Anda di halaman 1dari 38

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Suatu analisis kimia menjadi meragukan jika pengukuran sifat tidak


berhubungan dengan sifat spesifik senyawa terukur. Pada kebanyakan analisis
meliputi pengambilan cuplikan,pemisahan senyawa penganggu isolasi senyawa
yang dimaksudkan,pemekatan terlebih dahulu sebelum identifikasi dan
pengukuran. Ada banyak teknik pemisahan tetapi kromatografi merupakan
teknik paling banyak digunakan. Kebanyakan pemisahan kromatografi rutin
dari suatu campuran dikerjakan dalam beberapa menit dengan peralatan yang
relative sederhana.
Penyelidikan tentang kromatografi kendor untuk beberapa tahun sampai
digunakan suatu teknik dalam bentuk kromatografi padatan cair (LSC).
Kemudian pada akhir tahun 1930 an dan permulaan tahun 1940 an,
kromatografi mulai berkembang. Dasar kromatografi lapisan tipis (TLC)
diletakkan pada tahun 1938 oleh Izmailov dan Schreiber, dan kemudian
diperhalus oleh Stahl pada tahun 1958.Hasil karya yang baik sekali dari Martin
dan Synge pada tahun 1941 (untuk ini mereka memenangkan Nobel) tidak
hanya mengubah dengan cepat kromatografi cair tetapi seperangkat umum
langkah untuk pengembangan kromatografi gas dan kromatografi kertas.Pada
tahun 1952 Martin dan James mempublikasikan makalah pertama mengenai
kromatografi gas. Diantara tahun 1952 dan akhir tahun 1960-an kromatografi
gas dikembangkan menjadi suatu teknik analisis yang canggih.
Kromatografi cair, dalam praktek ditampilkan dalam kolom gelas
berdiameter besar, pada dasamya dibawah kondisi atmosfer.Waktu analisis lama
dan segala prosedur biasanya sangat membosankan.Pada akhir tahun 1960-an,
semakin banyak usaha dilakukan untuk pengembangan kromatografi cair

1
sebagai suatu teknik mengimbangi kromatografi gas. High Performance Liquid
Chromatography (HPLC) atau Kromatografi Cair Penampilan Tinggi atau High
Preformance = Tekanan atau Kinerja Tinggi, High Speed = Kecepatan Tinggi
dan Modern = moderen) telah berhasil dikembangkan dari usaha ini. Kemajuan
dalam keduanya instrumentasi dan pengepakan kolom terjadi dengan cepatnya
sehingga sulit untuk mempertahankan suatu bentuk hasil keahlian membuat
instrumentasi dan pengepakan kolom dalam keadaan tertentu. Tentu saja, saat
ini dengan teknik yang sudah matang dan dengan cepat KCKT mencapai suatu
keadaan yang sederajat dengan kromatografi gas.

1.2 Pembatasan Masalah


1. metode dan teknik yang digunakan dalam proses pemisahan
2. pengklasifikasian kromatografi
3. prinsip kerja dari setiap pengklasifikasian

2
BAB II
ISI

2.1 Tinjauan Pustaka


Kromatografi Kertas (KKt) dan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) adalah cara
yang serupa dalam hal fase diamnya berupa lapisan tipis dan fase geraknya
mengalir karena kerja kapiler. Perbedannya dalam sifat dan fungsi fase diam.
( Roy J. Gritter, James M. Bobbit, Arthur E. S., 1991.)
Kromatografi Lapis Tipis Preparatif
Proses isolasi yang terjadi berdasarkan perbedaan daya serap dan daya partisi
serta kelarutan dari komponen-komponen kimia yang akan bergerak mengikuti
kepolaran eluen, oleh karena daya serap adsorben terhadap komponen kimia
tidak sama, maka komponen bergerak dengan kecepatan yang berbeda sehingga
hal inilah yang menyebabkan pemisahan (K. Hostettmann, M. Hostettmann, A.
Marston.1995)
Kromatografi Gas Cair (KGC)
Pemisahan pada kromatografi gas didasarkan pada titik didih suatu senyawa
dikurangi dengan semua interaksi yang mungkin terjadi antara solute dengan
fase diam. Penggunaan suhu yang meningkat (biasanya pada kisaran 50-350°C)
bertujuan untuk menjamin bahwo solute akan menguap dan karenanya akan
cepat terelusi.
(Ibnu Gholib Gandjar. Abdul Rahman. 2008.)
Kromatografi kolom merupakan metode kromatografi klasik yang masih
banyak digunakan.Kromatografi kolom digunakan untuk memisahkan senyawa-
senyawa dalam jumlah yang banyak berdasarkan adsorpsi dan partisi. Kemasan
adsorben yang sering digunakan adalah silika gel G-60, kieselgur, Al2O3, dan
Diaion. Cara pembuatannya ada dua macam:
• Cara kering

3
• Cara basah
(Conners.A.K. ”Pharmaceutical Analysis” Solvent Extraction. Kisman .Dr.
Sastro, ddk .1994.)

2.2 PEMBAHASAN
2.2.1 Pengklasifikasian Kromatografi Berdasarkan Macam Fasa Gerak
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Pressure Liquid
Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode kimia dan
fisikokimia. KCKT termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik
kromatografi dengan fasa gerak cairan dan fasa diam cairan atau padat.
Banyak kelebihan metode ini jika dibandingkan dengan metode lainnya ,yaitu
• mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran
• mudah melaksanakannya
• kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi
• dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis
• Resolusi yang baik
• dapat digunakan bermacam-macam detektor
• Kolom dapat digunakan kembali
• mudah melakukan "sample recovery"
Komponen-komponen penting dari KCKT

4
• Fasa gerak
Di dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau fasa gerak adalah
salah satu dari variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat variasi yang
sangat luas pada solven yang digunakan untuk KCKT, tetapi ada beberapa sifat
umum yang sangat disukai, yaitu rasa gerak harus :
1. Murni, tidak terdapat kontaminan
2. Tidak bereaksi dengan wadah (packing)
3. Sesuai dengan defektor
4. Melarutkan sampel
5. Memiliki visikositas rendah
6. Bila diperlukan, memudahkan "sample recovery"
7. Diperdagangan dapat diperoleh dengan harga murah (reasonable price)
Umumnya, semua solven yang sudah digunakan langsung dibuang
karena prosedur pemumiannya kembali sangat membosankan dan mahal
biayanya. Dari semua persyaratan di atas, persyaratan 1) s/d 4) merupakan yang
sangat penting. Menghilangkan gas (gelembung udara) dari solven, terutama
untuk KCKT yang menggunakan pompa bolak balik (reciprocating pump)
sangat diperlukan terutama bila detektor tidak tahan kinerja sampai 100 psi.
Udara yang terlarut yang tidak dikeluarkan akan menyebabkan gangguan yang
besar di dalam detektor sehingga data yang diperoleh tidak dapat digunakan
(the data may be useless). Menghilangkan gas (degassing) juga sangat baik bila
menggunakan kolom yang sangat sensitifterhadap udara (contoh : kolom
berikatan dengan NH2).
• Keuntungan KCKT
KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan
kromatografi cair klasik, antara lain:

