NAMA : HERISTIANA PRATIWI

NPM : 260110080090

SPEKTROFOTOMETER UV-Vis

A. PRINSIP
Spektrofotometri UV-Vis adalah anggota teknik analisis spektroskopik yang
menggunakan sumber radiasi elektromagnetik unltrafiolet dekat (190 – 380 nm) dan
sinar tampak (380 -780 nm) dengan memakai instrumentasi spektrofotometer.
Radiasi ultaviolet jauh (100-190 nm) tidak dipakai sebab dareah tersebut diabsorbsi
oleh udara. Ada kalanya spektrofotometer UV-Vis yang beredar di pasaran
memberikan rentang pengukuran panjang gelombang 190 – 1100 nm. Hal ini perlu
diperhatikan karena daerah diatas 780 nm merupakan daerah radiasi inframerah.
Oleh karena itu pengukuran yang dilakukan pada daerah panjang gelombang diatas
780 nm harus menggunakan detektor yang sensitif terhadap radiasi inframerah.
Prinsip dari spektrofotometer UV-Vis adalah ketika suatu molekul diberikan
suatu energi berupa radiasi sinar ultraviolet dan sinar tampak yang cukup pada
panjang gelombang tertentu maka akan terjadi transisi elektronik. Dengan demikian
spektra ultraviolet dan spektra tampak sebagai spektra elektronik. Keadaan energi
yang paling rendah disebut keadaan dasar (ground state). Transisi-transisi elektronik
akan meningkatkan energi molekuler dari keadaan dasar ke satu atau lebih tingkat
energi tereksitasi. Jika suatu molekul sederhana dikenakan radiasi elektromagnetik
maka molekul tersebut akan menyerap rradiasi elektromagnetik yang energinya
sesuai. Interaksi antara molekul dengan radiasi elektromagnetik ini akan
meningkatkan energi potensial elektron pada tingkat keadaan tereksitasi. Ada tiga
macam proses penyerapan energi ultraviolet dan sinar tampak yaitu :
1. Penyerapan oleh transisi elektron ikatan dan antiikatan (π, σ, n)
2. Penyerapan oleh transisi elektron d dan f
3. Penyerapan oleh perpindahan muatan

B. PARAMETER KUALITATIF
Analisis kualitatif d engan menggunakan spektrofotometer UV-Vis hanya dipakai
untuk data sekunder atau data pendukung. [ada analisis kualitatif dengan metode
spektrofotometer UV-Vis terdapat dua hal yang dapat ditentukan yaitu :
Pemeriksaan kemurnian spectrum UV-Vis
Penentuan panjang gelombang maksimum (λmax).

Selain kedua hal tersebut, ada parameter lain yang dapat diperoleh dalam
analisis dengan metode spektrofotometer UV-Vis yaitu efek pH, intensitas dan
pelarut dimana kesemuanya dapat dibandingkan dengan data yang sudah
dipublikasikan (published data).

Pada pemeriksaan kemurnian spektrum UV-Vis dilakukan perbandingan

kemiripan spektrum UV-Vis zat yang ditentukan dengan refrence sandard dengan
melihat harga MF (Match Factor) atau faktor kecocokan sebagaimana dirumuskan :

 
  
 

  


       

     

Dimana :

X = absorban spektrum pertama

Y = absorban spektrum kedua

n = banyaknya tempat penentuan

harga MFR = 900 – 1000 menunjukkan bahwakedua spektra identik sedangkan

harga MF < 900 menunjukkan bahwa kedua spektra tidak identik. Walaupun kedua
spektra UV-Vis identik, belum tenty kedua spektra UV-Vis tersebut diberikan oleh
molekul yang sama sebab spektra UV-Vis sangat tidak bergantung pada struktur
molekul akan tetapi bergantung pada gugus molekul yang mengabsorbsi radiasi UV-
Vis (struktur elektronik molekul). Pada penentuan panjang gelombang didasarkan
atas perhitungan pergeseran panjang gelombang maksimum karena adanya
penambahan gugus pada sistem kromofor induk. Ada beberapa macam pergeseran
diantaranya :

• Bathokromik, pergeseran ke panjang gelombang yang lebih tinggi dengan

energi yang lebih rendah.
• Hypsokromik (pergeseran biru), pergeseran ke panjang gelombang yang lebih
pendek.
• Hyperkromik, peningkatan absoritivitas molar.
• Hypokromik, reduksi absortivitas molar.
Ada beberapa alasan mengapa harus menggunakan panjang gelombang
serapan maksimum, yaitu :
• Pada panjang gelombang serapan maksimum, kepekaannya juga
maksimal karena pada panjang gelombang maksimal tersebut
perubahan absorbansi untuk setiao satuan konsentrasi adalah paling
besar
• Disekitar panjang gelombang maksimum, bentuk kurva absorbansi
datar dan pada kondisi tersebut hukum lambert beer akan terpenuhi
 • Jika dilakukan pengukuran ulang maka kesalahan yang disebabkan oleh
pemanasan ulang panjang gelombang akan keccil sekali, ketika
digunakan panjang gelombang serapan maksimum.

C. PARAMETER KUANTITATIF
Dalam aspek kuantitatif suatu berkas radiasi dikenakan pada cuplikan (larutan
sampel) dan intensitas sinar radiasi yang diteruskan diukur besarnya. Radiasi yang
diserap oelh cuplikan ditentukan dengan membandingkan intensitas sinar yang
diteruskan dengan intensitas sinar yang diserap jika tidak ada spesies penyerap
lainnya. Intensitas atau kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton
yang melalui satu satuan luas penampang per detik. Serapan dapat terjadi jika foton
atau radiasi yang mengenai cuplikan memiliki energi yang sama dengan energi yang
dibutuhkan yntuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga. Kekuatan radiasi juga
mengalami penurunan dengan adanya penghamburan dan pemantulan cahaya akan
tetapi penurunan karena hal ini sangat kecil dibandingkan dengan proses
penyerapan.
Berdasarkan hukum Lambert-Beer, hubungan antara transmitan atau absorban
terhadap intensitas radiasi atau konsentrasi zat yang dianalisis dan tebal larutan
yang mengabsorbsi sebagai :

     



