TUGAS MIKROBIOLOGI INDUSTRI

Dosen Pengampu : Dr. Supartono, M.S

Disusun oleh :
SUPRIYANTO
NIM : 0402510082

PROGRAM PASCA SARJANA

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN IPA (KIMIA)
UNIVERSITAS NEGERI SEMARANG (UNNES)
Tahun Akademik 2010/2011
 Susu Bubuk Formula Bayi Yang Terkontaminasi
Bakteri Enterobacter sakazakii

Kenji Oonaka, Katsunori Furuhata, Motonobu Hara1, and Masafumi Fukuyama

Laboratory of Microbiology, School of Life and Environmental Science, and 1Laboratory of
Microbiology II,
School of Veterinary Medicine, Azabu University, Kanagawa 229-8501, Japan
(Received August 19, 2009. Accepted February 8, 2010)

RINGKASAN:
Dalam penelitian dasar ini, kami meneliti untuk memperjelas bagaimana jalan dan sumber
infeksi Enterobacter sakazakii dapat menginfeksi kepada anak-anak, kami menganalisis susu
bubuk formula bayi (PIF) yang ada di pasaran. Untuk mempelajari efek kontaminasi dari
bakteri ini dilakukan tes sensitivitas terhadap obat antimikroba yang ada. Dari 149 sampel yang
diteliti (61 sampel dari produksi susu di dalam negeri dan 88 sampel dari produksi susu impor),
ternyata 36 sampel (24,2%) dapat dilakukan isolasi terhadap Enterobacteriaceae, dengan rincian
12 sampel (19,7%) dari produksi dalam negeri Jepang dan 24 sampel (27,3%) dari produksi dari
luar Jepang. Dari 36 sampel yang mengandung Enterobacteriaceae, ternyata E. Sakazakii dapat
diisolasi secara pasti di 9 sampel (6,6%) dengan rincian sebagai berikut 4 sampel (6,6%) dari 61
sampel hasil produksi dalam negeri dan 5 sampel (5,7%) dari 88 sampel hasil produksi dari luar
negeri. Dari 9 sampel yang mengandung E. Sakazakii ternyata 8 sampel memiliki kandungan
bakteri sebesar 0,36 MPN/100 gram, sedangkan 1 sampel susu impor menunjukan tingkat
bakteri 0,91 MPN/100 gram.
Dalam uji tes sensitivitas terhadap E. sakazakii yang diperoleh, kami membandingkan harga
MIC90. Didapatkan hasil sebagai berikut, ternyata E. sakazakii sangat sensitif terhadap 9 zat
antimikroba yaitu: cefotaxime, ceftriaxone, cefoperazone, seftazidim, cefpirome, cefozopran,
gentamisin, meropenem, dan ciprofloxacin, dan agak peka terhadap 5 zat antimikroba seperti:
piperasilin, erythromycin, minocycline, kloramfenikol, dan rifampisin. Namun, tahan terhadap
2 zat anti mikroba ampisilin dan lincomycin.