5
Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat
diselesaikan sekitar 15-30 menit.Untuk analisis yang tidak rumit
(uncomplicated), waktu analisis kurang dari 5 menit bisa dicapai.
Resolusi : Pada KG, gas yang mengalir sedikit berinteraksi dengan zat padat;
pemisahan terutama dicapai hanya dengan fasa diam. Kemampuan zat padat
berinteraksi secara selektif dengan fasa diam dan fasa gerak pada KCKT
memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang diinginkan.
Sensitivitas detektor : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam
KCKT dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari
bermacam- macam zat. Detektor-detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat
mendeteksi jumlah sampai picogram (10-12 gram). Detektor-detektor seperti
Spektrofotometer Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dll dapat juga digunakan
dalam KCKT
Kolom yang dapat digunakan kembali : Berbeda dengan kolom kromatografi
klasik, kolom KCKT dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis
yang bisa dilakukan dengan kolom yang sma sebelum dari jenis sampel yang
diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan
Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik : zat – zat yang tidak bisa
dianalisis dengan KG karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi untuk
menganalisis psesies ionik. KCKT dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal
sekali untuk mengalissis zat – zat tersebut.
Mudah rekoveri sampel : Umumnya setektor yang digunakan dalam KCKT
tidak menyebabkan destruktif (kerusakan) pada komponen sampel yang
diperiksa, oleh karena itu komponen sampel tersebut dapat dengan mudah
sikumpulkan setelah melewati detector. Solvennya dapat dihilangkan dengan
menguapkan ksecuali untuk kromatografi penukar ion memerlukan prosedur
khusus.

6
2. Kromatografi Gas
Sistem kromatografi gas memerlukan sistem tertutup sempurna kecuali
pada tempat keluarnya gas. penyusun utama kromatograf. Gas pembawa dari
tangki bertekanan, mengalir melalui pengatur tekanan yang mengatur kecepatan
aliran gas dalam alat itu. Cuplikan dimasukkan ke dalam suatu kamar pemanas
melalui sekat karet silicon dengan syringe jika cuplikan berupa cairan atau jika
cuplikan berupa gas digunakan katup khusus untuk cuplikan itu. Dari sini gas
pembawa membawa cuplikan melalui kolom dimana mereka dipisahkan dan
kemudian melalui detektor yang mengirim isyarat ke pencatat. Kolom perlu
dipanasi pada suhu tertentu, demekian juga tempat injeksi dan detektor.

Pemasukan cuplikan. Seperti kromatografi lainnya, hal yang penting


adalah memasukkan cuplikan itu dalam waktu sesingkat mungkin dan volume
sekecil mungkin. Kamar cuplikan dipanasi untuk sekitar 20m2/g, tetapi mudah
pecah dan penuh pengotor. Dalam salah satu cara pembuatannya, tanah diatome
dicampur dengan tanah liat dan dipanasi pada 9000C. kemudian digiling dan
dipisahkan sesuai ukurannya. Bahan ini menjadi mempunyai luas permukaan
sekitar 4m2/g. Permukaannya aktif tehadap senyawa polar berwarna kemerah-
merahan, karena itu dinamakan Chromosorb-P. pada cara pembuatan lain,
bahan mentah dicampur dengan kalium karbonat sebelum dipanasi. Bahan jadi
ini lebih mudah pecah, secara kimiawi kurang aktif, luas permukaaan sekitar
0,5-1 m2/g dan berwarna putih, sehingga dinamakan Chromosorb-W.

Gugus OH bersifat asam dan agak polar, dan cenderung bereaksi dengan
senyawa polar, terutama dengan gugus fungsi basa. Aktifitas permukaan dapat
dikurangi dan beberapa pengotor dihilangkan dengan dicuci dengan asam atau
basa. Untuk pemisahan amina, lebih disenangi melapisi dengan lapisan natrium
hidroksida pada permukaan. Perlakuan efektif dengan silanisasi permukaan
dengan heksametil disizalan (HMDS):

7
OH OH Me

Si O Si + (Me3Si2)NH Me Si Me

Si O Si

Me Si Me

Me

Dalam hal ini gugus OH yang polar diganti dengan gugus trimetisilil
yang relative inert. Mempercepat penguapan cuplikan cair dan dibuat
sedemikian rupa sehingga gas pembawa membawa cuplikan langsung ke dalam
kolom. Jika hal ini terjadi, cuplikan tidak menyebar sebelum proses pemisahan.
Pada beberapa kromatograf, cuplikan diinjeksikan langsung kedalam kolom
pada masukan. Cara ini lebih cocok untuk cuplikan yang mudah menguap.

Gambar 2.2 Bagian utama kromotograf

Jumlah yang dimasukkan ditentukan oleh beberapa factor,yaitu jumlah


cuplikan yang diperoleh, kapasitas kolom dan kepekaan detektor

8
Pada umunya untuk cuplikan cair diperlukan 0,1 sampai 10 ul dan untuk
cuplikan gas antara 1 sampai 10 ml. kolom kapiler memerlukan cuplikan lebih
kecil 10-3 sampai 10-2 ul.

- Fasa Diam

a. Padatan pendukung

Padatan pendukung yang ideal untuk kromatografi gas belum diperoleh.


Padatan pendukung itu idealnya mempunyai luas pemukaan tinggi (1 m2-/g) dan
inert, tetapi dapat dibasahi oleh fasa cair yang dapat melapisi sebagai lapisan
tipis yang seragam. Padatan pendukung itu juga harus tahan panas, cukup kuat
dan mempunyai ukuran sama, hampir bulat.Sebagai padatan pendukung yang
lebih banyak digunakan adalah turunan tanah diatome. Bahan mentah ini
mempunyai luas permukaan.Teflon serbuk digunakan sebagai padatan
pendukung untuk senyawa terlarut yang sangat polar, tetapi bahan ini
mempunyai luas pemukaan rendah. Karena sangat inert sehingga sukar
melapisinya. Padatan pendukung lainnya adalah butiran gelas mikro dan
karbon.

b. Fasa cair

Penggunaan yang luas dari kromatografi gas cair disebabkan oleh


adanya banyak macam fasa cair yang dapat digunakan sebagai fasa diam.Fasa
cair yang baik adalah :

1. Tidak mudah menguap (tekanan uap kurang dari 0,1 torr) pada suhu
pemisahan.

2. Tahan panas

3. Mempunyuai harga K yang sesuai dengan senyawa yang dipisahkan


tidak terlalu kecil dan tidak terlalu besar

9
4. Dapat digunakan ulang

5. Inert tehadap senyawa yang dipisahkan atau jika bereaksi harus cepat
dan bolak-balik

Beberapa fasa cair yang biasa digunakan diberikan dalam Tabel berikut

Fasa cair Jenis cuplikan Polaritas Suhu


maks
(0C)
Squalane Hidrokarbon N 125
Apiezon L Hidrokarbon N 300
titik didih tinggi,
ester,eter
Metil silicon Steroida, pestisida, N 300
Alkaloida,ester
Dionil ptalat Semua jenis I 175
Minyak Semua jenis I 275
silicon Ester P 200
Dietilenglikol
suksinat Alkohol, amina, P 250
Carbowax Aromatic, keton
20M Senyawa amino P 300
Olefina, alcohol P 100
Resina Olefina, P 50
poliamid, hidrokarbon lingkar
-Oksidipro-
pionitril
AgNO3 da-
lam propilena