  !"  # $ %

Dimana :
T = persen transmitan
Io = intensitas radiasi yang datang
It = intensitas radiasi yang diteruskan
ε = absorbansi molar (Lt.mol-1cm-1)
c = konsentrasi (mol Lt-1)
b = tebal larutan (cm)
A = absorban
Absorbtivitas (a) merupakan suatu konstanta yang tidak tergantung pada
konsentrasi, tebal kuvet dan intensitas radiasi yang mengenai larutan sampel.
Absorbtivitas tergantung pada suhu, pelarut, struktur molekul, dan panjang
gelombang radiasi. Satuan a ditentukan oleh satuan-satuan b dan c. Jika satuan c
dalam molar (M) maka absorbtivitas disebut absorptivitas molar yang disimbolkan
dengan ε dengan satuan M-1cm-1 atau liter.mol-1cm-1. Jika c dinyatakan dengan
')
persen berat/volume (g/100ml) maka absorbtivitas dapat ditulis dengan &'( dan
')
seringkali ditulis dengan '( .
 ')
Hubungan antara nilai &'( dengan absorbtivitas molar (ε) adalah sebagai
berikut :
') +,
#   &'( *  '-
Pada Hukum Lambert-Beer ada beberapa pembatasan yaitu :
1. Sinar yang digunakan dianggap monokromatis
2. Penyerapan terjadi dalam suatu volume yang mempunyai yang
mempunyai penampang luas sama
3. Senyawa yang menyerap dalam larutan tersebut tidak bergantung
terhadap yang lain dalam larutan tersebut
4. Tidak terjadi peristiwa fluoresensi dan sosforisensi
Analisis kuantitatif dengan metode spektrofotometri UV-Vis da[at digolongkan
atas 3 macam pelaksanaan, yaitu :
- Analisis kuantitatif zat tunggal (satu komponen)
Analisis kuantitatif zat tunggal dilakukan pengukuran harga A pada panjang
gelombang maksimum atau dilakukan pengukuran %T pada panjang
gelombang minimum. Alasan dilakukan pengukuran pada panjang gelombang
minimum adalah perubahan absorban untuk setiap satuan konsentrasi
adalah paling besar pada panjang gelombang maksimum, sehingga akan
diperoleh kepekaan analisis yang maksimal. Disamping itu pita serapan di
sekitar panjang gelombang maksimal datar dan pengukuran ulang dengan
kesalahan yang kecil dengan demikian akan memenuhi hukum Lambert-Beer.
Ada 4 cara pelaksanaan analisis kuantitatif zat tunggal.
Pertama. Dengan mebandingkan absorban atau persen transmitan yang
dianalisis dengan reference standard pada panjang gelombang maksimal.
Persyaratannya pembacaan nilai absorban sampel dan reference standard
tidak jauh berbeda.
Kedua. Dengan memakai kurfa baku dari reference standard dengan pelarut
tertentu pada panjang gelombang maksimum. Dibuat grafik sistem koordinat
Cartesian dimana sebagai ordinat adalah absorban dan sebagai absis adalah
konsentrasi.
')
Ketiga. Dengan jalan menghitung absorbansi larutan sampel (&'( , λmax)
pada pelarut tertentu dan dibandingkan dengan absorbansi zat yang
dianalisis yang terterap pada buku resmi.
Keempat. Dengan memakai perhitungan nilai ekstingsi molar (absorbansi
molar ε) sama dengan cara yang ketiga hanya saja pada perhitungan
absorbansi molar lebih tepat karena melibatkan massa molekul relati (Mr).
')
#   &'(  *
. '

- Analisis kuantitatif zat campuran (dua komponen)

Bila diinginkan pengukuran 2 buah senyawa secara bersamaan secara
spektrofotometri maka dapat dilakukan pada panjang gelombang yang mana
 masing-masing komponen tidak saling mengganggu atau gangguan dari
kompinen yang lain paling kecil. Dua buah kromofor yang berbeda akan
mempunyai kekuatan absorbsi cahaya yang berbeda pula pada satu daerah
panjang gelombang. Pengukuran dilakukan pada masing-masing larutan pada
dua panjang gelombang, sehingga diperoleh dua persamaan hubungan antara
absorbansi dengan konsentrasi masing-masing komponen dapat dihitung.
Pengukuran campuran 2 senyawa dilakukan baik pada panjang gelombang 1
dan panjang gelombbang 2, oleh karena itu absorbansi senyawa 1 dan
absorbansi senyawa 2 dapat dihitung secara matematis dengan menggunakan
persamaan :
Aλ1 = (a1c1)λ1 + (a2c2) λ1
Aλ2 = (a1c1)λ2 + (a2c2) λ2

- Analisis kuantitatif zat 3 campuran atau lebih (multi komponen)

Prinsip analisis 3 komponen atau lebih (multikomponen) dengan metode
spektrofotometer UV-Vis adalah kalibrasi tiap-tiap komponen dengan
menggunakan larutan standar. Dikenal dua macam larutan standar yaitu larutan
standar murni (pure standard) dan larutan standar campuran (mixed standard).
Proses perhitungannya ada dua macam yaitu cara konvensional dan cara
modern tergantung pada instrumen yang digunakan.

D. INSTRUMENTASI / KOMPONEN UTAMA DAN FUNGSINYA

Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorban suatu
sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Spektrofotometer merupakan gabungan
dari alat optik dan elektronika serta sifat-sifat kimia fisiknya dimana detektor yang
digunakan secara langsung dapat mengukur intensitas dari cahaya yang dipancarkan
(It) dan secara tidak lansung cahaya yang diabsorbsi (Ia), jadi tergantung pada
spektrum elektromagnetik yang diabsorb oleh benda. Tiap media akan menyerap
cahaya pada panjang gelombang tertentu tergantung pada senyawaan atau warna
terbentuk.
Dilihat dari sistem optiknya spektrofotometer dapat digolongkan dalam 3
macam yaitu :
Sistem optik radiasi berkas tunggal (single beam)
Sistem optik radiasi berkas ganda (double beam)
Sistem optik radiasi berkas terpisah (splitter beam)

Secara umum skema dari intrumentasi spektrofotometer UV-Vis adalah sebagai

berikut :
 Spektrofotometer UV-Vis berkas tunggal (single beam)

Spektrofotometer UV-Vis berkas ganda (double beam)

Komponen utama dari spektrofotometer UV-Vis adalah :

Sumber sinar
Sumber sinar yang umumnya digunakan ada 2 tipe yaitu hydrogen atau
deuterium discharge lamp dan incandescent filament lamp. Namun ada
juga yang menggunakan lampu wolfram atau tungsten lamp.
1. Lampu wolfram / tungstent lamp
Lampu ini mirip dengan bola lampu pijar biasa, daerah panjang
gelombang (l ) adalah 350-2200 nm. Di bawah kira-kira 350 nm,
keluaran lampu wolfram itu tidak memadai untuk
spektrofotometer dan harus digunakan sumber yang berbeda.
2. Lampu deuterium / lampu hidrogen
Lampu ini mengeluarkan cahaya padapanjang gelombang 200 –
360 nm. Terdiri dari semacam tabung yang didalamnya terdapat
anoda dan katoda. Tabung tersebut berisikan gas hidrogen atau
deuterium pada tekanan rendah sekitar 5 torr. Cahaya yang
dihasilkan oleh lampu deuterium 3 – 5 kali lebih terang dari
lampu hidrogen.
3. Incandescent filament lamp
Umumnya digunakan sebagai sumber sinar tampak. Pada
dasarnya terdiri dari logam filamen pijar biasanya tungsten yang
terbungkus dengan glass envelope. Hanya 15 % dari sinar yang
dihasilkan merupakan daerah sinar tampak. Sebagian besar
merupakan daerah sinar inframerah.
Monokromator
Monokromator merupakan suatu alat yang berfungsi untuk
mendispersikan sinar dari sinar polikromatik menjadi sinar
monokromatik. Ada dua macam tipe monokromator yaitu
monokromator prisma dan monokromator gratting (kisi difraksi).
o Monokromator prisma

o Monokromator gratting

Keuntungan menggunakan kisi difraksi :

- Dispersi sinar merata
- Dispersi lebih baik dengan ukuran pendispersi yang sama
- Dapat digunakan dalam seluruh jangkauan spectrum
Cahaya monokromatis ini dapat dipilih panjang gelombang tertentu
yang sesuai untuk kemudian dilewatkan melalui celah sempit yang
disebut slit. Ketelitian dari monokromator dipengaruhi juga oleh lebar
celah (slit width) yang dipakai.

Slit atau celah

Celah monokromator merupakan bagian pertama dan terakhir dari suatu
sistem optik monokromator pada spektrofotometer UV-Vis. Elah dibuat
dari logam yang kedua ujungnya diasah dengan cermat sehingga sama.
Lebar celah masuk dan lebar celah keluar harus sama yang dapat diatur
dengan memutar tombol mekanik atau diatur dengan sistem elektronik.

Filter optik
Filter optik berfungsi sebagai penyerap warn komplementer sehingga
sinar tampak yang diteruskan merupakan cahaya berwarna sesuai
dengan warna filter optik yang digunakan. Filter optik yang banyak
digunakan terdiri dari kaca berwarna. Dengan adanya filter optik sebagai
bagian dari monokromator akan dihasilkan pita cahaya sangat sempit
sehingga kepekaan analisisnya lebih tinggi. Dan lebih dari itu akan
mendapatkan cahaya yang hampir monokromatis sehingga memenuhi
hukum Lambert-Beer.