A. PENDAHULUAN
Enterobacter sakazakii adalah salah satu jenis bakteri anaerob yang
termasuk dalam kelompok Enterobacteriaceae, bakteri ini terdapat secara luas di
saluran usus hewan dan lingkungan alam. Awalnya jenis bakteri ini diidentifikasi
sebagai Enterobacter cloacae berdasarkan karakteristik morfologinya yang
menghasilkan suatu pigmen kuning. Namum pada tahun 1976, Steigerwalt et al
melaporkan bahwa ada perbedaan morfologi antara bakteri yang menghasilkan
pigmen dan non-pigmennya sehingga bakteri ini tidak dapat dimasukan kedalam
jenis bakteri yang sama. Pada tahun 1980, Farmer et al kemudian memberi nama
bakteri jenis ini dengan nama E. Sakazakii.
Mengenai infeksi E. Sakazakii terhadap manusia dilaporkan pertama kali
oleh Urmenyi dan Franklin. Dalam laporan tersebut dijelaskan bahwa ada resiko
yang sangat tinggi dari bakteri ini yang dapat menginfeksi bayi (termasuk bayi
yang lahir prematur atau bayi yang lahir dengan berat badan rendah), karena
bakteri ini dapat menyebabkan membesarnya otak, necrotizing enterocolitis, dan
sepsis. Bahkan pada kasus-kasus yang parah, bakteri ini dapat menyebabkan
hidrosefali dan meningitis, dengan tingkat kematian yang tinggi sekitar 40-50%,
disertai dengan sequelae neurologis berat.
Di Jepang, bakteri ini menyebabkan beberapa kasus abses otak pada tahun
2007 dan kasus sepsis pada tahun 2009. Namun, sumber penyebab dan jalanya
menginfeksi kepada anak-anak saat itu tetap tidak dapat dijelaskan. Muytjens et
al. melaporkan bahwa dia dapat mengisolasi bakteri E. Sakazakii sebanyak 14,2%
dari susu bubuk formula bayi (PIF) yang diproduksi di 35 negara. Demikian juga
Leuscher dan Bew, dapat mengisolasi bakteri E. Sakazakii sebanyak 13,8% dari
susu bubuk formula bayi (PIF) di 11 negara.
Sebagai tanggapan terhadap laporan tersebut, kemudian pada tahun 2004
dan 2006 FAO/WHO mengadakan rapat bersama para ahli untuk menetapkan
adanya bahaya dari penyebaran bakteri E. Sakazakii melalui susu bubuk formula
bayi yang dapat membahayakan terhadap kesehatan manusia, khususnya para bayi
yang mengkonsumsinya. Dalam penelitian ini, kami menganalisa susu bubuk
formula bayi (PIF) yang diperkirakan telah terkontaminasi dengan melakukan tes
sensitivitas terhadap zat antimikroba.
B. BAHAN DAN METODE
1. Bahan:
Bahan yang digunakan untuk penelitian ini adalah 149 sampel susu bubuk
formula bayi (PIF) yang dibeli dari toko-toko eceran antara November
2006 dan Februari 2008 dengan rincian 61 sampel susu produksi dalam
negeri Jepang dan 88 sampel susu impor. Untuk sampel susu produksi
dalam negeri diambil 18 sampel yang paling banyak dibeli oleh
masyarakat untuk diuji 2 sampai 4 kali.
2. Isolasi Dan Identifikasi:
Jenis dan jumlah bakteri yang diisolasi diukur dengan menggunakan
metode MPN (3 metode berturut-turut) sesuai dengan pedoman FDA.
a. Kami menyiapkan 3 botol yang masing-masing berisi 900 mL, 90 mL,
dan 9 mL air suling steril, kemudian botol tersebut masing-masing
diisi dengan 100 gr, 10 gram, dan 1 gram susu bubuk formula bayi
(PIF).
b. Setelah PIF benar-benar larut, kemudian sampel disimpan pada suhu
37°C selama semalam.
c. Selanjutnya, setiap sampel diambil 10 mL dan dicampur dengan 90
mL EE dan disimpan kembali pada suhu 37°C selama semalam.
d. Dengan menggunakan loop, masing-masing media itu dioleskan pada
VRBG dan agar DFI, dan dijaga suhunya pada 37°C selama semalam.
e. Dengan menggunakan 4 cawan, kemudian dilakukan proses
pembuatan koloni kultur murni terhadap sampel yang diduga
mengandung bakteri.
f. Untuk melakukan pengetesan terhadap hasilnya, kemudian dilakukan
pengujian dengan menggunakan berbagai jenis agar-agar, misalnya
agar TSI, agar LIM dan agar kedelai tryptic (untuk uji oksidase).
g. Hasil pada pengetesan diperoleh hasil sebagai berikut: glukosa (+),
laktosa / sakarosa (+), gas (+), hidrogen sulfida (-), lisin (-), motilitas
(+), dan oksidase (-).
h. Setelah pembuatan kultur menggunakan agar-agar kedelai tryptic pada
suhu 25°C selama 3 hari, ternyata menghasilkan tegangan (strain)
berwarna kuning yang menunjukan bakteri E. Sakazakii memang ada
dalam sampel.
i. Untuk identifikasi lebih lanjut terhadap keberadaan bakteri tersebut,
dilakukan 47 kali uji biokimia dengan menggunakan alat VITEK2
untuk memastikan apakah gen rRNA 16 nya betul-betul milik E.
Sakazakii
 3. Tes sensitivitas obat :
Tes kepekaan obat dilakukan dengan menggunakan metode plat
pengenceran agar-agar sesuai dengan CLSI. Kita melakukan pengujian
terhadap 16 jenis obat antimikroba: 2 penisilin, 6 cephem, 1 carbapenem, 1
aminoglikosida, 1 lincomycin, 1 macrolide, 1 tetrasiklin, 1 kloramfenikol,
1 kuinolon, dan 1 rifampisin.