10
glikol
N = nonpolar, I = agak polar, P= polar

• Fasa Gerak

Sesuai dengan namanya kromatografi gas, sebagai fasa gerak digunakan


gas. Gas pembawa yang biasa digunakan adalah helium, nitrogen, hydrogen,
dan argon. Gas pembawa ini relative inert, tidak mahal, dan tidak beracun.
Hydrogen mudah terbakar, karenanya perlu perhatian keselamatan kerja yang
memadai. Karena gas itu inert, maka interaksi antara molekul cuplikan dan
molekul gas dapat diabaikan, kecuali pada tekanan tinggi. Koefisien distribusi
suatu senyawa ditentukan oleh kemudahan menguap fasa diam. Pemilihan gas
pembawa biasanya didasarkan pada kemurniannya atau kecocokannya dengan
detektor. Misalnya detektor penghantar panas paling cocock dengan hydrogen
atau helium. Untuk kebanyakan hal helium merupakan pilihan pertama.
Kemurnian gas pembawa sangat penting karena pengotoran sedikit saja dalam
gas itu dapat menimbulkan kebisingan pada isyarat detektor. Karenanya gas
pembawa sebelumnya perlu dialirkan melalui penyaring molekul untuk
menghilangkanuap air yang biasanya terdapat dalam gas pembawa.

Aliran dalam kolom disebabkan oleh perbedaan tekanan antara masukan


dan keluaran. Tekanan masukan , Pi, 10-15 psig (pound per inchi pesegi).
Tekanan keluaran, P0, adalah tekanan atmosfer normal. Pada banyak alat
pengatur aliran mengatur Pi pada kecepatan alir tetap, tetapi pada kebanyakan
alat, Pi dianggap tetap.

• Detektor

Hasil pemisahan di dalam kolom harus dilihat dan dicatat. Semua


senyawa terdapat dalam keadaan sangat encer dalam gas pembawa. Kemudian
kurang dari satu detik suatu puncak melalui detektor, sedangkan puncak terakhir

11
dapat muncul setelah satu jam pemisahan dan akan muncul sebagai suatu pita
lebar di atas garis dasar. Karena itu detektor harus tidak memberikan tanggapan
terhadap cuplikan yang terdapat dalam jumlah kecil.

Detektor universal belum ditemukan. Persyaratan detektor, yaitu :

1. batas deteksi rendah

2. tanggapan linier pada rentang kadar lebar

3. tanggapan seragam terhadap semua senyawa

4. kalibrasi sederhana

5. waktu tanggapan pendek

6. volume dalam kecil

7. bisingan rendah

8. stabil dan detektor itu harus sederhana

9. murah dan aman

Macam-macam Detektor.

Detektor dapat dikelompokkan sebagai detektor diferensial mengukur


kadar senyawa seketika itu juga atau kecepatan alir seketika itu juga. Detektor
integral menambahkan isyarat seketika itu juga dan memberikan jumlah total
dan biasanya digunakan untuk analisis kualitatif, sedangkan isyarat detektor
diferensial untuk analisis kuantitatif.

12
Gambar 2.3 Respon diferensial dan integral dari kromotograf yang sama

Detektor dapat dikelompokkan sebagai detektor merusak dan tidak


merusak tergantung apakah senyawa cuplikan itu berubah atau tidak.

Detektor diferensial paling banyak digunakan pada Gas


Chromatography dan termasuk berikut :

1. Flame Ionization Detector (F.I.D.)


2. Thermal Conductivity Detector (T.C.D.)
3. Electron Capture Detector (E.C.D.)
4. Thermionic Spesific Detector N, P spesific (T.S.D.)

A. Thermal Conductivity Detector (T.C.D.)

Thermal conductivity detector didasarkan pada prinsip bahwa suatu


badan yang panas akan melepaskan panas pada suatu tingkat yang tergantung
pada komposisi dari lingkungan sekitarnya. Kebanyakan thermal conductivity
detector berisi kawat logam yang dipanaskan secara elektrik dan menjulang
pada aliran gas. Ketika suatu unsur yang asing diperkenalkan ke dalam ,
temperatur dari kawat dan karenanya maka resistan kawat akan berubah.
Masing-masing unsur mempunyai konduktivitas termal berbeda yang

13
mengijinkan pendeteksian nya di aliran gas. Resistan elektrik adalah secara
normal diukur oleh Wheatstone brigde circuit.

Sensitivitas Thermal Conductivity Detector dinyatakan dalam


persamaan berikut dengan parameter berikut :

Dimana :
S= sensitivitas
K= konstanta cell bergantung pada geometri
I= arus filemen
R= resistan filamen
?c= konduktivitas termal gas pembawa
?s= konduktivitas termal gas sampel
Tf = temperatur filamen
Tb = temperatur blok detektor

Untuk meningkatkan sensitivitas detektor T.C.

1. Meningkatkan arus filamen


2. Menurunkan temperatur blok
3. Memilih gas pembawa yang memiliki konduktivitas termal tinggi
4. Mengurangi laju aliran (harus konstan)

1. Sensitivitas (Minimum Detectable Quantity)

14
Batas lebih rendah yang layak ialah 10-7 hingga 10-8 g. Hal ini
mengasumsikan laju aliran kecil, dan puncak lebih awal dan tajam. Ini
sensitivitas menengah karena ionization detectors akan jauh lebih sensitif.
Bahkan dengan ukuran sampel besar, 10 hingga 25 μl kita biasa membicarakan”
paling baik pada MDQ 50-100 ppm “.

2. Kisaran Linier

Detektor TCD memiliki linear range sekitar 10-4. Ini merupakan range terbatas,
tetapi sangat berguna pada konsentrasi yang jauh lebih tinggi dibandingkan
FID.

3. Selektivitas

Detektor TCD adalah universal, memberi respon terhadap semua


senyawa kecuali gas pembawa itu sendiri. Digunakan secara luas untuk gas-gas
ringan dan yang telah ditetapkan. Karena detektor FID tidak menghasilkan
sinyal dengan sampel-sampel tersebut, maka juga digunakan untuk analisa air
dan senyawa anorganik.

4. Persyaratan

Detektor TCD memerlukan pengatur temperatur yang baik, pengatur


aliran yang baik, gas pembawa murni dan power supply yang teratur.

• Detektor Ionisasi

Sejumlah besar detektor dalam kromatografi gas diklasifikasikan


sebagai Ionization Detectors. Dalam ionization detectors, konduktivitas elektrik
dari gas diukur pada kehadiran komponen analit. Konduktivitas elektrik dapat
meningkat sebagi hasil dari analit yang terionisasi dalam aliran gas atau

15
menurun sebagai hasil dari analit yang menyerap elektron dari gas yang
terionisasi.