Cuvet
Merupakan sel sampel atau wadah sampel yang akan dianalisis. Ditinjau
dari pemakaiannya kuvet ada dua macam yaitu kuvet yang permanen
yang terbuat dari bahan gelas atau leburan silika dan kuvet disposible
untuk satu kali pemakaian yang terbuat dari teflon atau plastik. Untuk
sampel uap gas disediakan kuvet khusus yang tertutup rapat dengan
bentuk segi empat panjang dan silindris.

Detector
Merupakan salah satu bagian dari spektrofotometer UV-Vis yang penting.
Oleh sebab itu kualitas detektor akan menetukan kualitas
spektrofotometer UV-Vis. Fungsinya di dalam spektrofotometer UV-Vis
adalah mengubah sinyal radiasi yang diterima menjadi sinyal elektronik.
Adapun persyaratan detektor yang baik adalah sebagai berikut :
1) Harus mempunyai kepekaan yang tinggi terhadap radiasi yang
diterima, namun harus memberikan derau atau noise yang sangat
kecil
2) Harus mempunyai kemampuan untuk memberikan respon
terhadap radiasi pada daerah panjang gelombang yang lebar (UV-
Vis)
3) Harus memberikan respon radiasi dalam waktu yang serempak
4) Harus memberikan jaminan terhadap respon kuantitatif dan
sinyal radiasi yang diterima
5) Sinyal elektronik yang diteruskan oleh detektor harus dapat
diamplifikasikan oleh amplifier ke rekorder.

Macam-macam detektor yang digunakan ada 4 yaitu :

1) Detektor fotosel
2) Detektor foton tabung hampa
3) Detektor tabung penggandaan foton (Photomultiplier Tube)
4) Detektor Photo Diode-Array, yang merupakan detektor
dengan teknologi modern.
Amplifier
 Berfungsi sebagai penguat sinyal elektronik yang diteruskan oleh
detektor.
Display / read out
Berfungsi untuk menampilkan spektrum hasil pengukuran dengan
menggunakan metode spektrofotometri UV-Vis. Biasanya dibantu
dengan suatu perangkat lunak (software) sehingga dapat muncul
spektrum dari zat yang dianalisis.

E. PENGUKURAN SECARA UMUM

Pengukuran dilakukan biasanya dengan melarutkan sampel dengan pelarutnya.
Perlu diperhatikan dalam pemilihan pelarut. Spektrofotometer UV-Vis dapat
digunakan untuk menganalisis sampel berbentuk gas, padat dan larutan. Untuk
sampel yang berupa larutan perlu diperhatikan dalam hal pemilihan larutan. Ada
beberapa syarat yang harus dipenuhi dalam pemilihan pelarut diantaranya :
Pelarut yang dipakai tidak mengandung ikatan rangkap terkonjugasi pada
struktur molekulnya dan tidak berwarna.
Tidak terjadi interaksi dengan molekul senyawa yang akan dianalisis
Kemurniannya harus tinggi atau derajat untuk analisis

Pada umumnya pelarut yang sering digunakan adalah air, etano, sikloheksan
dan isopropanol. Namun perlu diperhatikan kembali bahwa absorpsi pelarut yang
dipakai di daerah UV-Vis. Hal lain yang perlu diperhatikan adalah polaritan pelarut
yang dipakai karena akan sangat berpengaruh terhadap pergeseran spektrum
molekul yang dianalisis. Untuk pengamatan absorban radiasi elektromagnetik oleh
molekul pada rentang pembacaan yang memenuhi syarat maka larutan yang diamati
harus dibiat sangat kecil kadarnya. Biasanya untuk pengamatan larutan kadar
diamati berkisar 2,5 – 50 ppm.

SPEKTROFOTOMETER INFRARED (IR)

A. PRINSIP
Dari namanya sudah bisa dimengerti bahwa spektrofotometri ini berdasar pada
penyerapan panjang gelombang infra merah. Cahaya infra merah terbagi menjadi
infra merah dekat, pertengahan, dan jauh. Infra merah pada spektrofotometri
adalah infra merah jauh dan pertengahan yang mempunyai panjang gelombang 2.5-
1000μm.
Berdasarkan pembagian daerah panjang gelombang pada Tabel 1 dan Gambar 2,
sinar infra merah dibagi atas tiga daerah, yaitu:
1. Daerah Infra Merah dekat.
2. Daerah Infra Merah pertengahan.
3. Daerah infra merah jauh
 Pada spektro IR meskipun bisa digunakan untuk analisa kuantitatif, namun
biasanya lebih kepada analisa kualitatif. Umumnya spektro IR digunakan untuk
mengidentifikasi gugus fungsi pada suatu senyawa, terutama senyawa organik.
Setiap serapan pada panjang gelombang tertentu menggambarkan adanya suatu
gugus fungsi spesifik.

Dasar Spektroskopi Infra Merah dikemukakan oleh Hooke dan didasarkan atas
senyawa yang terdiri atas dua atom atau diatom yang digambarkan dengan dua
buah bola yang saling terikat oleh pegas seperti tampak pada gambar disamping ini.
Jika pegas direntangkan atau ditekan pada jarak keseimbangan tersebut maka energi
potensial dari sistim tersebut akan naik.

Setiap senyawa pada keadaan tertentu telah mempunyai tiga macam gerak, yaitu :

1. Gerak Translasi, yaitu perpindahan dari satu titik ke titik lain.

2. Gerak Rotasi, yaitu berputar pada porosnya, dan
3. Gerak Vibrasi, yaitu bergetar pada tempatnya.

Bila ikatan bergetar, maka energi vibrasi secara terus menerus dan secara
periodik berubah dari energi kinetik ke energi potensial dan sebaiknya. Jumlah
energi total adalah sebanding dengan frekwensi vibrasi dan tetapan gaya ( k ) dari
pegas dan massa ( m1 dan m2 ) dari dua atom yang terikat. Energi yang dimiliki oleh
sinar infra merah hanya cukup kuat untuk mengadakan perubahan vibrasi.

Prinsip dari spektrofotometer IR adalah ketika suatu molekul dari suatu senyawa
diberikan energi radiasi inframerah, maka molekul tersebut akan mengalami vibrasi
dengan syarat energi yang diberikan terhadap molekul cukup untuk mengalami
vibrasi. Macam macam vibrasi ada 2 yaitu ada vibrasi regangan atai sterching dan
vibrasi bending. Vibrasi streching ada dua tipe yaitu streching asimetris dan streching
simetris. Perbedaannya, streching simetris merupakan perubahan panjang ikatan
menjadi lebih panjang atau lebih pendek namun tidak menyebabkan perubahan
momen dipol (momen dipol 0) sehingga tidak IR aktif.
 Streching bending merupakan perubahan sudut ikatan yang pasti menyebabkan
perubahan momen dipol sehingga IR aktif. Ada 4 tipe vibrasi bending yaitu vibrasi
goyangan (rocking), vibrasi guntingan (scissoring), vibrasi pelintiran (twisting), dan
vibrasi kibasan (wagging).

B. PARAMETER KUALITATIF
Spektrofotometer IR dapat digunakan untuk mengidentifikasi suatu senyawa.
Yang menjadi parameter kualitatif pada spektrofotometer IR adalah bilangan
gelombang dimana muncul gugus fungsi yang khas dari suatu senyawa. Namun jika
hanya daerah gugus fungsi saja tidak dapat digunakan untuk menganalisis identitas
senyawa. Ada daerah lain yang dinamakan daerah sidik jari atau dikenal sebagai
finger print region. Daerah finger print ini untuk setiap senyawa tidak akan ada yang
sama sehingga merupakan identias dari suatu senyawa.

