Anda di halaman 1dari 13
\Tinjauan Pustaka| Metode Deteksi Mikotoksin Romsyah Maryam Balai Penelitian Veteriner Abstrak Mikotoksin merupakan masalah yang sangat sulitditanggulangi, mengingat iklim di Indonesia sangat Kondusit bagi pertumbuhan kapang toksigenik seperti Aspergilius sp. dan Fusarium sp. Beberapa jenis mikotoksin seperti aflatoksin, fumonisin, okratoksin A, zearalenon, deoksinivalenol, dan woksin ‘2 dilaporkan banyak mengkontaminasi komoditas Pertanian seperti beras jagung, kacany-kacangan, dan hasil olahannya. Selain berbahaya hagi Kesebatan manusia dan hewan, kontaminasi mikotoksin jugs memberikan dampak yang signifikan terhadap perekonomian, terutama di pasar global Metode deteksi berperan penting dalam menentukan apakah suatu Bahan pargan/pakan layak dikonsumsi dan tela memenubi persvaratan muty yang bertaku. Hasil analisis yang cepat dan akurat sangat membantu upays pengendaian masalah mikotoksin baik yang berkaitan dengan keschatan masyarakat, peteKonomisn, maupun dalam penentuan kebijakan. Metode dotcksi yang banyak diapfikasikan untuk analisis mikotoksin di antaranya visuaisas blue green yellow fluorescence (BGYE), thin layer chromatography (TLC), high performance liguid chromatography (HPLC), gas chromazography (GC), gas chromatography / liquid chromatography mass spectromenry (GCLC-MS), fuorimetn, dan immugroassay. Di samping itu, metode imunohistokimia dapat digunakan untuk mengetabui gejala rikotoksikosis baik pada manusia maupun hewan, Setiap metode memiiki kelebioan dan kekurangan, serta tingkat akarasi yang berbede-beda, Och karena itu, pemilihan metode disesuaikan pada tyjuan dan kepentingan analists yang , dan FB) dengan ESI sen- sitivitasnya meningkat- menjadi 250 py. Sinyal molekul ion (M°E1)’ terlihat pada m/= 722 untuk FB), 706 untuk FB; dan FB3.”” LC-MS terutama yang menggunakan tekanan lmosfir telah digunskan untuk penentuan dan identi- fikasi trikotesen, termasuk DON pada konsentrasi rendah.” Analisis mikotoksin fusarium pada serealia, aflatoksin pada kacang tanah semakin madah dilaku- kan. Oleh kerena selektivitas LC-MS yang tinggi, identifikasi dan kuantifikasi dapat dilakukan dengan jumiah sampel yang sedikit dan tahapan preparasi yang minimal Keunggulan dan kelemahan HPLC Metode HPLC mempunyai beberapa keunggulan di- bandingkan dengan metode Iainnya, yaitu dapat men- deteksi berbagai jenis mikotoksin secara_texpisah, baik Kualitatif maupun kuantitatif dengan tingkat akurasi dan presisi, serta spesifisitas dan sensitivitas| vang tinggi. Untuk senyawa dengan sensitivitas rendah dapat ditingkatkan melalui derivatisasi_pra-kolom atau pasca-kolom. Namun demikian, metode HPLC juga memiliki kelemahan, di antaranya membutuhkan proses preparasi yang lama dan tingkat kemurnian sampel yang tinggi sehingga diburuhkan pemumian (cleanup). Selain itu, deteksi dengan HPLC membutuh- kon reagen dengan tingkat kemurnian tinggi (HPLC grade), dan instrumentasi yang mahal, serta operator yang terlatihy Gas Chromatography (GC) Metode GC telah dikembangkan untuk mendeteksi berbagai jenis mikotoksin, terutama yang dihasilkan oleh kapang Fusarivn sp Analit yang akan dideteksi dengan GC harus mudah menguap atau dibuat menjadi senyawa yang mudah menguap melalui proses derivatisasi sebelum. dimasukkan ke dalam kolom. Dengan adanya gas pembawa (carrier gas), sampel diclusi melalui kolom kapiler sehingga terjadi interaksi antara analit yang terdapat dalam sampet dan cairan fasa diam. Di dalam kolom ini selanjutnya terjadi pemisahan antara analit dan matriks lain yang terdapat dalam sampel. Dengan detektor yang. sesuai, analit dapat