B. Flame Ionization Detector (F.I.D.)

Pada F.I.D, sumber ionisasi adalah pembakaran biasanya berasal dari


hidrogen dan udara atau oksigen. Untuk sensitivitas maksimum kondisi
pembakaran memerlukan optimisasi. Untuk menentukan volume gas yang tidak
tertahan (waktu gas yang tertahan mis: puncak udara) digunakan methane
selama detektor tidak sensitif terhadap udara. FID ini sempurna dan mungkin
merupakan detektor yang paling banyak digunakan. Bersifat sensitif dan
digunakan secara ekstensif dengan kolom kapiler.

1. Sensitivitas (Minimum Detectable Quantity)

Beberapa perusahaan pembuat menunjukkan kromatogram dari 10-10,


bahkan 10-11 g untuk hidrokarbon sederhana. Ini merupakan detektor yang
sangat sensitif untuk senyawa organik, tetapi quantitas minimal yang dapat
terdeteksi dari beberapa sampel sebenarnya pada temperatur tinggi mungkin
mendekati 10-9 g.

2. Kisaran Linier

Dalam beberapa kasus parameter detektor yang dioptimalkan


sensitivitasnya (laju aliran hidrogen, laju aliran udara, diameter jet, dll) tidaklah
optimal untuk sampel berukuran besar. Linear range akan bergantung pada
sampel; kita jarang menemukan linear range lebih besar dari10-4 untuk steroids

16
atau beberapa obat-obatan. Ini merupakan fungsi dari zat pencemar sampel,
adsorpsi kolom seperti halnya karakteristik detektor.

Gambar 2.5. Detektor


FID

3. Selektivitas

FID akan memberi respon hanya terhadap senyawa organik, tidak pada
udara atau air atau gas ringan yang telah ditetapkan. Pada senyawa-senyawa
organik, selektivitas sangat kecil.

4. Persyaratan Operasional

FID memerlukan tiga persediaan gas bersih, hidrogen, udara dan gas
pembawa. Harus ada elektrometer untuk menguatkan sinyal yang sangat kecil
yang dihasilkan dari pembakaran. Harus dipanaskan untuk menghindari
kondensasi air atau fase cair dari kolom

C. Electron Capture Detector (E.C.D.)

Electron Capture Detector (E.C.D.) beroperasi pada prinsip electrons


attachments oleh molekul analit. Nitrogen sebagai gas pembawa mengalir

17
melalui detektor dan terionisasi oleh sumber elektron biasanya tritum yang
teradsorbsi pada Titanium atau Scandium (TiH3, ScH3) atau Nickel 63 (Ni63).
Nitrogen terionisasi akan membentuk arus antar elektroda-elektroda.

Analit tertentu masuk ke detektor akan bereaksi dengan elektron-


elektron untuk membentuk ion negatif.

R- X + e → R- X –

Pada saat ini terjadi, arus akan berkurang sebagai respon negatif.
Detektor akan sangat sensitif terhadap molekul yang mengandung atom-atom
elektronegatif. ( N. O, S, F, Cl)

Gambar 2.6 Detektor ECD

Detektor dapat dioperasikan dalam D.C. maupun mode pulsa dengan 1


us 50v. Mode pulsa terjadi pengumpulan elektron-elektron yang bergerak bukan
ion negatif yang lebih lambat dan lebih berat, untuk menghasilkan sensitifitas
yang lebih besar.

18
Electron capture detector sangat sensitif terhadap molekul tertentu,
yaitu : Alkil halide,Conjugated carboxyl,Nitrit,Nitrat dan Organometals. Tetapi
tidak sensitif terhadap : Hydrocarbons,Alcohols dan Ketones

Sebagai akibat dari sensitivitasnya terhadap alkil halida, ECD ini telah
digunakan secara ekstensif dalam analisa pestisida dan obat-obatan dimana alkil
halida telah diderivatisasi. Pestisida tertentu telah terdeteksi pada sub picogram
level. Karena tingginya sensitivitas, ECD ini telah digunakan secara ekstensif
pada kolom kapiler.

1. Sensitivitas

Bergantung pada jumlah, jenis dan posisi kehadiran atom elektronegatif,


ECD dapat mendeteksi 10-9 hingga 10-12 g. Untuk beberapa pestisida ini
merupakan detector yang sangat sensitif. ECD memiliki linear range 102 hingga
103. Hal ini memerlukan penggunaan kurva kalibrasi, sering dibersihkan dan
teknik analisa yang baik jika mengharapkan hasil kuantitaif.

2. Selektivitas

ECD sangat selektif. Hampir semua senyawa organik tidak merespon,


dan responnya yang tinggi terhadap senyawa terpilih (pestisida) membuat ECD
menjadi detektor sempurna untuk trace analysis.

3. Persyaratan

Sumber-sumber radioaktif digunakan (kecuali Beckman) untuk


mengawali respon ionisasi. Hal ini memerlukan ijin AEC di USA dan tindakan
pencegahan khusus pada saat membersihkan atau mengganti detektor. Gas

19
pembawa yang sangat bersih sangat dibutuhkan dan dalam model plat paralel
gas pembawa khusus dan pulsed power supply sangat dianjurkan. Kalibrasi
yang ekstensif dan kontinyu (terus-menerus) perlu dilakukan untuk
mendapatkan hasil kuantitatif

D. Thermionic Spesific Detector untuk Nitrogen dan


Phosphorus

Dengan mengoperasikan flame ionization detector pada temperatur lebih


rendah dan memasukkan atom-atom logam alkali ke dalam resulting plasma,
maka detektor dapat dibuat selektif terhadap nitrogen dan phosphorus.

Gambar 2.7 Detektor TSD

Versi modern dari detektor, Thermionic Spesific Detector untuk


Nitrogen dan fosfor menggunakan ujung keramik yang dipanaskan secara
elektrik yang terdiri dari logam alkali-Rubidium yang dioperasikan dalam
lingkungan hidrogen-udara. Sebuah potensial dipasang pada sistem dan
menghasilkan arus yang sebanding dengan konsentrasi nitrogen atau fosfor
yang ada. Mekanisme yang pasti pada operasional ini masih belum jelas.

20
Thermionic Spesific Detector digunakan secara ekstensif dalam analisa obat-
obatan dan pestisida.

Linear Range

6. Pengaruh Suhu

Ada tiga tempat dalam kromotograf di mana suhu harus dikontrol.


Pertama, suhu tempat injeksi menentukan kecepatan cuplikan diuapkan. Tempat
injeksi diatur pada suhu agak tinggi, untuk cuplikan yang tidak terurai kena
panas, biasanya sekitar 500C di atas titik didihnya. Hal ini diperlukan supaya
semakin cepat cuplikan masuk ke dalam kolom dalam volume sanagt kecil.
Kedua, detektor harus cukup panas sehingga penyusun cuplikan tidak
mengembun di situ. Tetapi kepekaan detektor penghantar panas menurun sesuai
dengan penurunan suhu, sehingga suhu optimum dipilih sedikit di atas suhu
kolom.

