I.

PENDAHULUAN

A. Tujuan percobaan:

- Untuk mengamplifikasi (perbanyakan) primer oligonukleotida

- Untuk melihat (visualisasi) hasil PCR

B. Kerangka Teori:

Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah metode untuk amplifikasi (perbanyakan)

primer oligonukleotida diarahkan secara enzimatik urutan DNA spesifik. Teknik ini mampu
memperbanyak sebuah urutan 105-106-kali lipat dari jumlah nanogram DNA template dalam
latar belakang besar pada sequence yang tidak relevan (misalnya dari total DNA genomik).
Sebuah prasyarat untuk memperbanyak urutan menggunakan PCR adalah memiliki
pengetahuan, urutan segmen unik yang mengapit DNA yang akan diamplifikasi, sehingga
oligonucleotides tertentu dapat diperoleh. Hal ini tidak perlu tahu apa-apa tentang urutan
intervening antara primer. Produk PCR diamplifikasi dari template DNA menggunakan DNA
polimerase stabil-panas dari Thermus aquaticus (Taq DNA polimerase) dan menggunakan
pengatur siklus termal otomatis (Perkin-Elmer/Cetus) untuk menempatkan reaksi sampai 30
atau lebih siklus denaturasi, anil primer, dan polimerisasi. Setelah amplifikasi dengan PCR,
produk ini dipisahkan dengan elektroforesis gel poliakrilamida dan secara langsung
divisualisasikan setelah pewarnaan dengan bromida etidium.

PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu teknik perbanyakan

(amplifikasi) potongan DNA secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah
primer oligonukleotida. Primer yang digunakan sebagai pembatas daerah yang diperbanyak
adalah DNA untai tunggal yang urutannya komplemen dengan DNA templatnya. Proses
tersebut mirip dengan proses replikasi DNA secara in vivo yang bersifat semi konservatif.

PCR memungkinkan adanya perbanyakan DNA antara dua primer, hanya di dalam
tabung reaksi, tanpa perlu memasukkannya ke dalam sel (in vivo). Pada proses PCR
dibutuhkan DNA untai ganda yang berfungsi sebagai cetakan (templat) yang mengandung
DNA-target (yang akan diamplifikasi) untuk pembentukan molekul DNA baru, enzim DNA
polimerase, deoksinukleosida trifosfat (dNTP), dan sepasang primer oligonukleotida. Pada
kondisi tertentu, kedua primer akan mengenali dan berikatan dengan untaian DNA
komplemennya yang terletak pada awal dan akhir fragmen DNA target, sehingga kedua
primer tersebut akan menyediakan gugus hidroksil bebas pada karbon 3’. Setelah kedua
primer menempel pada DNA templat, DNA polimerase mengkatalisis proses pemanjangan
kedua primer dengan menambahkan nukleotida yang komplemen dengan urutan nukleotida
templat. DNA polimerase mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester antara OH pada
karbon 3’ dengan gugus 5’ fosfat dNTP yang ditambahkan. Sehingga proses penambahan
dNTP yang dikatalisis oleh enzim DNA polimerase ini berlangsung dengan arah 5’→3’ dan
disebut reaksi polimerisasi. Enzim DNA polimerase hanya akan menambahkan dNTP yang
komplemen dengan nukleotida yang terdapat pada rantai DNA templat.

PCR melibatkan banyak siklus yang masing-masing terdiri dari tiga tahap berurutan,
yaitu pemisahan (denaturasi) rantai DNA templat, penempelan (annealing) pasangan primer
pada DNA target dan pemanjangan (extension) primer atau reaksi polimerisasi yang
dikaalisis oleh DNA polimerase.

B. Kegunaan

Polymerase Chain Reaction (PCR) dapat digunakan untuk:

1. amplifikasi urutan nukleotida.

2. menentukan kondisi urutan nukleotida suatu DNA yang mengalami mutasi.
3. bidang kedokteran forensik.
4. melacak asal-usul sesorang dengan membandingkan “finger print”.

