewan uji diberi dosis oral sekali setiap satu minggu selama 10 minggu
dengan dosis TCDD atau hanya diberi pelarut saja. Berat badan diukur setiap minggu dan jumlah kematian dicatat.
TCDD dilarutkan dalam minyak jagung : aseton (95:5) dan dipejankan sebanyak 4 ml/kg. Setiap dosis diberi
perlakuan dengan diinkubasi pada 0 ; 0,2 ; 2,3 ; 11.5 ; 35 ; 70 atau 115 µg/kg per minggu secara berturut-turut.
Satu setengah bagian dari tikus pada tiap kelompok dikorbankan pada minggu ke-10 (satu minggu setelah
pemberian dosis terkahir). Sedangkan tikus yang lainnya dikorbankan pada minggu ke-16. Liver kemudian
dipindahkan dan disimpan dalam suhu -80()C untuk analisis biokimia selanjutnya. Darah kemudian dikumpulkan dan
serumnya disimpan dengan dibekukan untuk determinasi triptofan dan TT4. Semua hewan dipuasakan selama 24
jam sebelum dikorbankan.
Fraksinasi Subselular
Liver yang dibekukan lalu dihomogenkan dengan Teflon-pestled Potter- Elvehjem homogenizer dalam tiga volume
sukrosa 0,25 M atau dalam 10 volume buffer potassium phosphate (20 mM, pH 7,0) dalam suhu 0-4 ()C. Semua
campuran disentrifugasi selama 30 menit sebanyak 10.000 putaran (L5-65 ultracentrifuge). Pellet dibuang dan
supernatannya disentrifugasi selama 1 jam pada 100.000 putaran. Hasil dari supernatan dianggapa sebagia fraksi
sitosol dan diukur aktivitas PEPCK-nya, sedangkan pellet yang disuspensikan kembali digunakan untuk determinasi
dari aktivitas EROD. Konsentrasi protein dalam homogenate dideterminasikan menggunakan metode biuret setelah
disolubilisasi dengan 5, 3 % asam kholat dan ultrasonikasi selama 10 menit. Protein di sitosol diukur dengan
menggunakan metode Bradford menggunakan bovine serum albumin standar. Pengukuran secara Spektrofotometri
dengan menggunakan Shimadzu UV16OU.
Aktivitas PEPCK
Aktivitas liver PEPCK dideterminasi dengan menggunakan deoxyguanosine 5’-diphosphate sebagai substrat
nukleotida. Supernatant sebanyak 50 µL aliquot digunakan untuk menentukan kandungan protein. Oksaloasetat
yang terbentuk selama reaksi enzimatik dideterminasi dengan reaksi reduksi malat dehidrogenase dengan adanya
NADH. Perubahan pada absorbansi diukur dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 340
nm. Blanko tidak berisi baik bikarbonat maupun karbon dioksida. Reaksi akan berlangsung selama 5 menit pada
230C.
Aktivitas TdO
Aktivitas TdO diukur berdasarkan Metzler et al. (Metzler et al., 1982). Sampel hati yang telah dibekukan
dihomogenasi dalam 10 volume buffer Kalium fosfat icecold (20 mM, pH 7,0) Frozen liver yang berisi 2.5 mM
triptofan dan 1.36 mg methemoglobin per 10 ml. Reaksi dilangsungkan pada suhu 370C selama 40 dan 80 menit dan
diakhiri dengan penambahan asam perklorat/etanol/air (1: 1: 1). Sampel standar berisi 200µL L-kynurenine 0,15
mM dan diujikan parallel selama 80 menit. Pembentukan derivate dye-azo diukur pada 560 nm. Aktivitas enzim
dikalkulasi berdasarkan absorbansi antara dua jangka waktu.