C. HASIL
1. Isolasi terhadap Enterobacteriaceae dari sampel PIF:
Dari 149 sampel susu bubuk formula bayi (PIF) yang ada ternyata
didapatkan 36 sampel (24,2%) mengandung Enterobacteriaceae. Untuk
sampel susu bubuk formula bayi yang berasal dari dalam negeri Jepang
yang diteliti, ternyata 6 sampel (27,3%) dari 22 sampel produksi
perusahaan A, 4 sampel (40%) dari 10 sampel produksi perusahaan C, dan
2 sampel (20%) dari 10 sampel produksi perusahaan E mengandung
Enterobacteriaceae. Sedangkan 12 sampel produksi perusahaan B dan 7
sampel produksi perusahaan D tidak mengandung Enterobacteriaceae.
Untuk sampel susu bubuk formula bayi (PIF) yang berasal dari import
yang diteliti: ternyata Enterobacteriaceae dapat diisolasi pada 7 sampel
(26,9%) dari 26 sampel yang berasal dari Filipina, 6 sampel (26,1%) dari
23 sampel dari negara Thailand, 6 sampel (40,0%) dari 15 sampel dari
negara Korea, 2 sampel (20,0%) dari 10 sampel dari negara Amerika
Serikat, 1 sampel (25,0%) dari 4 sampel dari negara Brasil, dan 2 sampel
(66,7%) dari 3 sampel dari negara Arab Saudi. Sedangkan 3 sampel susu
bubuk formula bayi (PIF) dari negara Kanada dan 1 sampel dari negara
Australia, Kamboja, Hongkong, dan Vietnam tidak ditemukan adanya
bakteri Enterobacteriaceae.
2. Identifikasi Enterobacteriaceae terisolasi dari PIF:
Kami mengidentifikasi 52 strain Enterobacteriaceae terisolasi dari PIF.
Dalam 36 sampel (24.2%) dari 149 sampel yang ada, kami menemukan 11
jenis bakteri yang dapat diisolasi: 13 spp Pantoea, 9 E. sakazakii, 7
Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae, 6 E. cloacae, 4 Leclercia
adecarboxylata, 3 Escherichia coli, 2 Escherichia vulneris, 2 Klebsiella
pneumoniae subsp. ozaenae, 1 Buttiauxella agrestis, 1 Escherichia
hermannii, dan 1 Ewingella americana. 3 lainnya strain tidak dapat
diidentifikasi.
3. Isolasi E. sakazakii dari PIF dan Perkiraan kadar bakteri:
Keadaan E. Sakazakii yang terisolasi dari susu bubuk formula bayi (PIF)
dan perkiraan tingkat bakteri ditunjukkan pada Tabel 4. E. sakazakii yang
diisolasi untuk 9 sampel (6,0%) dari 149 sampel susu bubuk formula bayi
(PIF).
Untuk sampel susu bubuk formula bayi (PIF) produk dalam negeri Jepang
, ternyata sampel yang positif mengandung E. Sakazakii sebagai berikut : 1
sampel (4,5%) dari 22 sampel perusahaan A, 2 sampel (20%) dari 10
sampel perusahaan C, dan 1 sampel (10%) dari 10 sampel perusahaan E.
Sedangkan 12 sampel perusahaan B dan 7 sampel perusahaan D
produknya tidak mengandung E. Sakazakii.
Untuk sampel susu bubuk formula bayi (PIF) produk import (luar negeri),
ternyata sampel yang positif mengandung E. Sakazakii sebagai berikut : 1
sampel (3.8%) dari 26 sampel dari negara Filipina, 1 sampel (4,3%) dari
 23 sampel dari negara Thailand, dan 3 sampel (20%) dari 15 sampel dari
negara Korea. Sampel PIF import yang diteliti dan tidak mengandung
bakteri E. Sakazakii antara lain dari negara-negara : Amerika Serikat,
Brasil, Kanada, Arab Saudi, Australia, Kamboja, Hongkong, dan Vietnam.
Kami mengukur Semi kuantitatif terhadap kadar E. sakazakii untuk 9
sampel yang terdeteksi. Seperti terlihat pada Tabel 4, diperkirakan
kadarnya mencapai 0,36 MPN/100 gr untuk 4 sampel PIF produksi dalam
negeri, dan kadarnya mencapai 0,36 MPN/100 gr untuk 4 sampel PIF
produk import serta 0,91 MPN/100 gr untuk 1 sampel PIF produk import
Dengan menggunakan sampel susu bubuk formula bayi (PIF) yang
diproduksi oleh 5 perusahaan di Jepang, survei dilakukan terhadap merk
