Diagnóstico

Molecular de
Enfermedades
Hereditarias
Capítulo 10

Equipo:
Gabriela Guadalupe Padilla Escobedo
Sendar Daniel Nery Flores
1. Introducción
• La biología Molecular ha avanzado desde
el año 1990.

• El principal proyecto fue el de mapear y

secuenciar todo el genoma humano
(65 000 a 80 000 los genes)

• Los principales objetivos son la

determinación exacta de cada uno de los
nucleótidos, identificar y cartografiar cada
uno de los genes. Demanda
pruebas
• Reino Unido más de 40 laboratorios para
genéticas
pruebas geneticas.
• Cada uno de los laboratorios brinda acceso a la información genética
de cada paciente por medio del internet.

• Tradicionalmente la secuenciación se realizó por medio de

radioisótopos y autoradiografía.

• Actualmente se utiliza la técnica de

secuenciador terminador fluorescente.
Se marca cada una de los nucleótidos con un
color fluorescente diferente y se somete
longitudes de onda donde son secuenciados
automáticamente por analizadores
computacionales.

* Se ha mejorado el rendimiento así como

la exactitud en la identificación de
mutaciones.
 2. Detección directa de
mutaciones genéticas.
* Las mutaciones son cambios o alteraciones en la información
genética.

NIVEL DNA NIVEL CROMOSOMICO

* Afecta uno o varios * Afecta parte o todo el
nucleótidos o grandes cromosoma hasta
segmentos de DNA genomas completos

Se han diseñado numerosas técnicas para este

tipo de mutaciones
 Distrofia Muscular Duchene Distrofia Muscular de Becker
DMD DMO

Gen Distrofina cromosoma X

Proteína de los músculos
* Empeora rápidamente * Empeora lentamente
*Se presenta en 1 de cada 3600 * Se presenta en 6 de cada 10000
varones varones
* Aparece a temprana edad (6 años)

Mutaciones como
delecciones (65%) y
duplicaciones (7%) de uno o
mas exones del gen de la
distrofina y el 28% por
mutaciones puntuales.
 El gen de la distrofina consta de 79 exones

PCR Múltiple

Mediante el análisis de duplicación o delecciones en los diferentes

exones del cromosoma X del varón.

Ventajas :
• Análisis preciso y cuantitativo de datos.
• Detección de duplicaciones y delecciones en
pacientes varones con DMD.
• Las mujeres portadoras de delecciones o
duplicaciones pueden ser detectadas con
precisión.
• Detección de mutaciones puntuales.
   Normal 2%

Delección exón 44
masculino

Exón 44 borrado
mujer

Duplicación exón 44

Amplificación de PCR múltiple para la detección de delecciones y duplicaciones.

Los productos obtenidos a partir de amplificación de los exones propensos
a supresión en el gen de la distrofina son separados en una base de tamaño. 
Cada pico corresponde a un exón tiene la etiqueta.  
 Mutaciones de Expansión
• Enfermedades o trastornos de repetición triplete en una secuencia
de nucleótidos. (CTG y CGG)

Corea de Huntington 

Es una enfermedad neurológica degenerativa (afecta a

determinadas zonas el cerebro donde las neuronas van
degenerándose y finalmente mueren)
Expansión trinucleótido CAG
Cromosoma 4 y 7

Normal: 35 copias Afectado: mas de

36 repeticiones
 • Se diagnostica por medio de PCR por medio de la medición del alelo
repetido; se utilizan primers para amplificar a través de la repetición y
posteriormente se realiza electroforesis en gel de poliacrilamida y tinción de
plata.

Perfil normal de
repeticiones en 2 alelos

Comparación alelo normal de 24

repeticiones y alelo mutante de 44
repeticiones de Corea de Huntington

Detección de la expansión de repetición de triplete en

la enfermedad de Huntington.
 Síndrome de X frágil Distrofia Muscular Miotónica
Expansión de repetición CGG Expansión de repetición CAG

Detección por Southern Blot

Detección de mutaciones
de inserción mediante el
análisis de Southern Blot
de una familia con el
síndrome de X frágil.
Mutaciones Puntuales
Oligonucleótidos de alelos específicos

Alteración de un único
nucleótidos en la secuencia de un gen.
Pueden ser detectadas mediante la
síntesis de sondas de oligonucleótidos
(18-20 nucleótidos) que son
complementarios ya sea a la secuencia
normal o a la secuencia mutada.
 Mutaciones Puntuales
Análisis de sitios de enzimas de restricción

Endonucleasas de restricción ampliamente usadas en el diagnóstico

molecular, ya que pueden identificar mutaciones que se producen
dentro de su secuencia de reconocimiento
Secuencia normal
CCTGAGGAG
Mutación en el gen
Anemia por células Secuencia mutada
que codifica la
falciformes CCTGTGGAG
cadena p de la Hb

Enzima de restricción
Electroforesis MSTII corta el ADN en
la secuencia
CCTGAGG
 Mutaciones Puntuales

 Si no hay sitio de restricción presente, podemos crear uno en el

producto amplificado mediante la alteración de la secuencia de uno de
los primers de PCR por una o dos bases.

 Se ha utilizado esta técnica para elaborar un ensayo para identificar la

mutación en el gen de la distrofia de Duchenne presente en pacientes
con distrofia muscular.
Mutaciones Puntuales
Mutaciones Puntuales
ARMS (amplification refractory mutation system)

PCR diseñada para que las últimas bases 3 ‘ de

uno de los primers caiga en el sitio del gen que produce
una mutación, en presencia de la mutación no se produce
la PCR y no hay producto obtenido de la amplificación.

Se necesita realizar una segunda PCR

con primers específicos para la
mutación.
 Mutaciones Puntuales
Ligadura de oligonucleótidos

Detectar la presencia de 31 mutaciones

en el gen de la fibrosis quística

El primer paso del análisis

La segunda etapa de la
consiste en la amplificación de
prueba consiste en la
15 exones del gen de la fibrosis
hibridación y
quística mediante primers
la ligadura de los
estándar.
oligonucleótidos
Los productos de la ligadura específicos. Cada
son detectados por mutación bajo prueba
electroforesis en un es investigada por tres
analizador automático de oligonucleótidos.
ADN
Mutaciones Puntuales
 Mutaciones Puntuales
Marcado fluorescente en la secuenciación de ADN

Es posible detectar mutaciones puntuales

mediante la secuenciación directa del ADN por
medio de los productos de la PCR.

Terminadores
didesoxinucleótidos
Diagnóstico indirecto con marcadores
genéticos relacionados

En los casos en que el gen que causa la

enfermedad es conocida y la
mutación identificada, el diagnóstico
preciso de miembros de la familia es sencillo
con uno de los métodos descritos
anteriormente.

En la práctica un individuo afectado es probado primero

para las mutaciones más comunes.
Si estas pruebas son negativas, pero el diagnóstico se
confirma mediante una serie de
criterios clínicos a continuación se utilizan los métodos
indirectos para ofrecer consejo genético a la familia de
un individuo afectado.
 Perspectivas del futuro
Siempre hay nuevas tecnologías en el horizonte que pueden ser un
día utilizados en los laboratorios de diagnóstico. Nuevos avances en
robótica y analizadores automatizados.

Sonda de
Cromatografía líquida de
degradación o
alto rendimiento (DHPLC)
sonda Taqman

Detección de cientos o miles de mutaciones al

Sondas de mismo tiempo es el objetivo final de los
Hibridación laboratorio de diagnóstico en particular para las
enfermedades multigénicas.