Akhirnya suhu kolom itu sendiri merupakan faktor penting yang


menentukan resolusi dan retensi. Pada suhu tinggi, senyawa-senyawa yang
dipisahkan akan cenderung ke fasa gas karena penurunan kelarutan. Senyawa-
senyawa itu akan keluar cepat dan berhimpitan-resolusi jelek. Pada suhu
rendah, senyawa-senyawa itu cenderung lebih senang ke fasa cair, akan
teresolusi lambat dan biasanya resolusi menjadi lebih baik

21
2.2.2 Pengklasifikasian Berdasarkan Pasangan Fasa Gerak dan Fasa Diam
1. Kromatografi Cairan Padat
Metode kromatografi ini banyak digunakan untuk analisis biokimia dan
organik. Teknik pelaksanaanya dilakukan dengan kolom kaca,dimana fasa diam dapat
dipilih silica gel atau alumina
2. Kromatografi Cairan-Cairan
Kromatogafi cairan-cairan (KCC) adalah kromatografi dengan fasa
gerak berupa cairan dan fasa diam juga berupa cairan yang merupakan lapisan
tipis pada padatan pendukung. KCC lebih efisien daripada penyarian berulang
kali. Hal ini disebabkan oleh permukaan luas antara fasa gerak dan fasa
diam,dengan cepat dicapai distribusikeseimbangan senyawa terlarut antara dua
fasa tersebut. KCC dapat digunakan terhadap jenis cuplikan yang luas,polar
dan non polar. Dasar dari penggunaan yang luas ini adalah variasi yang luas dari
fasa gerak dan fasa diam yang digunakan. Keuntungan utama dari KCC adalah
kemampuan membuat kolom yang dapat reprodusibel. Cuplikan jarang berubah
selama pemisahan karena padatan pendukung relative inert dan pada umumnya
pemisahan dilakukan pada suhu kamar.
Ada 2 macam penggunaan KCC. Pertama padatan pendukung dipenuhi dengan
fasa diam polar dan sebagai fasa gerak digunakan pelarut relative nonpolar.
System ini digunakan pemisahan senyawa polar karena senyawa itu lebih
tertahan oleh fasa diam polar. Untuk senyawa non polar digunakan fasa diam
yang kurang polar,sistem ini dinamakan kromatografi cairan-cairan fasa
terbalik.Dalam KCC digunakan padatan pendukung yang relative inert. Bahan
itu mempunyai luas permukaan rendah dan mengandung pori-pori relative besar
yang akan mengurangi penyerapan pendukung.Walaupun KCC dengan fasa
diam cair memberikan mekanisme pemisahan yang unik dan reprodusibel,suatu
yang sukar adalah menjaga supaya kondisi tetap dalam waktu yang lama. Waktu
yang hidup yang pendek dan harga kolom dapat merupakan kendala dari system
KCC. Kolom dapat digunakan untuk pemisahan berkali-kali jika beberapa

22
kesulitan pokok dapat diantisipasi dan dikontrol.Kolom dengan fasa terikat
dapat digunakan terus menerus selama beberapa bulan tanpa terjadi perubahan
pada karakternya. Bahan fas terikat ini digunakan dengan beberapa macam
gugus fungsi dan digunakan untuk pemisahan berbagai macam senyawa. Fasa
diam dengan polimer silicon terikat secara kimia dapat digunakan dengan
perubahan besar pada fase gerak tanpa takut terurai.
Ada 4 teknik untuk melapisi cairan pada padatan pendukung KCC dan masing-
masing mempunyai keuntungan untuk penggunaan tertentu. Kebanyakan teknik
untuk fasa diam terikat secara mekanik pada pendukung adalah cara penguapan
pelarut. Pada teknik ini fasa diam yang tidak mudah menguap dilapiskan pada
pendukung dengan bantuan pelarut yang mudah menguap. Kolom KCC yangb
efisien dapat juga dibuat dengan cara pelapisan in situ. Pelapisan pendukung in
situ dapat dilakukan dengan suatu teknik,misalnya jika fasa dia mempunyai
kekentalan cukup rendah dapat dilapiskan langsung pada struktur berpori dari
pendukung yang telah dimasukkan dalam kolom. Teknik ini efektif pada
pembuatan kolom dengan system tiga cairan terdiri dari etanol dan 2,2,4-
trimetilpentana. Dua cara yang telah digunakan untuk melapiskan cairan fasa
diampada pendukung. Pada cara pertama,fasa gerak dijenuhi dengan fasa diam
yang dipompakan melalui kolom yang baru saja dibuat untuk menghilangkan
udara. Diikuti fasa diam diinjeksikan ke dalam kolom,maka struktur berpori
dari pendukung diisi dengan fasa diam. Pada cara kedua,fasa diam dipompakan
melalui kolom kering. Kolom itu kemudian dialiri fasa gerak yang setara
denagn fasa diam, yamg kan menghilangkan kelebihan cairan fasa diam pada
celah antar partikel. Dua teknis ini efektif untuk cairan fasa diam yang tidak
kental.
Untuk cairan fasa diam yang kental,fasa diam dilarutkan dalam pelarut yang
cocok kemudian dipompakan ke dalam kolom yang baru saja dibuat. Dengan
fasa diam kental,kadang-kadang perlu mengalirkan fasa gerak melalui kolom
yang dilapisi secara in situ selam beberapa jam untuk menghilangkan kelebihan

23
fasa diam yang terdapat diantara partikel pendukung. Menaikkan kekentalan
fasa gerak akan membantu proses ini. Keuntungan praktis yang nyata dari
system pelapisan in situbahwa kolom dapat dilapisi ulang beberapa kali sebelum
diganti.suatu kolom yang sudah tidak dapat digunakan,fasa diamnya dapat
dihilangkan dari pendukung dengan mengalirkan pelarut yang cocok misalnya
diklorometana,dan kemudian pendukung dilapisi lagi dengan fasa diam secara
in situ.
Ada beberapa hal dari fasa gerak yang harus dipertimbangkan jika menyusun
system KCC. Pertama,fasa gerak harus tidak bercampur dengan fasa diam.
Terutama fase gerak sebaiknya mempunyai kekentalan serendah mungkin untuk
mendapatkan efisiensi kolom yang tinggi. Detector dapat juga membatasi fasa
gerak yang digunakan. Misalnya pelarut yang mnyerap kuat dalam ultraviolet
sebaiknya dihindari jika digunakan detector fotometri ultraviolet.
Harga,toksisitas,kemurnian dan stabilitas dari suatu pelarut dapat juga sebagai
bahan pertimbangan. Yang paling penting adlah selektivitas system cairan-
cairan untuk cuplikan tertentu.
3. Kromatografi Gas Padat
Digunakan sebelum tahun 1800 untuk memurnikan gas. Pada waktu dulu teknik
ini tidak berkembang karena keterbatasannya yang sama seperti halnya
kromatografi cairan-padat,tetapi penelitian lebih lanjut dengan macam fasa
padat baru memperluas penggunaan teknik ini.
4. Kromatografi Gas Cair
Merupakan metode pemisahan yang sangat efisien dan serba guna. Teknik ini
telah menyebabkan revolusi dalam kimia organic,sejak dikenalkan pertama kali
oleh James dan Martin pada 1052. Hambatan yang paling utama adalah bahan
cuplikan harus mempunyai tekanan uap paling tidak beberapa torr pada suhu
kolom. System ini sangat baik sehingga dapat dikatakan sebagai metode pilihan
dalam kromatografi karena dapat memisahkan dengan cepat dan peka.