susu yang diproduksi oleh masing-masing perusahaan dan survei
dilaksanakan secara berurutan antara 2 sampai 4 kali. Hasil yang
didapatkan, perusahaan A selama 3 kali produksi PIF ternyata produknya
masih mengandung E. Sakazakii, sedangkan untuk perusahaan C dan E
hanya sekali saja produknya yang mengandung E. Sakazakii. (Lihat Tabel
5)
4. Tes kepekaan Obat terhadap E. Sakazakii yang sudah terisolasi:
Penyebaran harga minimum inhibitory concentrations (MICs) dari
berbagai obat terhadap 9 strain terisolasi ditunjukkan pada Tabel 6.
Konsentrasi antimikroba golongan obat penisilin, MICs untuk ampisilin
(ABPC) berkisar antara 16-128 µg/ml, dan untuk piperasilin (PIPC)
berkisar antara 2-32 µg/ml. Untuk antimikroba kelompok obat cephem,
MICs untuk cefotaxime (CTX) berkisar antara 0,03-1 µg/ml, dan
ceftriaxone (CTRX) berkisar antara 0,03-2 µg/ml. Selain itu, MICs untuk
cefoperazone (CPZ) konsentrasinya berkisar antara 0,5 hingga 2 µg/ml,
untuk seftazidim (CAZ) konsentrasinya berkisar antara 0,06-0,25 µg/ml,
untuk cefpirome (CPR) konsentrasinya berkisar antara 0,03-0,12 µg/ml,
dan untuk cefozopran (CZOP) konsentrasinya berkisar antara 0,06-0,12
µg/ml.
Harga MICs untuk kelompok obat antimikroba penem, meropenem
(MEPM) berkisar dari ≤ 0,008-0,03 µg/ml. Untuk kelompok gentamicin
(GM), obat antimikroba aminoglikosida berkisar 0,25-0,5 µg/ml. Untuk
kelompok lincomycin (LCM), obat antimikroba lincomycin berkisar 128-
128 <µg/ml. Untuk kelompok eritromisin (EM), obat antimikroba
macrolide berkisar antara 16-64 µg/ml. Untuk kelompok minocycline
(Mino), obat antimikroba tetrasiklin berkisar 0,5-4 µg/ml. Untuk
kelompok kloramfenikol (CP), obat antimikroba kloramfenikol berkisar 4-
16 µg/ml. Untuk kelompok siprofloksasin (CPFX), obat kuinolon berkisar
dari ≤0,008-0,015 µg/ml. Sedangkan untuk kelompok rifampicin (RFP)
berkisar antara 2-8 µg/ml.
Nilai MIC90 dari beberapa CTX, CTRX, CPZ, CAZ, CPR, CZOP, GM,
MEPM, dan CPFX adalah 1 – 2 – 2 – 0,25 – 0,12 – 0,12 – 0,5 – 0,03 dan
0,015 µg/ml yang menunjukkan bahwa E. sakazakii sangat sensitif
terhadap obat ini. Nilai MIC90 dari beberapa PIPC, EM, Mino, CP, dan
RFP adalah 32, 64, 4, 16, dan 8 µg/ml yang menunjukkan bahwa E.
sakazakii ini cukup sensitif terhadap obat ini. Namun, nilai MIC90 dari
ABPC dan LCM adalah 128 dan 128 <µg/ml yang menunjukkan bahwa E.
sakazakii tahan terhadap 2 jenis obat ini.
D. PEMBAHASAN
Di Eropa dan Amerika Serikat, beberapa penelitian telah mengangkat isu
penting tentang laporan kasus infeksi E. sakazakii pada bayi yang menggunakan
produk PIF. Menanggapi laporan infeksi pada bayi yang lahir dengan berat badan
rendah. Departemen Kesehatan, Perburuhan dan Kesejahteraan di Jepang secara
hati hati mempublikasikan hal ini pada bulan Mei 2007 dengan judul "Penanganan
secara higienis terhadap susu formula untuk bayi". Namun, infeksi baru terjadi
pada tahun 2009.
Dalam studi pendahuluan mengenai infeksi yang disebabkan oleh E.
sakazakii, kita isolasi Enterobacteriaceae sebesar 24,2% dari sampel PIF yang
ada. Iversen dan Stephan berhasil mengisolasi 7 jenis Enterobacteriaceae dalam
kultur medium EE yaitu : E. sakazakii dalam 2 sampel, Pantoea spp. dalam 2
sampel, E. cloacae dalam 1 sampel, K. pneumoniae subsp. ozaenae dalam 1
sampel, ficaria Serratia dalam 1 sampel, aquatilis Rahnella dalam 1 sampel, dan
Citrobacter freundii dalam 1 sampel.
Kami membandingkan temuan ini dengan 11 jenis bakteri yang berhasil kita