B. Reagen Khusus

1. Pasangan primer oligonukleotida sintetik mengapit urutan yang akan diamplifikasi

2. Buffer PCR 5X (250 mM KCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,3, 7,5 mM MgCl2)
3. Campuran dari empat dNTP (dGTP, dATP, dTTP, dCTP) masing-masing sebesar 2,5
mM (ultra murni DNTP set, Pharmacia # 27-2035-01). DNTP campuran dibuat
dengan volume 10 mM larutan dari masing-masing empat dNTP terpisah yang
digabung.
4. Taq DNA Polymerase (AmpliTaqTM, Perkin-Elmer/Cetus)
5. Minyak mineral ringan
6. Akrilamida (grade elektroforesis)
7. N, N’-Methylenebisacrylamide (grade elektroforesis, Ultra-Pure/BRL, # 5516UB)
 8. Amonium persulfat (Ultra-Pure/BRL, # 5523UA)
9. TEMED (N, N, N’N ‘Tetramethylethylenediamine, Ultra-Murni / BRL, # 5524UB)

Komponen PCR lainnya:

1) Enzim DNA Polymerase

Dalam sejarahnya, PCR dilakukan dengan menggunakan Klenow fragment DNA Polimerase
I selama reaksi polimerisasinya. Enzime ini ternyata tidak aktif secara termal selama proses
denaturasi, sehingga peneliti harus menambahkan enzim di setiap siklusnya. Selain itu, enzim
ini hanya bisa dipakai untuk perpanjangan 200 bp dan hasilnya menjadi kurang spesifik.
Untuk mengatasi kekurangan tersebut, dalam perkembangannya kemudian dipakai enzim
Taq DNA polymerase yang memiliki keaktifan pada suhu tinggi. Oleh karenanya,
penambahan enzim tidak perlu dilakukan di setiap siklusnya, dan proses PCR dapat
dilakukan dalam satu mesin

2) Primer

Primer merupakan oligonukleotida pendek rantai tunggal yang mempunyai urutan

komplemen dengan DNA templat yang akan diperbanyak. Panjang primer berkisar antara 20-
30 basa. Untuk merancang urutan primer, perlu diketahui urutannukleotida pada awal dan
akhir DNA target. Primer oligonukleotida di sintesis menggunakan suatu alat yang disebut
DNA synthesizer.

3) Reagen lainnya

Selain enzim dan primer, terdapat juga komponen lain yang ikut menentukan keberhasilan
reaksi PCR. Komponen tersebut adalah dNTP untuk reaksi polimerisasi, dan buffer yang
mengandung MgCl2. Konsentrasi ion Mg2+dalam campuran reaksi merupakan hal yang sangat
kritis. Konsentrasi ion Mg2+ ini sangat mempengaruhi proses primer annealing, denaturasi,
spesifisitas produk, aktivitas enzim dan fidelitas reaksi.

Prinsip kerja
Prinsip kerja reaksi berantai polimerase

Secara prinsip, PCR merupakan proses yang diulang-ulang antara 20–30 kali siklus. Setiap
siklus terdiri atas tiga tahap. Berikut adalah tiga tahap bekerjanya PCR dalam satu siklus:

1. Tahap peleburan (melting) atau denaturasi. Pada tahap ini (berlangsung pada suhu
tinggi, 94–96 °C) ikatan hidrogen DNA terputus (denaturasi) dan DNA menjadi
berberkas tunggal. Biasanya pada tahap awal PCR tahap ini dilakukan agak lama
(sampai 5 menit) untuk memastikan semua berkas DNA terpisah. Pemisahan ini
menyebabkan DNA tidak stabil dan siap menjadi templat ("patokan") bagi primer.
Durasi tahap ini 1–2 menit.
2. Tahap penempelan atau annealing. Primer menempel pada bagian DNA templat yang
komplementer urutan basanya. Ini dilakukan pada suhu antara 45–60 °C. Penempelan
ini bersifat spesifik. Suhu yang tidak tepat menyebabkan tidak terjadinya penempelan
atau primer menempel di sembarang tempat. Durasi tahap ini 1–2 menit.
3. Tahap pemanjangan atau elongasi. Suhu untuk proses ini tergantung dari jenis DNA
polimerase (ditunjukkan oleh P pada gambar) yang dipakai. Dengan Taq-polimerase,
proses ini biasanya dilakukan pada suhu 76 °C. Durasi tahap ini biasanya 1 menit.