Triptofan
Serum triptofan dideterminasi dengan menggunakan HPLC. Serum disiapkan dari vial berisi darah dan diproteinasi
dengan penambahan 5% asam trikloroasetat. Setelah pengenceran dengan 0,01 M buffer asetat pH 4,3, lipid
diekstraksi dengan menggunakan kloroform dan supernatant diencerkan 140x dengan menggunakan fase  gerak
buffer asetat 0,01 M pH 4,3 dengan 30% methanol. 20 µL dari larutan ini diinjeksikan kedalam kolom fase terbalik
Zorbax C8 dari Shimadzu SCL 6-A HPLC yang dilengkapi dengan a RF-535 fluorometrik detector. Kecepatan aliran
sebesar 1.2 ml/mm at 30°C. larutan triptofan sebanyak 50 ml digunakan sebagai standar.
TT4
Serum TT4 diukur dengan menggunakan radioimmunoassay.
Aktivitas EROD
Aktivitas EROD di liver dideterminasi secara fluorometri berdasarkan Dutton dan Parkinson (Dutton and Parkinson,
1989). Konsentrasi protein mikrosom diukur 700 µL. Ethoxyresorufin ditambahkan pada sampel sebagai substrat.
Reaksi dimulai dengan penambahan 50 µL system NADPH regenerasi dan diinkubasi pada 37°C selama  1 jam.
Reaksi diakhiri dengan penambahan aseton icecold, blanko dipreparasi dengan penambahan aseton pada sistem
regenerasi NADPH. Sampel standar diinkubasi tanpa penambahan ethoxyresorutin  yang dipreparasi dengan
penambahan 5 dan 20 µL secara berturut-turut dari larutan resorufin 500 PM dalam etilen glikol. Setelah itu
disentrifugasi selama 2500 rpm selama 5 menit, fluoresensi supernatan diukur pada panjang gelombang 535 nm
(eksitasi) dan 585 nm (emisi) dengan florometer Shimadxu RF-594.
Analisis statistic
Data kelompok control dibandingkan dengan kelompok perlakuan TCDD dengan two-tailed Student’s t-test dengan
signifikasi P < 0.05.
Analisis data
PemejananTCDD dosis tinggi pada tikus selama 10 minggu menghasilkan gejala  dan kematian yang diharapkan.
Terjadi penghambatan peningkatan berat badan yang tergantung pada empat kelompok dosis tertinggi namun tidak
berefek pada 2  kelompok dosis terendah. Aktivitas TdO di hepar menurun pada 2 kelompok dosis tertinggi dengan
peningkatan jumlah serum triptofan. Respon dosis untuk aktivitas TdO dan level serum triptofan berbanding
terbalik. Aktivitas PEPCK hepatic yang tergantung dosis juga berkurang. Lebih lanjut penurunan respon dosis TdO
dan aktivitas PEPCK dan peningkatan konsentrasi serum triptofan sangat mirip dengan dosis-respon dari
penghambatan subkronik terhadap peningkatan berat badan. Aktivitas EROD diinduksi bahkan pada dosis terendah
TCDD dan induksi mencapai maksimum sebelum adanya tanda toksisitas subkronik terjadi. Serum TT4 juga terjadi
pengurangan dosis tergantung, tapi slope dan ED yang ditunjukkan pada dosis respon berbeda dengan kedua
induksi dari aktivitas EROD dan toksisitas subkronik berkaitan dengan efek biokimianya.
Setelah  recovery period selama 6 minggu , baik PPECK dan aktivitas TdO sama dengan level serum triptofan
kembali pada nilai kontrol meskipun demikian aktivitas EROD dan setum TT4 ditunjukkan dengan induksi dosis
tergantung dan pengurangan secara berturut-turut meskipun keduanya di geser ke kanan  sesuai dengan
toksikokinetik.
 Discussion

Studi toksisitas subkronik ini memberikan tambahan dukungan pada hipotesis bahwa toksisitas subkronik (multiple
dose) TCDD dalam berbagai cara, identik dengan toksisitas akut (dosis tunggal) ketika dosis dikoreksi untuk
farmakokinetik.