24
2.2.3 Pengklasifikasian Berdasarkan Mekanisme Pemisahan
1. Kromatografi Adsorpsi
Adsorpsi adalah senyawa kimia dapat terpisah-pisah disebabkan oleh
daya serap adsorban terhadap tiap-tiap komponen kimia tidak
sama.Menggunakan fasa diam berupa zat padat dan fasa gerak berupa zat cair
atau gas.Dalam cara ini zat terlarut diadsorpsi pada permukaan partikel padat.
Contoh kromatografi adsorpsi ini yaitu berupa kromatografi lapis tipis(KLT).
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan cara pemisahan campuran
senyawa menjadi senyawa murninya dan mengetahui kuantitasnya yang
menggunakan. Kromatografi juga merupakan analisis cepat yang memerlukan
bahan sangat sedikit, baik penyerap maupun cuplikannya. KLT dapat digunakan
untuk memisahkan senyawa – senyawa yang sifatnya hidrofobik seperti lipida –
lipida dan hidrokarbon yang sukar dikerjakan dengan kromatografi kertas. KLT
juga dapat berguna untuk mencari eluen untuk kromatografi kolom, analisis
fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom, identifikasi senyawa secara
kromatografi, dan isolasi senyawa murni skala kecil. Pelarut yang dipilih untuk
pengembang disesuaikan dengan sifat kelarutan senyawa yang dianalisis. Bahan
lapisan tipis seperti silika gel adalah senyawa yang tidak bereaksi dengan
pereaksi – pereaksi yang lebih reaktif seperti asam sulfat.
Pelaksanaan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis
silika atau alumina yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau
plastik yang keras. Jel silika (atau alumina) merupakan fase diam. Fase diam
untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansi yang mana
dapat berpendarflour dalam sinar ultra violet. Fase gerak merupakan pelarut
atau campuran pelarut yang sesuai.Pelaksanaan ini biasanya dalam pemisahan
warna yang merupakan gabungan dari beberapa zat pewarna atau pemisahan
dan isolasi pigment tanaman yang berwarna hijau dan kuning. Pelaksanaan
kromatografi biasanya digunakan dalam pemisahan pewarna yang merupakan
sebuah campuran dari beberapa zat pewarna.

25
Jumlah perbedaan warna yang telah terbentuk dari campuran,
pengukuran diperoleh dari lempengan untuk memudahkan identifikasi senyawa-
senyawa yang muncul. Pengukuran ini berdasarkan pada jarak yang ditempuh
oleh pelarut dan jarak yang tempuh oleh bercak warna masing-masing.

Ketika pelarut mendekati bagian atas lempengan, lempengan


dipindahkan dari gelas kimia dan posisi pelarut ditandai dengan sebuah garis,
sebelum mengalami proses penguapan.
Pengukuran berlangsung sebagai berikut:

Nilai Rf untuk setiap warna dihitung dengan rumus sebagai berikut:


Rf= jarak yang ditempuh oleh komponen
jarak yang ditempuh oleh pelarut

Sebagai contoh, jika komponen berwarna merah bergerak dari 1.7 cm


dari garis awal, sementara pelarut berjarak 5.0 cm, sehingga nilai Rf untuk
komponen berwarna merah menjadi:nilai Rf yang akan diperoleh untuk setiap
warna akan selalu sama. Sebagai contoh, nilai Rf untuk warna merah selalu
adalah 0.34. Namun, jika terdapat perubahan (suhu, komposisi pelarut dan
sebagainya), nilai tersebut akan berubah.

c. Mengidentifikasi senyawa-senyawa

1. Cara Kerja Kromatografi Lapis Tipis

26
a.Fase diam-jel silica

Jel silika adalah bentuk dari silikon dioksida (silika). Atom silikon
dihubungkan oleh atom oksigen dalam struktur kovalen yang besar. Namun,
pada permukaan jel silika, atom silikon berlekatan pada gugus -OH. Jadi, pada
permukaan jel silika terdapat ikatan Si-O-H selain Si-O-Si. Gambar ini
menunjukkan bagian kecil dari permukaan silika.

Permukaan jel silika sangat polar dan karenanya gugus -OH dapat
membentuk ikatan hidrogen dengan senyawa-senyawa yang sesuai disekitarnya,
sebagaimana halnya gaya van der Waals dan atraksi dipol-dipol. Fase diam
lainnya yang biasa digunakan adalah alumina-aluminium oksida. Atom
aluminium pada permukaan juga memiliki gugus -OH. Apa yang kita sebutkan
tentang jel silika kemudian digunakan serupa untuk alumina.

b. Fasa gerak

Pada proses serapan, yang terjadi jika menggunakan jel silica, alumina
dan fasa diamnya, pemilihan pelarut mengikuti aturan kromatografi kolom

27
serapan. Sistem tak berair paling banyak digunakan dan contoh pelarut organic
dalam seri pelarut miksotrop diberikan dalam table yang meliputi (sifat hidrofob
menaik) methanol, asam asetat, etanol, aseton, etil asestat, eter, klorofrom (perlu
diperhatikan pada klorofrom yang distabilkan dengan etanol) benzene,
silokheksana, an eter petroleum. Kelompom seri pertama untuk pemisahan
senyawa hidrofil, sedangkan kelompok pelarut seri kedua untuk pemisahan
senyawa lipofil.

Jika sebagai fasa gerak digunakan system pelarut campuran, pada


lapisan fasa diam susunan pelarut itu dapat mengalami perubahan sedikit demi
sedikit. Hal ini akan menghasilkan kedapat-ulangnya agak jelek. Oleh
karenanya system dua pelarut lebih disenangi. Hal yang mempengaruhi kualitas
pemisahan dan kedapat-ulangnya adalah kejenuhan bejana pengembang.

Seri pelarut miksotrop

Air n- Amil
alkohol
Formamida
Etil asetat
Metanol
Eter
Asam asetat
n-Butil asetat
Etanol
Kloroform
Isopropanol
Benzena
Aseton
Toulena
n-propanol

28
tert-butanol Sikloheksana

Fenol Eter
petroleum
n-Butanol
Petroleum

Minyak
parafin

c. Senyawa-senyawa pemisah dari Kromatogram

Ketika pelarut mulai membasahi lempengan, pelarut pertama akan


melarutkan senyawa-senyawa dalam bercak yang telah ditempatkan pada garis
dasar. Senyawa-senyawa akan cenderung bergerak pada lempengan
kromatografi sebagaimana halnya pergerakan pelarut.

Bagaimana cepatnya senyawa-senyawa dibawa bergerak ke atas pada


lempengan, tergantung pada: • Kelarutan senyawa dalam pelarut. • Senyawa
melekat pada fase diam, misalnya jel silika. Senyawa yang dapat membentuk
ikatan hidrogen akan melekat pada jel silika lebih kuat dibanding senyawa
lainnya hanya dapat mengambil bagian interaksi van der Waals yang lemah.
Kita mengatakan bahwa senyawa ini terjerap lebih kuat dari senyawa yang
lainnya. Penjerapan merupakan pembentukan suatu ikatan dari satu substansi
pada permukaan. Terdapat perbedaan bahwa ikatan hidrogen pada tingkatan
yang sama dan dapat larut dalam pelarut pada tingkatan yang sama pula. Ini
tidak hanya merupakan atraksi antara senyawa dengan jel silika. Atraksi antara
senyawa dan pelarut juga merupakan hal yang penting-hal ini akan
mempengaruhi bagaimana mudahnya senyawa ditarik pada larutan keluar dari
permukaan silika.