C. PARAMETER KUANTITATIF
Spektrofotometer IR dapat digunakan dalam analisis secara kuantitatif jika
dihubungkan atau dilanjutkan analisis dengan bantuan dari instrumentasi lain
misalnya GC-MS, MS, dan sebagainya. Biasanya spektrosfotometer IR digunakan
sebagai analisis kuantitatif yaitu dalam menentukan indeks kemurnian yaitu
seberapa besarkah sampel yang dianalisis jika spektrum IR sampel dibandingkan
dengan spektrum IR baku pembanding atau reference standard dari sampel yang
dianalisis.
D. INSTRUMENTASI / KOMPONEN UTAMA DAN FUNGSINYA
Ada dua tipe instrumentasi spektrofotometer infra merah yaitu tipe Dispersive
spectrophotometer dan multiplexing spectrophotometer atau disebut juga dengan
Fourier Transform Infrared (FTIR).
Dispersive spectrophotometer. Monokromator yang digunakan mirip dengan
monokromator yang digunakan oleh spektrofotometer UV-Vis tipe berkas ganda
atau double beam. Biasanya digunakan secara primer unruk menganalisis senyawa
secara kualitatif. Detektor yang digunakan adalah tipe thermal transducer.
Responnya lambat sehingga sinar harus dipotong-potong terlebih dahulu oleh
chopper. Sistemnya double bead, karena ada beberapa hal yaitu :
Untuk mengurangi radiasi atmosferik (CO2 dan H2O)
Mencegah ketidakstabilan radiasi sinar infra merah
Mengurangi radiasi percikan oleh partikel pengotor atau debu di dalam
spektrofotometer infra merah
Memungkinkan pembacaan dan perekaman langsung

Mekanisme kerja. Sinar radiasi IR sebelum menembus sampel dan refrence

displit terlebih dahulu supaya pembacaan tidak lama. Setelah sinar IR displit, sinar
terbagi menjadi dua arus, yaitu sinar yang menuju sampel dan sinar yang menuju
larutan baku pembanding. Kemudian kedua berkas sinar tersebut masuk ke chopper
sehingga keluar output sinar yang diteruskan ke monokromator. Sinar masuk melalui
celah masuk atau entrance pada monokromator. Didalamnya terdapat gratting dan
sinar difokuskan oleh gratting. Setelah itu sinar keluar melalui celah keluar atau
extrance slit dan masuk ke alat scan frekuensi baru diteruskan ke detector. Oleh
detector sinar diubah menjadi sinyal elektrik dan diperkuat oleh amplifier. Kemudian
sinyal tersebut diinterpretasikan dalam bentuk spektrum infra merah dengan
bantuan perangkat lunak dalam komputer.

Fourier Transform Infra Red. Spektrofotometer iR ada beberapa kelemahan

yang telah disebutkan sebelumnya. Untuk mengatasi kelemahan tersebut perlu
adanya pengembangan pada sistem optiknya. Perkembangan spektrofotometer IR
yang paling modern adalah FTIR. Dasar pemikiran FT-IR adalah deret persamaan
gelombang yang dirumuskan oleh Jean Baptise Fourier yang membuat persamaan
matematika gelombang elektronik :
/- 0  /' 123 45 0  %' 367 45 0  / $!8945 0 % 8:945
Dimana :
a , b = suatu bilangan
t = waktu
ω = frekuensi sudut
FT-IR ini menggunakan suatu monokromator yang berbeda denga
monokromator pada spektrofotometer IR tipe dispersive. Monokromator yang
digunakan adalah monokromator Michelson Interferometer. Pada sistem optik ini
terdapat 2 cermin yaitu cermin yan g bergerak tegak lurus dan cermin diam. Skema
sistem optik ini seperti pada gambar dibawah :

Michelson Interferometer
Kelebihan dari FT-IR adalah :
Respon cepat
Sinar mengalami perubahab dahulu baru masuk ke sampel
Lebih bagus dari spektrofotometer IR dispersive
Lebih sensitif
Sinar radiasi infra merah tidak mengganggu atau tidak terganggu
Menggunakan monokromator Pyroelectric transducer.

Instrumentasi spektrofotometer infra merah mirip dengan instrumentasi

spektrofotometer UV-Vis. Perbedaannya adalah sampel berhadapan langsung
dengan sumber radiasi.
Secara berurutan, komponen utama dari spektrofotometer infra merah adalah
sebagai berikut :
Sumber radiasi
Sampel kompartemen
Monokromator
Detector
Amplifier atau penguat
Recorder / read out

Sumber radiasi. Prinsipnya sumber radiasi IR dipancarkan oleh padatan

lembam yang dipanaskan sampai pijar dengan aliran listrik. Ada 3 macam sumber
radiasi yaitu :