terdeteksi sebagai puncak (peak) yang diketahui jenis dan jumtahnya berdasarkan wakt retensi (RT) dan areanya dibendingkan dengan standar acuan, Analisis mikotoksin dengan GC umumaya meng. gunakan kolom kapiler dengan fasa diam diffnil dimetil polisitoksan, Pemisahan yang terjadi sangat ipengaruhi oleh pengataran suhu kolom. Sebagai gas pembawa umumnya digunakan gas mulia seperti helium, argon, hidrogen, dan nitrogen. Berbagai miko toksin dapat dideteksi dengan GC, karena dapat me~ nguap dengan mudah setelah diderivatisasi sehingwa digunakan secara rutin, Mikotoksin fusarium seperti trikotesen B dan zearalenon dapat dipisahkan dan di- ddeteksi secara bersamaan dalam waktu 15-50 menit. Metode GC juga dapat digunakan untuk mendeteksi patulin dan fumonisin. GC lebih banyak digunakan terutama untuk mendeteksi senyawa trikotesen dalam bentuk derivatif trimetilsilil, pentafluoropropionil, heplafluorobutiril, dan trifluoroasetil dengan electron captured dereetor (ECD), atau flame ionised detector (FID), MS, atau tandem MS-MS. Pemilihan pereaksi penderivatisasi bergantung pada jenis trikotesen yang. akan dianalisis dan metode deteksi yang digunakan, Gugus karbonil terkonjugasi membuat trikotesen tipe B sensitif terhadap ECD, sementara trikotesen tipe A memberikan respon sensitif dengan perlakuan fluoroasetilasi. Derivatisasi trikotesen tipe B trimetil- silil lebih selektif dibandingkan dengan Muoroase- tilasi dan heptafluorobutiril, atau pentafluoropropio- nilimidazol.”' Eter trimetilsilil dibuat dengan men- derivatisasi seluruh gugus hidroksil dengan pereaksi N,O-bis (trimetilsitil) asetamid, trimetilkhlorosilan, dan trimetilsilitimidazol. Derivatisasi yang. tidak sempurna dapat menghasilkan peak ganda pada deteksi tunggal trikotesen tipe B. Masalah ini dapat dikendalikan dengan menggunakan penderivatisasi campuran seperti TRI-SIL TBT" dan Sylon BTZ yang mengandung trimetilsililimidazole (40 + 5%), N.O- bis (trimetilsili!) asetamid (35 + Kblorosilan (25 + 5%) ), dan trimett! Electron captured detector (ECD) Detektor ini paling banyak digunakan untuk men- deteksi_ mikotoksin, terutama yang memiliki gugus clektrofilik, Untuk mikotoksin yang tidak mengandung gugus elekrofilik diperlukan derivatisasi untuk me- ningkatkan sensitivitas. Dengan “Ni (radioaktif dengan emisi sinar {) elekiron dimasukkan ke dalam gas Lt Kes Iron Vol7, No.2, 2007 12-08 pembawa sehingga dihasilkan arus yang konstan jika tidak ada sampel. Jika di dalam’ sampel terdapat senyawa yang dapat menangkap elektron, maka arus akan turin sesuai dengan jumlah senyawa tersebut Senyawa dengan gugus elektronegatif yang tinggi (halogen dan gugus nitro) dapat dengan mudah terdeteksi, namun senyawa hidrokarbon, amina dan alkohol tidak dapat terdeteksi dengan ECD. Derivatisasi sangat penting, terutama untuk trikotesen A yang biasanya melalui fluoroasilasi, sedangkan untuk trikotesen B diperlukan Tri-Sil- TBT untuk mengurangi background, Pada serealia, deteksi trikotesen A dan B dapat dilakukan secara simultan dengan menggunakan GC-FCD,” sedangkan deteksi patulin dalam jus apel dilakukan -melalut derivatisasi dengan heptafluorobutirat (limit deteksi < 10 ug/L)." Bahan penderivatisasi Iainnya yang banyak digunakan yaitu trimetilsilil (TMS). Gambar 6 adalah contoh pemisahan dan deteksi mikotoksin fusarium pada GC-ECD. mbar 6. Pemisahan dan deteksi mikotoksin fusarium pada GC-ECD” GC-MS Perpaduan GC dengan MS (GC-MS) merupakan metode deteksi yang sangat_memuaskan, terutama untuk identifikasi dan kuantifikasi senyawa, Fragment massa yang dihasilkan dapat memberikan informasi struktur dari senyawa yang