29
Penyerapan pada kromatografi lapis tipis bersifat tidak permanen,
terdapat pergerakan yang tetap dari molekul antara yang terjerap pada
permukaan jel silika dan yang kembali pada larutan dalam pelarut. Dengan jelas
senyawa hanya dapat bergerak ke atas pada lempengan selama waktu terlarut
dalam pelarut. Ketika senyawa dijerap pada jel silika-untuk sementara waktu
proses penjerapan berhenti-dimana pelarut bergerak tanpa senyawa. Itu berarti
bahwa semakin kuat senyawa dijerap, semakin kurang jarak yang ditempuh ke
atas lempengan.

2. Kromatografi Partisi
Partisi adalah kelarutan tiap-tiap komponen kimia dalam cairan
pengelusi (eluen) tidak sama dimana arah gerakan eluen disebabkan oleh gaya
sentrifugal sehingga komponen kimia dapat bergerak dengan kecepatan yang
berbeda-beda yang menyebabkan terjadi pemisahan.
Teknik ini tergantung pada partisi zat padat diantara dua pelarut yang
tidak dapat bercampur salah satu diantaranya bertindak sebagai rasa diam dan
yang lainnya sebagai fasa gerak. Pada keadaan awal dari kromatografi cair
(LSC), rasa diamnya dibuat dengan cara yang sama seperti pendukung pada
kromatografi gas (GC). Fasa diam (polar atau nonpolar) dilapisi pada suatu
pendukung inert dan dipak kedalam sebuah kolom. Kemudian rasa gerak
dilewatkan melalui kolom. Bentuk kromatografi partisi ini disebut kromatografi
cair cair (LLC). Untuk memenuhi kebutuhan akan kolom-kolom yang dapat
lebih tahan lama, telah dikembangkan pengepakan fase diam yang berikatan
secara kimia dengan pendukung inert. Bentuk kromatografi partisi ini disebut
kromatografi fase terikat (BPC = Bonded Phase Chromatography). BPC dengan
cepat menjadi salah satu bentuk yang paling populer dari KCKT. Kromatografi
partisi (LLC dan BPC), disebut "fase normal" bila fase diam lebih polar dari
fase gerak dan "fase terbalik" bila fase gerak lebih polar dari pada fase
diam.Didasarkan pada partisi zat terlarut antara dua pelarut yang tidak

30
bercampur yaitu fasa diam dan fasa gerak. Fasa diam dan fasa gerak berupa zat
cair atau gas. Contoh kromatografi partisi yaitu berupa kromatografi kertas
(KKt).

Kromatografi kertas merupakan salah satu metode untuk identifikasi


komponen kimia dari suatu campuran zat dengan bantuan perbedaan sifat fisik
masing-masing komponen. Kromatografi digunakan untuk memisahkan
campuran dari substansinya menjadi komponen-komponennya. Seluruh
bentuk kromatografi bekerja berdasarkan prinsip yang sama. Seluruh bentuk
kromatografi memiliki fase diam (berupa padatan atau cairan) dan fase gerak
(cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa
komponen-komponen dari campuran bersama-sama. Komponen-komponen
yang berbeda akan bergerak pada laju yang berbeda.

Dalam kromatografi kertas, fase diam adalah kertas serap. Fase gerak
adalah pelarut atau campuran pelarut yang sesuai. Adsorben (penyerap) dalam
kromatografi kertas adalah kertas saring yaitu selulosa. Cairan fase bergerak
yang biasanya berupa campuran dari pelarut organik dan air, akan mengalir
membawa noda cuplikan yang ditotolkan pada kertas dengan kecepatan
berbeda. Fase gerak (pelarut) dapat beragam, misal: air, etanol, asam asetat,
dll. Kromatografi kertas digunakan baik untuk analisa kualitatif maupun
kuantitatif. Senyawa-senyawa yang dipisahkan kebanyakan bersifat sangat
polar, misalnya: asam-asam amino, gula, atau pigmen-pigmen.

Larutan cuplikan atau campuran zat yang akan dipisahkan


ditotolkan pada kertas saring di daerah yang sudah diberi tanda dimana
cuplikan tersebut akan meluas membentuk sebuah noda yang bulat. Setelah
menotolkan cuplikan maka tunggu totolan cuplikan tersebut kering. Diameter
totolan yang membentuk noda tidak lebih dari 0,4 cm. Hal ini dikarenakan

31
agar noda cuplikan (totolan cuplikan) pada saat dilakukan elusi, setelah
pengeringan tidak menyatu antara noda satu dengan noda yang lain, sehingga
dapat memisah. Setelah noda (totolan cuplikan) kering masukkan atau gantung
kertas dalam bejana tertutup (lemari kromatografi) yang tercelup dalam
pelarut atau eluen yang dipilih sebagai fasa bergerak. Jangan sampai noda
tercelup dalam eluen (pelarut) karena dapat mengakibatkan senyawa yang
dipisahkan akan terlarut dari kertas.
Pelarut bergerak melalui serat-serat dari kertas oleh gaya kapiler dan
menggerakkan komponen (pita

kromatogram) dalam laju yang berbeda. Bila permukaan pelarut telah


bergerak dengan cukup jauh dan dengan waktu yang ditentukan, maka kertas
diambil dari bejana dan batas permukaan pelarut diberi tanda lalu kertas
dikeringkan (pengeringan bisa dilakukan dengan hairdryer). Jika senyawa-
senyawa berwarna maka akan terbentuk dan terlihat noda-noda yang terpisah.
Bila senyawa tak berwarna maka harus dideteksi dengan cara fisika dan kimia.
Cara yang biasa digunakan adalah dengan suatu pereaksi yang memberikan
sebuah warna dari senyawa-senyawa tersebut. Untuk mendeteksi bisa juga
dengan sinar ultra ungu atau teknik radio kimia.

Gambar 2.8

32
Teknik

Kertas dipotong memanjang sesuai ukuran bejana yang akan


digunakan. Kertas yang dipakai adalah kertas Whatmann yang secara
komersial tersedia dalam berbagai macam ukuran dan lembaran. Biasanya
dipakai kertas Whatmann no. 1 dengan kecepatan sedang. Sejumlah cuplikan
ditotolkan menggunakan mikropipet pada jarak beberapa cm dari salah satu
ujung kertas yang sudah diberi garis horisontal dengan pensil. Spot atau noda
yang terbentuk dikeringkan, lalu kertas dimasukkan dalam bejana tertutup
yang sudah dijenuhkan dengan pelarut yang sesuai untuk dikembangkan.
Terdapat tiga metode pengembangan pada kromatografi kertas, yaitu:

• Metode penaikkan (ascending)


Prinsipnya: Kertas digantung sedemikian rupa sehingga bagian bawah kertas
tercelup pada pelarut yang terletak di dasar bejana. Noda harus diusahakan
tidak sampai tercelup karena dapat larut dalam pelarut. Pelarut akan naik
melalui serat-serat kertas oleh gaya kapiler yang menggerakkan komponen
dengan jarak yang berbeda-beda.
• Metode penurunan (descending)
Prinsipnya: Kertas digantung dalam bejana dimana aliran mulai bergerak,
dicelupkan dalam palung kaca yang berisi pelarut. Pelarut bergerak turun
membawa komponen melalui gaya kapiler dan gaya gravitasi.
• Metode mendatar (radial)
Kertas dibentuk bulat yang tengahnya diberi sumbu dari benang atau gulungan
kertas. Noda ditempatkan pada pusat kertas kemudian pelarut akan naik
melalui sumbu sehingga membasahi kertas untuk kemudian mengembang
melingkar membawa komponen yang dipisahkan. Bila permukaan pelarut
telah mengembang atau bergerak pada batas tertentu, maka kertas dikeluarkan
dari bejana dan batas permukaan pelarut diberi tanda lalu kertas dikeringkan.