1. Globar source : tabung silica carbida dengan ukurandiameter 5mm dan

panjang 5cm
2. Nernst Glower : senyawa-senyawa oksida
3. Tungsten Filament Lamp : untuk analisis dengan nir-IR
 4. Incandescent Wire : merupakan lilitan kawat nikrom.
Sampel kompartemen. Cuplikan atau sampel yang dianalisis dapat berupa
cairan, padatan atau pun gas. Karena energi vibrasi tidak terlalu besar sampel dapat
diletakan langsung berhadapan dengan sumber radiasi IR. Karena gelas kuarsa atau
mortar yang terbuat dari porselene dapat memberikan kontaminasi yang menyerap
radiasi IR, maka pemakaian alat tersebut harus dihindari. Preparasi cuplikan harus
menggunakan mortar yang terbuat dari batu agate dan pengempaan dilakukan
dengan menggunakan logam monel.
Monokromator. Fungsinya sama dengan monokromator [ada
spektrofotometer UV-Vis. Hanya saja monokromator dalam spektrofotometer IR
tidak terbuat dari kuarsa atau leburan silika tetapi terbuat dari garam NaCl, KBr,
CsBr, atau LiF. Oleh sebab itu spektrofotometer IR harus diletakkan di suatu tempat
dengan kelembaban yang rendah untuk mencegah kerusakan pada peralatan
optiknya.
Ada dua macam monokromator dengan fungsi berbeda yang sama fungsinya
dengan monokromator spektrofotometer UV-Vis. Monokromator celah berfungsi
untuk lebih memurnikan radiasi IR yang drai cuplikan sehingga masuk ke dalam
rentang bilangan gelombang yang dikehendaki. Monokromator prisma yang terbuat
dari bahan garam anorganik berfungsi sebagai pengurai dan pengarah radiasi IR
menuju detektor. Monokromator prisma terbuat dari hablur NaCl yang paling banyak
digunakan sebab memberikan resolusi radiasi IR terbaik dibandingkan dengan yang
lainnya. Prisma leburan garam-garam bromida pada umumnya dipakai sebagai
resolusi radiasi IR jauh sedangkan garam fluorida untuk radiasi sinar IR dekat.
Monokromator yang umum digunakan adalah monokromtor kisi difraksi atau
gratting. Kisi difraksi terbuat dari bahan gelas atau palstik yang tertoreh dengan
halus permukaannya dan terlapisi oleh kondensasi uap aluminium. Jenis
monokrotaor kisi difraksi sudah banyak digunakan pada spektrofotometer IR yang
modern. Keunggulannya memberikan resolusi yang lebih bagus dengan dispersi yang
surambung lurus, disamping itu tetap menjaga keutuhan radiasi IR menuju detektor.
Kelemahannya adalah timbulnya percikan radiasi IR pada monokromator kisi difraksi.
Hal ini diusahakan dengan memakai monokromator ganda yang merupakan
kombinasi dari monokromator prisma dan monokromator kisi difraksi.
Detector. Berfungsi mengubah sinyal radiasi IR menjadi sinyal listrik. Selain itu
detektor dapat mendeteksi adanya perubahan panas yang terjadi karena adanya
pergerakan molekul. Detektor spelktrofotometer yang bersifat menggandakan
elektron tidak dapat dipakai pada spektrofotometer IR sebab radiasi IR sanngat
lemah dan tidak dapat melepaskan elektron dari katoda yang ada pada sistem
detektor. Ada tiga tipe detektor yang dapat digunakan pada spektrofotometer IR,
yaitu :
Thermal transducer : terdiri dari dua logam bercabang dimana suhu
tergantung pada potensialnya. Intrumen yang menggunakan detektor ini
 harus disimpan pada tempat yang ber-AC atau bersuhu konstan karena dapat
dipengaruhi oleh suhu sehingga dapat terjadi kesalahan dalam mendeteksi
suatu senyawa. Responnya lambat sehingga jarang digunakan.
Pyroelectric transducer : berupa kristal cairan dari triglisin sulfat (TGS) dimana
temperatur dipengaruhi oleh polaritas senyawa. Memiliki respon yang cepat
dalam menganalisis suatu senyawa.
Photoconducting transducer : terbuat dari bahan semikonduktor seperti
timbal sulfida, eaksa telurida, dan cadmium telurida, indium antimonida.
Harus menggunakan pendingin gas nitrogen sehingga responnya cepat.
Amplifier/penguat dan read out. Penguat dalam sistem optik
spektrofotometer IR sangat diperlukan karena sinyal radiasi IR sangat kecil atau
lemah. Penguat berhubungan erat dengan derau instrumen serta celah
monokromator, jadi keduanya harus diselaraskan dengan tujuan mendapatkan
resolusi puncak spektrum yang baik dengan derau maksimal. Sedangkan pencatat
atau read out harus mampu mengamati spektrum IR secara keseluruhan pada setiap
frekuensi dengan seimbang. Rentang bilangan gelombang 4000cm-1 sampai 650cm-
1 dalam keadaan normal harus dapat teramati dalam selang waktu 10 – 15 menit.
Untuk maksud pengamatan pendahuluan selang waktu tersebut dapat dipersingkat
ataupun diperlambat untuk mendapatkan hasil resolusi puncak spektrum IR yang
baik.
E. PENGUKURAN SECARA UMUM
Pengukuran dengan spektrofotometer infra merah bisa mengukur sambel
berwujud gas, padatan dan cairan atau larutan. Untuk setiap wujud sampel berbeda
cara preparasi sampelnya.
Sampel padatan. Ada 4 cara preparasi sampel yaitu :
Sampel dicampur dalam mortir agate dengan menambahkan mulling
agent (mulling agent : paraffin atau cairan nujol) kemudian diteteskan
pada plat garam KBr atau NaCl dan diukur.
Sejumlah sampel digerus dan dicampur dengan garam murni (KBr atau
NaCl) di dalam mortir agate kemudian dicetak penjadi plat KBr atau plat
NaCl dan ditempatkan dalam plat sampel dan diukur.
Menggunakan Cast Film Technique. Biasanya untuk sampel berbentuk
polimer. Sampel dilarutkan dengan pelarutnya yang bersifat
nonhigroskopis kemudian diteteskan pada plat garam setelah itu
pelarut diuapkan dan dikeringkan kemudian diukur. Dalam preparasi
sampel harus setipis mungkin karena jika terlalu tebal sinar infra merah
tidak dapat menembus sampel sehingga tidak dapat terukur atau
teranalisis.
Sampel bisa dipotong-potong sampai ukurannya cukup pada plat
sampel kemudian langsung diukur.
 Sampel berwujud gas. Sampel biasanya ditempatkan dalam suatu tabung
tertutupdengan panjang seku=itar 5 – 10 cm. Untuk sampel gas umumnya tidak
murni dan memiliki kemampuan adsorben yang lemah.
Sampel berwujud cairan atau larutan. Sampel cairan atau larutan dimasukkan
ke dalam plat berbentuk bulat kemudian ditambahkan garam murni KBr atau NaCl
yang sudah dicampurkan oleh sedikit sampel, kemudian disimpan dalam plat sampel
dan diukur.
Dalam preparasi sampel dipilih garam murni NaCl atau KBr karena
spektrofotometer infra merah merupakan senyawa ionik yang memiliki energi yang
digunakan untuk bervibrasi sangat tinggi dan energi radiasi sinar infra merah tidak
akan cukup kuat untuk menyebabkan molekul garam tersebut untuk bervibrasi.
Akibatnya tidak akan muncul peak dari garam tersebut di daerah inframerah
sehingga tidak akan mengganggu proses analisis senyawa.

KROMATOGRAFI (GC, TLC, HPLC)

TLC (Thin Layer Chromatography)

A. PRINSIP
Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola
pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa
molekul) yang berada pada larutan. Molekul yang terlarut dalam fase gerak, akan
melewati kolom yang merupakan fase diam. Molekul yang memiliki ikatan yang kuat
dengan kolom akan cenderung bergerak lebih lambat dibanding molekul yang
berikatan lemah. Dengan ini, berbagai macam tipe molekul dapat dipisahkan
berdasarkan pergerakan pada kolom. Kromatografi adalah teknik untuk memisahkan
campuran menjadi komponennya dengan bantuan perbedaan sifat fisik masing-
masing komponen. Alat yang digunakan terdiri atas kolom yang di dalamnya diisikan
fasa stasioner (padatan atau cairan). Campuran ditambahkan ke kolom dari ujung
satu dan campuran akan bergerak dengan bantuan pengemban yang cocok (fasa
mobil). Pemisahan dicapai oleh perbedaan laju turun masing-masing komponen
dalam kolom, yang ditentukan oleh kekuatan adsorpsi atau koefisien partisi antara
fasa mobil dan fasa diam (stationer).
Prinsip pemisahannya berdasarkan prinsip adsorpsi yaitu penyerapan sebagian
komponen sampel pada fasa diam berdasarkan kepolaran komponen sampel.

B. PARAMETER KUALITATIF
Parameter kualitatifnya adalah nilai Rf dari tiap senyawa yang dibandingkan
dengan nilai Rf senyawa baku. Jika warna spot, Rf nya sama dengan baku, maka
sampel yang dianalisis mempunyai identitas yang sama dengan baku pembanding.
Untuk menghitung nilai Rf adalah sebagai berikut :
C. PARAMETER KUANTITATIF
Untuk analisis kuantitatif tidak bisa hanya dengan menggunakan KLT saja,
namun perlu dilengkapi beberapa langkah. Untuk analisis kuantitatif, biasanya
menggunakkan kromatografi preparatif. Setelah mengembangkan dan dikeringkan
bagian spot pada fase diam (misalnya silica gel) dikerok kemudian dimasukkan ke
dalam wadah. Penentuan kadar dapat dilakukan dengan metode spektrofotometer
spe
UV-Vis,
Vis, dan bisa juga dengan HPLC, Spektrofotometer Inframerah dengan syarat
harus ada baku pembanding dari senyawa yang dianalisis.

D. INSTRUMENTASI
Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan, atau
kombinasi cairan-padatan)
padatan) dan fase gerak (berupa cairan atau gas). Fase gerak
mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen
komponen komponen yang terdapat
dalam campuran. Komponen-komponen
Komponen komponen yang berbeda bergerak pada laju yang
berbeda.
Jel silika (atau alumina) merupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi
lapis tipis seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat berpendarflour
dalam sinar ultra violet, alasannya akan dibahas selanjutnya. Fase gerak merupakan
pelarut atau campuran
mpuran pelarut yang sesuai.

E. PENGUKURAN SECARA UMUM

Kromatogram pada KLT merupakan noda-noda
noda noda yang terpisah setelah visualitas
dengan cara fisika atau kimia. Visualisasi cara fisika yaitu dengan melihat noda
kromatoram yang mengabsorpsi radiasi ultraviolet atau berfluoresensi dengan
radiasi ultraviolet pada panjang gelombang 254 nm dan 365 nm.
Pada adsorban yang berfluoresensi maka noda akan tampak sebagai
pemadaman fluoresensi. Visualisasi dengan cara kimia adalah dengan mereaksikan
kromatogran dengan pereaksi
pereaksi warna atau fluoresensi yang spesifik. Visualisasi cara
 kimia ini dilakukan dengan cara penyemprotan dengan atomizer atau memberikan
uap zat kimia pada kromatoram atau dengan cara pencelupan ke dalam pereaksi
penampak warna atau penampak bercak.
Perlu diperhatikan bahwa penyemprotan dengan pereaksi kimia ini diusahakan
jangan sampai merusak lapisan adsorban pada pelat dan diusahakan warna
kromatogram yang cukup stabil dalam jangka waktu lama.