dideteksi. Pada GC-MS modem, kecepatan alir diatur melalui interface yang terhubung dengan komputer. Setelah pemisahan pada kolom GC, sampel sclanjutnya menjalani proses ionisasi. Electron impact ionisation (El) dan chemical ionisation (CV) merupakan metode yang banyak digunakan untuk ionisasi dan fragmentasi sampel. Pada El digunakan elektron yang diemisikan oleh filamen tungsten pada 70 eV. Pada Cl Gigunakan gas reaktif (seperti metana, NHs) yang, 19 ‘menghasitkan rangkaian reaksi dengan fragmentasi rendah, schingga CI disebut juga metode ionisasi rendah, Quadrupole mass filter inerupakan salah satu penganalisis massa yang umum digunakan, Filter ini memiliki kecepatan scanning yang tinggi, samun sensitivitasnya rendah, Pada rasio massa/muatan (m/2) yang sesuai, ion-ion dilewatkan melalui suatu medan magnet yang dihasitkan oleh quadrupole. Pada instr men fokus ganda (double focusing instrument), ion dilewatkan pada suatu medan magnet (dispersing) dan clektrostatik (focusing) sehingga diperolch hasil analisis yang sangat memuaskan, Namun demikian, instrumen ini sangat mahal dan sulit dioperasikan Dengan GC-MS trikotesen A dan B dapat didetcksi sebagai derivat heptatrifluoro butirat"® atau derivat trimetilsilil (TMS), sedangkan patulin dideteksi sebagai tri metilsilileter atau heptafluorobutirat untuk meningkatkan volatilitas.”” Immunoassay Pada awal perkembangannya, immunoassay hanya digunakan untuk mendiagnosis penyakit. Kemudian metode ini dikembangkan untuk mendeteksipen- ‘cemar, seperti: halnya mikotoksin.“" Prinsip deteksi immunoassay berdasarkan pada interaksi antara antigen dan antibodi, Ada beberapa macam metode deteksi immunoassay, di antaranya radio immunoassay (RIA) dan enzyme linked inmu- nosorbent assay (ELISA). Radio immunoassay (RIA) Metode ini menggunakan radio isotop sebagai label, yang dalam hal ini antibodi, antigen (toksin) yang dilabel, dan ekstrak sampel diinkubasi secara’ber- samaan, Antigen berlabel akan berkompetisi dengan antigen dari sampel (tidak berlabel) untuk berikatan dengan antibodi." Konsentrasi mikotoksin ditentukan dengan ekstrapolasi dari kurva standar (plot antara rasio miktoksin bebas dan yang terikat vs konsentrasi mikotoksin yang tidak dilabel). Metode RIA. sangat akurat, namun karena sifat radioaktif’ yang dapat membahayakan, maka penggunaannya di labora- torium sangat terbatas, Enzyme linked-immunosorbent assay (ELISA) Untuk analisis rutin, ELISA lebih banyak digunakan daripada RIA karena tidak menggunakan bahan ber- bahaya dan memiliki sensitivitas yang setara dengan RIA. ELISA yang menggunakan antibodi spesifik 20 diperoleh melalui rangkaian proses, seperti sintesis| imunogen, imunisasi ewan, isolasi, dan karak- terisasi antibod Ada dua tipe ELISA yang seting digunakan untuk mendeteksi mikotoksin, yaitu ELISA kompe- titif langsung (direct competitive ELISA) dan kon petitif tidak langsung (indirect competitive ELISA). Pada ELISA kompetitif Iangsung, antibodi di- lapiskan pada plat ELISA. Sampel’standar dicampur dengan toksin-enzim konjugat, kemudian dimasukkan ke dalam sumuran yang. sudah dilapisi antibodi, se- hingga terjadi Kompetisi antara standar dan mikotoksin dela sampel untuk berikatan dengan antibodi. Deng; penambshan substrat, ikatan antigen-enzim konjugat- antibodi akan memberikan warna yang dibaca pada ELISA reader (spektrofotometer) pada panjang, gelombang tertentu (Gambar 6a). Konsentrasi miko- heed Beacons fama ests ona ea abe s @ Gambar 6, Mekanisme LISA langsung (a) dan ELISA tak lan Aflatoksin sebagai mikotoksin_yang_termasuk senyawa karsinogen Grup 1A telah menjadi perhatian dunia. Oleh