Dinyatakan secara berbeda, minus dosis kumulatif dari bagian dosis sudah dihilangkan (= dosis yang tersisa harus
disingkirkan = beban tubuh) sehingga menentukan toksisitas (Tabel 1). dan terkait biokimia efek TCDD seperti yang
disarankan oleh Rozman et al. (1993). Sebagai contoh, penghambatan kenaikan berat badan tidak terjadi sampai
total dosis sekitar 5-10 µg/kg tercapai (Gambar l), dimana pada dosis tunggal TCDD menyebabkan efek berat badan
yang signifikan (Seefeld et al., 1984; Stahl et al., 1992). Demikian pula, dalam mengurangi aktivitas PEPCK
(Gambar 3) dan TdO (Gambar 2) sama seperti dalam meningkatkan kadar serum triptofan menjadi nyata pada dosis
yang hampir identik (Weber et al., 1991a, b, c, 1992a; Rozman et al., 1991). Induksi aktivitas EROD didasarkan
pada percobaan dosis tunggal (Roth et al., 1988) atau mendekati dosis total sekitar 5-10 µg/kg TCDD setelah 10
minggu (Gambar 4). Setelah masa pemulihan 6 minggu (t ½=20 hari ), di mana 75%  TCDD di dalam tubuh setelah
10 minggu TCDD telah tereliminasi. Induksi aktivitas EROD bersifat reversible parsial  yang dinyatakan dengan
pergeseran kurva dosis-respons ke kanan (Gambar 4).
Kadar serum IT4 berkurang secara keseluruhan kecuali pada dosis TCDD yang terendah (Gambar 5). Dosis yang
dipilih untuk menimbulkan sebuah respon dosis, dalam hal ini efek dari TCDD tidak ideal. Hal tersebut jelas
menunjukkan bahwa tiga dosis tertinggi menyebabkan penurunan secara maksimal tingkat serum IT4. Oleh karena
itu, dosis-respons untuk efek ini harus dianggap antara 0,1 dan 10 µg / kg dari total dosis TCDD. Faktanya,
kekurangan dari reversibilitas efek total setelah 6 minggu pemulihan (Gambar 6) menunjukkan bahwa EDso untuk
dosis-respons ini lebih dekat dengan dosis kumulatif 1 µg/Kg. dimana efek ini sedikit reversible daripada induksi
aktivitas EROD activity. Aktivitas PEPCK and TdO cenderung menunjukkan ke arah reversibilitas setelah pemulihan
6 minggu, walaupun reversibilitas total tidak terjadi pada dosis kumulatif tertinggi yaitu sebesar 115 µg/kg TCDD.
Hal ini sesuai dengan pertimbangan pharmacokinetic yang mengasumsikan bahwa konstanta waktu paruh, untuk
pengobatan/cara penyembuhan ini sesuai pada dosis tunggal 12 µg/kg dari TCDD, dimana pada dosis terendah pada
kurva dosis-respon dapat menghambat aktivitas enzim (Weber et al., 199la,b,c, 1992a,b).
Sesuai dengan reversibilitas dari penurunan aktivitas TDO setelah pemberian dosis TCDD yang subkronik, kadar
serum tryptophan kembali mendekati nilai normal ketika akhir masa pemulihan 6 minggu.

 KESIMPULAN

Percobaan ini mendukung pernyataan dari Rozman et al. (1993) bahwa toksisitas  subchronik dari TCDD mengikuti
aturan Haber’s (Haber, 1924) and Druckrey’s (Druckrey and Kiipfmiiller, 1948) untuk kasus khusus dalam
toksikologi ketika dosis x waktu = konstanta toksisitas yang mendukung pertimbangan farmakokinetik yang tepat
dalam perhitungan.
DAFTAR PUSTAKA
Donatus, I.A., 2001, Toksikologi Dasar, Laboratorium Farmakologi dan Toksikologi, Fakultas Farmasi, UGM,
Yogyakarta
Loomis, T.A., 1978, Toksikologi Dasar, diterjemahkan oleh Imono Argo Donatos, Edisi III, IKIP Semarang Press,
Semarang
Eatau, D.L., and Klaassen, C.D., 2001, Principle of Toxicology, In Klaassen C.D. (Ed),Casarett and Doull’s
Toxicology : The Basic Science of Poison, 6th Ed., Mc. Graw Hill, New Yorks