GC (Gas Chromatography)

A. PRINSIP
Kromatografi merupakan suatu metode pemisahan campuran senyawa
berdasarkan prinsip adsorpsi dan prinsip partisi. Prinsip partisi adalah dimana suatu
senyawa yang akan dipisahkan dengan kromatografi gas bersifat volatile atau mudah
menguap. Proses pemisahan terjadi karena adanya kesetimbangan konsentrasi
sampel dalam fasa diam dan pasa gerak. Sistem adsorpsi pada fase diap padan atau
gas solid chromatography. Pemisahan bisa terjadi akibat perbedaan titik didih, titik
cair, atau perbedaan titik leleh.
Faktor kritis dalam proses pemisahan dengan menggunakan instrumen
kromatografi gas adalah resolusi, kecepatan, dan kapasitas sampel.

B. PARAMETER KUALITATIF
Parameter analisis kualitatif dari kromatografi gas sama halnya dengan tipe
kromatografi lainnya yaitu waktu retensi senyawa. Waktu retensi senyawa
merupakan waktu yang dibutuhkan oleh suatu senyawa keluar melewati kolom
kromatografi pada kondisi kromatografi yang sama. Setiap senyawa memiliki waktu
retensi yang berbeda-beda.

C. PARAMETER KUANTITATIF
Selain parameter analisis kualitatif, kromatografi gas memiliki parameter
analisis kuantitatif. Parameter tersebut ada dua yaitu tinggi puncak kromatogram
dari senyawa yang dianalisis dan luas area di bawah kurva atau kromatogram (AUC).
Parameter ini berguna pada saat penentuan kadar dari suatu sampel.
Dalam kromatografi gas ada faktor kritis yaitu :
1. Kapasitas sampel
2. Kecepatan alir
3. Resolusi

D. INSTRUMENTASI / KOMPONEN UTAMA

Instrumentasi dari gas chromatography atau kromatografi gas umumnya
adalah sebagai berikut :
Mobile phase tank (tanki fase gerak)
Fase gerak yang digunakan dalam kromatografi gas adalah berwujud gas.
Syaratnya adalah gas yang digunakan sebagai fase gerak harus bersifat inert,
memiliki tekanan inlet 10 – 50 psi lebih besar dari tekanan kamar,
kecepatan alirnya 25 – 150 ml/menit untuk kolom pack dan 1-25 ml/menit
untuk kolom kapiler. Umumnya gas yang digunakan sebagai pembawa
adalah gas helium. Adapun gas yang dapat digunakan sebagai fase gerak
adalah Ar, N2,H2, dan O2.
Injektor sampel
Injektor sampel berfungsi intuk menginjeksikan sampel ke dalam tempat
sampel. Injektor sampel berupa microsyringes. Digunakan microsyringes
karena sampel yang disuntukkan harus sedikit mungkin karena jika terlalu
banyak akan menurunkan efisiensi kolom. Efisiensi kolom dipengaruhi oleh
banyaknya sampel yang diinjeksikan. Untuk kolom pack sampel diijeksikan
sebanyak 20µL dan untuk kolom kapiler 100 kali lebih besar dari kolom
pack. Ijeksi sampel harus cepat karena jika injeksi sampel lambat maka akan
terjadi injeksi sampel yang berlebihan sehingga menyebabkan band
spreading atau pelebaran kromatogram dan pemisahan menjadi buruk.
Syringe menginjeksikan sampel ke dalam vaporization chamber. Proses
penguapan sampel terjadi pada suhu 280oC. Injektor ada 2 tipe yaitu tipe
splitless (100 : 90) dan tipe split (100 : 1).

Oven
Digunakan untuk mengontrol suhu. Ada dua sistem pengaturan suhu, yaitu
o Sistem isotermal : dalam satu kali running alat atau melakukan
pemisahan sisten diatur hanya menggunakan 1 suhu saja.
o Sistem gradien : dalam satu kali running alat atau satu kali proses
pemisahan suhu dinaikan secara bertahap.

Kolom
Kolom merupakan bagian paling penting dalam kromatografi kolom
termasuk kromatografi gas karena di dalam kolomlah proses pemisahan
campuran senyawa terjadi. Umumnya terbuat dari bahan teflon, stainless
steel, silica, gelas. Ukuran bervariasi, diameter antara 10 – 30 cm, dan
dilengkapi dengan termostat. Secara umum kolom kromatografi dibagi
mejadi 2 tipe yaitu :
1. Kolom terpacking (packed column)
Ukuran maksimal 5m. Kolom terlapisi alumina, fire bricket.
Keuntungannya adalah kapasitas besar, namun kelemahannya
adalah resolusinya rendah. Panjangnya berkisar 2-50m. Kolom pack
terbuat biasanya dari gelas bersilika. Sifatnya rapuh namun inert
 sehingga jika ada zat yang bersifat korosif (misalnya fenol) dalam
sampel tidak diganggu oleh kolom dan kerusakan kolom akan
terlihat (hitam dan pecah-pecah).

2. Kolom terbuka (capillary column)

Ukuran maksimal adalah 100 m. Biasanya terlapisi oleh bahan silika
atau poliamida. Keuntungan dari kolom terbuka adalah memiliki
resolusi yang tinggi. Namun keleemahannya adalah memiliki
kapasitas sampel yang terbatas.

Fase diam yang digunakan dipilih berdasarkan polaritas sampel.

Senuawa polar contohnya Carbowax / PEG 20 M 200oC dan DEGS 190oC.
Senyawa nonpolar contohnya SE-30 350oC, Squalan 100oC, dan senyawa
semipolar contohnya OV-17 dan OV-210. Fasediam adalah lemak sehingga
dapat meleleh. Ketika meleleh gas pembawa akan membawa komponen
analit berdasarkan kepolaran.

Detector
Detektor berfungsi untuk mendeteksi senyawa yang keluar melewati kolom
dan mengubah menjadi sinyal elektronik yang dapat dibaca oleh readout
atau data sistem. Pemilihan deektor bergantung pada sneyawa yang akan
dianalisis. Syarat detektor ideal adalah sebagai berikut :
a. Harus memiliki sensitivitas yang tinggi
b. Stabilitas dan reprodusibilitas yang baik
c. Memberikan respon linier terhadap pelarut
d. Mempunyai range suhu antara suhu kamar sampau dengan minimal
400oC
e. Waktu respon yang pendek tidak bergantung pada kecepatan alir
f. Reabilitas tinggi dan mudah digunakan
g. Tidak merusak sampel
h. Memberikan respon yang sama pada semua sampel.

Adapun macam-macam detektor yaitu :

o FID (Flame Ionization Detector), paling umum digunakan di bidang

farmasi. Digunakan untuk mendeteksi semua senyawa termasuk
pelarut.
o FTD (Flame Thermal Detector), untuk senyawa yang mengandung
unsur P dan unsur N
o FPD, untuk menganalisis senyawa pestisida organoposfat karbamat
(senyawa fosfor dan nitrogen sehingga yang akan terdeteksi adalah
senyawa yang mempunyai gugus posfat dan fosfor.
 o ECD (Electron Captured Detector), untuk pestisida organoklorin
sehingga tidak boleh menggunakan pelarut kloform atau pelarut lain
yang mengandungf gugus clorin. Pelarut yang biasanya digunakan
adalah DDT. Aldrin, dan dieldrin.
o TCD (Thermal Capture Detector), untuk isolasi senyawa karena dapat
ditampung namun paling tidak sensitif.