33
Jika senyawa yang dipisahkan berwarna maka akan nampak sebagai noda-
noda yang terpisah. Tetapi jika komponen zat tidak berwarna (umumnya
senyawa organik), maka dapat dideteksi dengan cara fisika atau kimia.

Pada cara fisika noda komponen disinari lampu ultraviolet dengan


panjang gelombang 254-370 nm yang akan memberikan fluorescensi. Secara
kimia noda disemprot dengan pereaksi tertentu, sehingga memberikan warna
spesifik. Biasanya untuk mendeteksi asam-asam amino digunakan pereaksi
ninhidrin 0,1 % dalam butanol. Warna akan nampak merah-ungu sekitar 4
menit setelah dipanaskan 100oC. Setelah letak noda komponen diketahui dan
diberi tanda batas harga Rf dapat diketahui.

Kertas digantungkan pada wadah yang berisi campuran pelarut yang


sesuai didalamnya. Perlu diperhatikan bahwa batas pelarut berada dibawah
garis pada bercak diatasnya. Alasan untuk menutup wadah adalah untuk
meyakinkan bahwa astmosfer dalam gelas kimia terjenuhkan dengan uap
pelarut. Karena pelarut bergerak lambat pada kertas, komponen-komponen
yang berbeda dari campuran tinta akan bergerak pada laju yang berbeda dan
campuran dipisahkan berdasarkan pada perbedaan bercak warna.

Campuran asam amino akan memisahkan asam amino tertentu yang


terdapat dalam campuran. Setetes larutan campuran ditempatkan pada garis
dasar kertas, dan dengan cara yang sama ditempatkan asam amino yang telah
diketahui ditotolkan disampingnya. Kertas lalu ditempatkan dalam pelarut
yang sesuai dan dibiarkan seperti sebelumnya. Posisi pelarut depan ditandai
dengan pensil dan kromatogram dikeringkan dan disemprotkan dengan larutan
ninhidrin. Ninhidrin bereaksi dengan asam amino menghasilkan senyawa
berwarna, utamanya coklat atau ungu. Penyemprotan ninhidrin tujuannya

34
adlah agar bercak noda terlihat dan terbentuk warna sehingga dapat
mengetahui keberadaan asam amino.

3. Kromatografi Penukar Ion


Teknik ini tergantung pada penukaran (adsorpsi) ion-ion di antara fase gerak
dan tempat-tempat berion dari pengepak. Kebanyakan mesin-mesin berasal dari
kopolimer divinilbenzen stiren dimana gugus-gugus fungsinya telah ditambah.
Asam sulfonat dan amin kuarterner merupakan jenis resin pilihan paling baik
untuk digunakan Keduanya, fase terikat dan resin telah digunakan. Teknik ini
digunakan secara luas dalam life sciences dan dikenal untuk pemisahan asam-
asam amino. Teknik ini dapat dipakai untuk keduanya kation dan anion.

4. Kromatografi Gel
Teknik ini unik karena dalam pemisahan didasarkan pada ukuran molekul dari
zat padat. Pengepak adalah suatu gel dengan permukaan berlubang-lubang
sangat kecil (porous) yang inert. Molekul-rnolekul kecil dapat masuk dalarn
jaringan dan ditahan dalam fase gerak yang menggenang (stagnat mobile
phase). Molekul- molekul yang lebih besar, tidak dapat masuk kedalam jaringan
dan lewat melalui kolom tanpa ditahan. Kromatografi eksklusi rnernpunyai
banyak nama, yang paling umum disebut permeasi gel (GPC) dan filtrasi gel.
Apapun namanya, mekanismenya tetap sama. Dalam bidang biologi, Sephadex,
suatu Cross-linked dextran gel, telah digunakan secara luas, hanya pengepak
keras dan semi keras (polistiren, silika, glass) yang digunakan dalam KCKT.
Dextran gel lunak tidak dapat menahan kinerja diatas 1 atau 2 atmosfer. Tenik
ini dikembangkan untuk analisis polimer-polimer dan bahan-bahan biologi,
terutama digunakan untuk rnolekul-molekul kecil.

35
BAB III
KESIMPULAN

Kromatografi dibagi dalam beberapa klasifikasi,yaitu :


Berdasarkan macam fasa gerak terdiri dari kromatografi cair (KCKT) dan
kromatografi gas

36
Berdasarkan pasangan fasa gerak dan fasa diam terdiri dari kromatografi cairan
padat,kromatografi cairan-cairan,kromatografi gas padat dan kromatografi gas
cair.
Berdasarkan mekanisme pemisahan terdiri dari kromatografi adsorpsi,
kromatografi partisi, kromatografi penukar ion, kromatografi eksklusi/gel

DAFTAR PUSTAKA

Roy J. Gritter, James M. Bobbit, Arthur E. S., 1991. Pengantar Kromatografi.


Penerbit ITB. Bandung.

37
J. B. Harbone. 1987. Metode Fitokimia : Penuntun Cara Modern
Menganalisis Tumbuhan. Penerbit ITB. Bandung.
K. Hostettmann, M. Hostettmann, A. Marston. 1995. Cara Kromatografi
Preparatif. Penerbit ITB. Bandung.
Ibnu Gholib Gandjar. Abdul Rahman. 2008. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka
Pelajar. Yogyakarta.
Conners.A.K. ”Pharmaceutical Analysis” Solvent Extraction. Kisman .Dr.
Sastro, ddk .1994. Analisis Farmasi Cet. 2 , Gadjah Mada University Press,
Yogyakarta

Basset, J, et al. 1994. Buku Ajar Vogel; Kimia Analisis Kuantitatif Anorganik.
Penerbit buku kedokteran EG

C. Jakarta. Day & Underwood. 1980. Analisa Kimia Kuantitatif. Edisi Keempat.
Erlangga. Jakarta.

Done dkk, 1974; Snyder dan Kirkland, 1979; Hamilton dan Sewell, 1982;
Johnson dan Stevenson, 1978.

Drs. Sudjadi.1988.Metode Pemisahan. Penerbit Kanisius.Yogyakarta

http://wawan-junaidi.blogspot/kromatografi-kertas
http://Annisanfushie`sWeblog/KROMATOGRAFI.KERTAS

38