Lepas tahap 3, siklus diulang kembali mulai tahap 1. Akibat denaturasi dan renaturasi,
beberapa berkas baru (berwarna hijau) menjadi templat bagi primer lain. Akhirnya terdapat
berkas DNA yang panjangnya dibatasi oleh primer yang dipakai. Jumlah DNA yang
dihasilkan berlimpah karena penambahan terjadi secara eksponensial.
II. METODE

A. Alat:

Alat yang diperlukan untuk amplifikasi gen eNOS daerah ekson 7 dengan metode PCR
adalah:

-Micropipet dengan berbagai ukuran (ukuran 0,1-10µl, 10-100µl dan 100-1000µl)

-Pipet tip dengan berbagai ukuran

-Tabung PCR volume 0,2µl

-Tabung eppendorf 1,5 ml

-Rak tabung

-Mesin vortex

-Alat untuk spin (sentrifuge)

-Mesin PCR

B. Bahan:

Bahan-bahan yang diperlukan untuk PCR adalah suatu mix dari kit PCR yang terdiri dari:

-Buffer 10x MgCl2-Free

-Larutan MgCl2 25 mM

-PCR Nucleotide Mix (dNTP) 10mM

-Taq DNA Polymerase yang tergabung dalam PCR mix Green GoTaq (Promega)

-Primer upstream dan downstream dengan konsentrasi masing-masing 40 pmol yang

spesifik

-Sampel DNA genomic dan ddH2O

Sekuen oligonucleotide primer upstream dan downstream dapat dilihat pada tabel 1.

C. Cara Kerja:

Komposisi campuran dengan volume total 25ul yang digunakan saat melakukan PCR adalah I
DNA cetakan (template) serta primer oligonukleotida reverse (R) dan forward (F).

Kondisi PCR untuk masing-masing analisis

Tahap Denaturasi Awal 95ºC (5 menit)

Siklus PCR : 35

- Tahap Denaturasi 95ºC (45 detik)

- Tahap Annealing 65ºC (45 detik)
- Tahap Ekstensi 72ºC (45 detik)
Tahap Ekstensi Tambahan 72ºC (7 menit)
III. HASIL

Dengan menggunakan mesin dibawah ini kita dapat melihat hasil visualisasi
elektroforesis yang telah kita lakukan
 Hasil :

Gen yang dipakai yaitu TCF7L2 403 bp, gen tersebut merupakan gen pemicu
Diabetes Melitus. Apabila ada gen tersebut (muncul) maka sampel tersebut terkena Diabetes
Melitus. Apabila tidak muncul, sampel tersebut normal.

Hasil penyinaran dibawah lampu UV dapat dilihat berupa potongan pita-pita DNA,
yang mempunyai fragmen-fragmen. Pada hasil elektroforesis pada praktikum ini,
menunjukkan adanya garis pada semua sampel, yang menunjukkan bahwa semua sampel
menderita Diabetes Melitus.

Dari hasil visualisasi tersebut dapat disimpulkan bahwa keenam pasien (51, 52, 53,
54, 55, 56) positif terkena diabetes mellitus. Hal ini sesuai dengan pita-pita DNA hasil
elektroforesis dengan nomor sumuran dan jenis sampelnya yang sesuai dengan DNA marker
yang ada disebelah kiri sebagai penanda hasil uji positif (kontrol) yaitu 403 pasang basa.

IV. DISKUSI

PCR melibatkan banyak siklus yang masing-masing terdiri dari tiga tahap berurutan,
yaitu pemisahan (denaturasi) rantai DNA templat, penempelan (annealing) pasangan primer
pada DNA target dan pemanjangan (extension) primer atau reaksi polimerisasi yang
dikaalisis oleh DNA polimerase.

Keuntungan dan Kerugian Teknik PCR

Keuntungan teknik PCR
 1. Porgram PCR relatif lebih mudah dilaksanakan
2. Terdapat PCR mix solution pabrikan yang tidak memerlukan pencampuran oleh user
3. oligonuklueotide dapat dipesan langsung pada perusahaan penyedia primer PCR.
Kerugian teknik PCR
1. Selalu memerlukan suatu primer untuk menjalankan PCR
2. Diperlukan PCR mix
3. PCR sangat sensitif terhadap semua perlakuan yang tidak sesuai dengan protokol pada
saat pencampuran larutan thin wall
4. Akan lebih memerlukan waktu relatif lama untuk mengamplifikasi minimal 30-40
siklus