Data sistem
Data sistem ini fungsinya sama seperti pada spektrofotometer IR dan
Spektrofotometer UV-Vis. Hanya saja menggunakan perangkat lunak atau
software yang berbeda. Data sistem ini berfungsi untuk
menginterpretasikan hasil pemisahan dalam bentuk kromatogram dari
masing-masing senyawa yang dipisahkan. Selain itu dari data sistem bisa
diatur secara komputerisasi untuk menjalankan alat.

E. PENGUKURAN SECARA UMUM

Seperti yang dijelaskan sebelumnya baha GC digunakan untuk senyawa yang
mudah menguap. Namun ada beberapa senyawa yang kurang stabil jika dalam
keadaan uap atau memiliki sifat atsirinya rendah. Hal ini dapat diatasi dengan
menderivatisasi senyawa yang memiliki sifat atsiri yang rendah sehingga hasil
derivatisasi mempunyai sifat atsiri yang baik. Pada derivatisasi semua gugus fungsi
yang relevan harus dapat terderivat secara kuantitatif dengan cara yang disebut
sililasi, yaitu untuk mengurangi antaraksi dipol-dipol serta menambah keatsirian.
Pereaksi yang banyak digunakan untuk menderivatisasi adalah N,O bis-(trimetilsilil),
trifluoroasetamida, BSTFA, TMCS, TMSDEA. Sebagai contoh gugus polar – OH ,
- COOH, _- NH2 , =NH, dan - SH dapat diubah dengan gugus silil –O-Si(CH3)3 dengan
pereaksi BSTFA dan BSA.
Dalam menggunakan peralatan GC untuk menganalisis senyawa, instrumen
harus dikondisikan terlebih dahulu supaya komponen penyusun instrumen terutama
kolom tidak rusak. Caranya adalah instrumen dinyalakan sekaligus temperaturnya
diatur harus 30oC diatas suhu analisis. Kemudian gas pembawa dinyalakan dan akan
mengalir keluar dari kolom. Instrumen dibiarkan selama 30 menit.

HPLC (High Performance Liquid Chromatography) / KCKT

A. PRINSIP
Maksud dan tujuan analisis dengan mengunakan KCKT adalah hanya ada 2 hal
yaitudidapatkannya pemisahan yang baik dalam waktu yang relatif singkat. Prinsip
pemisahan dengan menggunakan instrumentasi KCKT adalah berdasarkan prinsip
partisi dimana sampel terbagi atau terpartisi ke dalam dua fase yaitu dalam fase
diam dan dalam fase gerak. Fase gerak berupa larutan dan fase diam dikemas atau
terpacking di dalam kolom. Sebelum melakukan pemisahan instrumentasi di-
 running dengan cara membiarkan aliran eluen atau fase
fase gerak melewati kolom dan
proses degassing harus dilakukan untuk menghilangkan gas di dalam kolom karena
jika tidak dihilangkan gasnya maka dapat merusak kolom.

B. PARAMETER ANALISIS
a. ANALISIS KUALITATIF
Parameter kualitatif dari kromatografi cair tekanan tinggi ada 4 yaitu :
1. Parameter retensi
Waktu retensi merupakan waktu yang dibutuhkan sampel untuk
keluar dari kolom. Setiap senyawa meiliki waktu retensi yang
berbeda. Parameter retensi dapat dihitung dengan rumus :

Dimana :

2. Efisiensi kolom
Efisiensi kolom padat dihitung dengan metode :

3. Kesimetrisan kromatogram
Dapat ditentukan dengan :
 S : Symmetry factor ( T : Tailing factor )

h
h x 0.05

f
W0.05

W0.05 S = 1 : The peak is completely symmetric.

S= S > 1 : Tailing
2f S < 1 : Leading

4. Parameter kondisi pemisahan

2. Parameters used in HPLC

Condition for good separation

A larger Rs value means a better separation.

1 - 1 k’2
Rs = N
4 1 + k’2

k’2
: Capacity term
1 + k’2 increases the retention time
- 1
: Selectivity term
increases the time interval between peaks
N : Column efficiency term
produce narrow peaks

b. ANALISISI KUANTITATIF
Beberapa hal yang harus diperhatikan agar HPLC dapat dipergunakan untuk
penentuan secara kuantitatif adalah:
a) Parameter percobaan sama antara standar dan sampel
b) Penentuan berdasarkan waktu retensi sampel dan standar yang sama
c) Penentuan kadar dilakukan berdasarkan hubungan (korelasi) dengan
menggunakan larutan standar seri pada waktu retensi tertentu.
• Berdasarkan area kromatogram
• Berdasarkan tinggi puncak kromatogram
Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram.
Dalam kromatogram akan terdapat peak-peak yang menggambarkan
banyaknya jenis komponen dalam sample. Sample yang mengandung banyak
komponen didalamnya akan mempunyai kromatogram dengan banyak peak.
Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk (overlap). Hal ini akan
menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi. Oleh karena itu
biasanya untuk sample jenis ini dilakukan tahapan preparasi sample yang
lebih rumit agar sample yang siap diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih
dari impuritis.
Sample farmasi biasanya jauh lebih mudah karena sedikit
mengandung komponen selain zat aktif. Sample ini umumnya hanya melalui
 proses pelarutan saja. Kesulitan biasanya dihadapi ketika akan
mengidentifikasi suatu kromatogram yang terdiri atas banyak
ban peak. Untuk
mengetahui peak mana yang merupakan milik analat (zat target analisa)
kromatogram dibandingkan dengan kromatogram standard. Cara yang paling
umum untuk mengidentifikasi adalah dengan
dengan melihat Retention time (RT).
Peak yang mempunyai RT yang sama sama dengan standard umumnya
akan langsung di vonis sebagai peak milik analat. Memang senyawa/zat yang
sama akan mempunyai RT yang juga sama, dengan catatan sample dan
standard dijalankan dengan kondisi dan sistem HPLC yang sama. Namun
bukan berarti RT yang
yang sama pasti merupakan zat/senyawa yang sama.
Disinilah para analis biasanya terkecoh.
Jadi, melihat RT sebetulnya belumlah cukup untuk mengidentifikasi
suatu zat. Hal lain yang perlu dilihat adalah spektrum 3D dari signal
kromatogram. Zat yang sama akanakan mempunyai spektrum 3D yang juga sama.
Sehingga jika spektrum 3D antara dua zat berbeda, maka kedua zat tersebut
juga dipastikan adalah zat yang berlainan, meskipun memiliki RT yang sama.

C. INTRUMENTASI DAN FUNGSINYA

Dibawah ini adalah 5 model kerja dengan
dengan menggunakan HPLC :

HPLC atau KCKT mempunyai instrumentasi dengan komponen-komponen

komponen
sebagai berikut :

• Mobile phase tank

Mobile phase tank merupakan tempat penampungan eluen-eluen
eluen yang
akan digunakan sebagai fase gerak. Biasanya terdapat 4 campuran eluen
 yang digunakan yaitu aquabidest, acetonitrile, dapar pH natrium dihidrogen
posfat, dan metanol.
• Solvent delivery
Solvent delivery merupakan tempat pencampuran pelarut-pelarut menjadi
eluen yang homogen.
• Injector
Pemasukkan atau injeksi sampel untuk analisis dengan metode KCKT
merupakan tindakan ilmuwan yang penting. Ada tiga macam injektor yang
biasanya ada pada rangkaian alat KCKT yaitu :
1. Injektordengan memakai diafragma (septum)
2. Injektor tanpa septum
3. Injektor dengan pipa dosis

Untuk analisis kuantitatif yang paling tepat digunakan adalah injektor

dengan pipa dosisb alasannya adalah ketepatan jumlah volume sampel yang
diinjeksikan akan sangat penting untuk analisis kuantitatif dan keadaan ini
hanya dapta diantisipasi denga injektor pipa dosis. Prinsipnya adalah load
injected, ini berarti pada keadaan pertama sampel akan masuk loop dan
akhirnya dengan volume yang tidak berkurang sedikitpun segera masuk
menuju kolom pemisahan.