isolasi. Sebanyak 4 jenis bakteri, E. sakazakii, E. cloacae, K. pneumoniae subsp.
ozaenae, dan Pantoea spp. ditemukan di kedua penelitian sementara 3 lainnya
jenis bakteri yang berbeda. Hal ini menunjukkan bahwa bahan baku dapat
terkontaminasi dengan berbagai bakteri di lingkungan pabrik selama produksi.
Selain itu, tingkat deteksi E. sakazakii dalam penelitian ini adalah 6,0%,
sedangkan laporan oleh Kongo dan Kandhai et al menyebutkan bahwa tingkat
keberadaan bakteri ini masing-masing 28,6 dan 20,6%, yang 3 sampai 4 kali lebih
tinggi. Namun, 20% bakteri E. sakazakii terdapat dalam jumlah sedikit untuk
sampel yang diproduksi oleh Perusahaan C di Jepang dan pada 20% sampel dari
Korea. Persentase ini adalah serupa dengan yang dilaporkan oleh Kongo dan
Kandhai et al. Oleh karena itu, tingkat deteksi mungkin tergantung pada keadaan
kontaminasi pabrik.
Selanjutnya Iversen dan Stephan menyelidiki 82 sampel PIF menggunakan
2 jenis media VRBG dan DFI untuk proses isolasinya dan melaporkan 2,4%
isolasi mengandung E. sakazakii. Dengan menggunakan metode yang dilakukan
oleh Iversen dan Stephan, kami dapat mengisolasi E. sakazakii sebanyak 4,7 dan
5,4%, ternyata persentase ini 2 kali lebih tinggi daripada yang dilaporkan oleh
Iversen dan Stephan.
Mengenai perkiraan tingkat kontaminasi E. sakazakii, Muytjens et al.
melakukan survei terhadap produk PIF di berbagai negara dan berhasil
mengisolasi E. sakazakii sekitar 14,2% sampel yang berisi bakteri dengan kadar
36-66 CFU/100 g. Kami menemukan tingkat kontaminasinya sekitar 0,36-0,91
MPN/100 gr, sebanding dengan yang dilaporkan oleh Muytjens et al. Namun,
dalam beberapa kasus jumlah bakteri yang mengkontaminasi produk PIF ada yang
berkisar antara 1 – 7 dari apa yang ditemukan oleh Muytjens et al. Hal ini
kemungkinan terkait dengan waktu survei, perbedaan jenis medium uji, ada atau
tidak adanya budaya, bahan, dan keadaan kontaminasi pabrik.
Kita di sini menunjukkan kontaminasi bakteri terhadap produk PIF di
Jepang, meskipun pada tingkat yang rendah. Dengan demikian PIF tidak steril.
Perhatian harus dilakukan mengenai pertumbuhan bakteri dalam botol bayi selama
pembuatan susu pada suhu rendah dan penyimpanan pada suhu kamar untuk
jangka waktu lama. Banyak laporan telah dibuat pada infeksi bayi karena bakteri
jenis Pantoea. Dengan demikian kehati-hatian sangat diperlukan mengenai
kontaminasi produk PIF oleh bakteri jenis Pantoea dan E. sakazakii.
Kami melakukan tes sensitivitas strain E. sakazakii yang kami isolasi, dan
membandingkan nilai-nilai MIC90. Ternyata E. sakazakii sangat sensitif terhadap
CTX, CTRX, CPZ, CAZ, CPR, CZOP, GM, MEPM, dan CPFX. E. Sakazakii
cukup sensitif terhadap PIPC, EM, Mino, CP, dan RFP. Namun, E. Sakazakii
tahan terhadap ABPC dan LCM. Demikian juga, Muytjens dan van der Ros-van
de repe melaporkan bahwa E. sakazakii sensitif terhadap PIPC, CTX, CTRX,
CPZ, CAZ, GM, dan CPFX, sedangkan dia tahan terhadap ABPC dan CP. Saham
dan Wiedemann menunjukkan bahwa jenis bakteri sensitif terhadap PIPC, CTX,
CTRX, CPZ, CAZ, GM, MEPM, Mino, dan CPFX, sedangkan bakteri tahan
terhadap LCM dan EM. Dengan demikian, dalam studi ini, E. sakazakii
ditemukan sebanyak 6,0% dari sampel PIF yang diteliti, hal ini menunjukkan
bahwa produk PIF yang dijual dipasaran dapat terkontaminasi dengan jenis
bakteri ini, walaupun probabilitas rendah. Selain itu, tes terhadap obat antimikroba
menunjukan bahwa bakteri ini tahan (resistensi) terhadap obat jenis ABPC dan
LCM.