Karenanya, metode ELISA merupakan untuk mendeteksi cemaran aflatoksin banyak dikembang- kan dan tersedia di pasaran. Tabel 3 menunjukkan bederapa contoh kit immunoassay untuk mendeteksi aflatoksin yang dapat diperoleh secara komersial Metode ELISA untuk mendeteksi DON dapat dilakukan secara langsung, namun sensitivitasnya tendah (LOD = 20 - 300 ng/g). Metode ELISA yang paling sensitif untuk deteksi 3-asetil DON dengan toksin ditentukan dengan ekstrapolasi kurva standar (plot antara % inhibisi us konsentrasi Pada ELISA kompetitif tidak langsung, plat di- lapisi dengan antigen yaitu toksin-protein konjugat. Antibodi dan sampetistandar diinkubasi secara ber samaan, kemudian dimasukkan ke dalam sumuran pada plat yang berisi antigen. Seperti halnya ELISA Kompetitif langsung, kompetisi akan terjadi antara standar dan mikotoksin dalam sampel untuk ber- ikatan dengan antibod, Setelah pencucian, ditambah- kan antibodi sekunder yang dilabel dengan enzim, Adanya reaksi kompleks antara antigen-antibodi akan memberikan wama setelah penambahian substrat, yang dapat diukur dengan menggunakan ELISA reader (Spektrofotometer) (Gambar 60). LOD 03-1 ng/g, membutubkan asetilasi sebelum penentuan DON. Dengan demikian, hasilnya sangat bergantung pada jumlah DON dan derivatif asetiInya. Akurasi_ metode immunoassay ini sangat terbatas, arena adanya reaksi silang dengan senyawa-senyawa yang memiliki struktur inti serupa dengan DON." Studi komparatif menunjukkan adanya kesulitan untuk menentukan DON dalam pelarut organik muri (CV 21%). Seain itu, terjedi_kesalahan estimasi karena adanya senyawa pengganggu. 8k! Ke Indo Vol7, No 1-2. 2007: Tabel 3. Komersial /mmumoassay kit untuk aflatoksin Terk ‘ral Tees AlateaeP BI, B3. G1. G2, Afni cofanm Mi AgriQuick Bip Ai column AflaSereen BIB2.GI.MI_ ELISA. tires anw20 Ble,Gl — FLSAGp Milo BIBAGl | FLSAcup INDEXX-APE Bhbacl ELISA, inirovels CITE-Probeafiaoxin—81,82,G1 ELISA probe EZSCREIN.sfatonm BLDG] FLISA. cand Total aflatoxins BI, B2, G1, G2 Afinity coluran Aflatoxin M1 MI Asfinity column Aflatoxin test ELISA microwells Aflatoxin Mi MI ELISA Adsorpsiselektit Adsorpsi selekti Minicolumn B1.B2.G1, BILB2. GILG? BILB2. Gi, G2 HV minicolumn Sarnber: Lee (1959) Metode ELISA untuk mendeteksi fimonisin telah di- kembangkan oleh Azcona-Olivera et af." dan Yeung et al dengan menggunakan antibodi_monoklonal spesifik terhadap FB)-toksin kolera (FB;-CT), Metode ini dapat digunakan untuk mendeteksi cemaran fumo- nisin dalam berbagai jenis sampel. Keunggulan dan Kelemahan ELISA ELISA merupakan metode yang sensitif, spesifik, cepat, mudah dan ekonomis. Metode ini dikembangkan dengan mengguniakan antibodi_ poliktonal IgG, IgM dan IgY dengan sensitivitas yang tinggi, atau anti- bedi monoklonal untuk mendapatkan spesifisitas yang tinggi.”® Dengan metode ini, sejumlah sampel dapat dideteksi dalam waktu yang bersamaan ( >S0 ‘sampel) dengan menggunakan sedikit reagen Beberapa kelemahan dari metode deteksi ELISA yaitu akurasi yang sangat terbatas karena adanya reaksi silang dengan senyawa-senyawa yang me- miliki struktar inti sama.®* Dengan adanya senyawa pengganggu, dapat terjadi kesalahan estimasi sehingga hasil yang diperoleh lebih besar dibandingkan dengan deteksi menggunakan HPLC dan GC" Selain itu, dengan metode ELISA sulit menentukan konsentrasi analit dalam pelarut organik murni (CV 21°%)." ELISA, a1 “TOD GP) Apliker (min’sampel Oey Fluorometer, HPLC 2 5 Fluorometer, HPLC 1 R Sesnikuansitatif (visua, uanitaif Gostrumental) 20 4 + 10 4 te 3 4s Instrumental, somikuantiaitf 20 3 + 2» 7 + 1 30 Visual (UV), serikuantiatf

Anda mungkin juga menyukai