• Column
Ini merupakan bagian terpenting dalam instrumen kromatografi. Kolom ini
merupakan tempat terjadinya separasi komponen-komponen sampel yang
akan terjadi di kolom. Oleh karena itu, harus diperhatikan dengan seksama
3 hal berikut yaitu :
1. Pemilihan kolom yang sesuai
2. Pemeliharaan kolom
3. Uji terhadap spesifikasi kolom

FASE KOLOM

Dilihat dari jenis fase diam dan fase gerak, maka kolom kromatografi cair
kinerja tinggi dibagi mejadi 2 tipe :

1. Kromatografi fase normal

Kolomnya konvensional dimana fase diamnya “normal” bersifat polar
misalnya silika gel sedangkan fase geraknya bersifat nonpolar.
2. Kromatografi fase terbalik
Merupakan kebalikan dari fase normal yaitu kromatografi sengan kolom
yang fase diamnya bersifat nonpolar dan fase geraknya bersifat polar.
Biasanya digunakan untuk memisahkan asam-asam lemak rantai panjang
melalui suatu kolom yang terbuat dari bahan karen yang bersifat
 nonpolar. Biasanya fase gerak yang digunakan adalah air, metanol, dan
aseton. Untuk mendapatkan fase diam yang nonpolar silika gel
direaksikan dnean klorosilan. Fase diam yang banyak digunakan adalah
jenis C18, C8 dan C2.
Keuntungan dengan menggunakan fase terbalik adalah senyawa yang
polar akan lebih baik pemisahannya pada kromatografi sistem ini. Selain
itudapat memisahkan senyawa yang mudah terionkan yang tidak dapat
dipisahkan dengan kromatografi fase normal dapat menggunakan air
sebagai salah satu komponen fase gerak.

• Detector
Detektor pada KCKT memberikan segala informasi kepada kita tentang
segala sesuatu yang diperlukan sehubungan dengan tujuan analisis baik
kuantitatif maupun kualitatif. Detektor yang biasa digunakan dalam
instrumentasi KCKT adalah :
a) Detektor UV-Absorpsi
b) Detektor Flourimetri
c) Detektor refraktive index
d) Detektor elektrokimia

Walaupun yang banyak digunakan adalah detektor UV-Absorpsi maka ada

beberapa kecenderungan yaitu akan ada puncak yang tidak terdeteksi dan
terjadi pergeseran puncak kromatogram. Maka dari itu detektor yang
banyak digunakan adalah detectro UV-Vis Photo Diode Array. Detektor tipe
ini dapat menjamin derau d an pelayangan instrumental yang sangat relatif
kecil sehingga dapat diabaikan. Keistimewaan dari detektor ini adalah :

o Sistem optik tidak menggunakan cermin dan menjamin spektral

purity dan mengabaikan stray radiation
o Hanya ada satu lensa fokus
o Tidak ada pergerakan mekanis sehingga menjamin ketepatan
panjang gelombang penentuan
o Kecepatan deteksinya 300 – 400 kali detektor PMT
o Rentang pengukuran 190 – 600 nm
o Hollografik gratting yang tidak bergerak.
• Oven kolom
Kolom KCKT diletakan di dalam oven untuk menjaga temperatur kolom
supaya stabil (tetap sesuai dengan program). Karena hal ini sangat penting
untuk memperoleh stabilitas dan keterandalan dalam analisis dengan
metode KCKT. Oven kolom yang banyak digunakan adalah dengan sistem
sirkulasi udara panas uang bertekanan. Oven kolom dapat memuat kolom
KCKT sampai 4 kolom sekaligus dengan temperatur kerja sampai 99oC.
 • Data processor
Data sistem ini fungsinya sama seperti pada GC. Hanya saja menggunakan
pengaturan ynag berbeda. Data sistem ini berfungsi untuk
menginterpretasikan hasil pemisahan dalam bentuk kromatogram dari
masing-masing senyawa yang dipisahkan. Selain itu dari data sistem bisa
diatur secara komputerisasi untuk menjalankan alat. Dengan data processor
kita dapat memperoleh secara langsung data yang diperlukan bisalnya luas
area kromatogram, lebar puncak, tinggi puncak, dan waktu retensi.

• Penampungan akhir
Digunakan untuk menampung eluen yang keluar dari kolom baik pada
proses degassing maupun dalam peroses pemisahan.

D. PENGUKURAN SECARA UMUM

Sampel yang akan dipisahkan dimasukkan ke dalam kolom secara otomatis
atau manual melalui injeksi. Volume injeksi sangat tepat karena mempunyai sampel
loop dengan variabel volume (misalnya 20 – 500 μL). Injeksi sampel dapat dilakukan
melalui manual.
Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan
disturbansi yang minimum dari material kolom. Ada dua model umum :
a. Stopped Flow
b. Solvent Flowing
Cara mengelusi sampel pun harus diperhatikan. Ada dua cara elusi yaitu elusi
gradien dan elusi isokratik. Elusi isokratik dilakukan hanya menggunakan 1
perbandingan konsentrasi eluen dalam satu kali proses pemisahan. Elusi Gradien
didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fasa gerak selama analisis
kromatografi berlangsung. Efek dari Elusi Gradien adalah mempersingkat waktu
retensi dari senyawa-senyawa yang tertahan kuat pada kolom. Dasar-dasar elusi
gradien dijelaskan oleh Snyder.
Elusi Gradien menawarkan beberapa keuntungan :
a. Total waktu analisis dapat direduksi
b. Resolusi persatuan waktu setiap senyawa dalam campuran bertambah
c. Ketajaman Peak bertambah (menghilangkan tailing)
d. Efek sensitivitas bertambah karena sedikit variasi pada peak
Gradien dapat dihentikan sejenak atau dilanjutkan. Optimasi Gradien dapat
dipilih dengan cara trial and error. Tabel 3. 1. berikut ini menunjukkan
kompatibilitas dari bermacam-macarn mode kromatografi cair dengan analisis
gradien. Dalam praktek, gradien dapat diformasi sebelum dan sesudah pompa.
Di dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau rasa gerak adalah salah
 satu dari variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat variasi yang sangat
luas pada solven yang digunakan untuk KCKT, tetapi ada beberapa sifat umum
yang sangat disukai, yaitu rasa gerak harus :
1. Murni, tidak terdapat kontaminan
2. Tdak bereaksi dengan wadah (packing)
3. Sesuai dengan defektor
4. Melarutkan sampel
5. Memiliki visikositas rendah
6. Bila diperlukan, memudahkan "sample recovery"
7. Diperdagangan dapat diperoleh dengan harga murah (reasonable price)
Umumnya, semua solven yang sudah digunakan langsung dibuang karena
prosedur pemumiannya kembali sangat membosankan dan mahal biayanya. Dari
semua persyaratan di atas, persyaratan 1) s/d 4) merupakan yang sangat penting.
Menghilangkan gas (gelembung udara) dari solven, terutama untuk KCKT yang
menggunakan pompa bolak balik (reciprocating pump) sangat diperlukan terutama
bila detektor tidak tahan kinerja sampai 100 psi. Udara yang terlarut yang tidak
dikeluarkan akan menyebabkan gangguan yang besar di dalam detektor sehingga
data yang diperoleh tidak dapat digunakan (the data may be useless).
Menghilangkan gas (degassing) juga sangat baik bila menggunakan kolom yang
sangat sensitifterhadap udara (contoh : kolom berikatan dengan NH2).

KEUNTUNGAN MENGANALISIS DENGAN KCKT

KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan kromatografi cair klasik, antara
lain:

• Waktu analisis cepat

• Resolusi besar
• Sensitivitas detektor
• Kolom yang dapat digunakan kembali
• Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik
• Mudah rekoveri sampel