Anda di halaman 1dari 20

“Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Atau Hplc (High Performance Liquid

Chromatography)”

MAKALAH
Disusun Untuk Memenuhi Tugas Mata Kuliah Kimia Analisis Instrument
Dosen Pengampu : Ibu Sri Haryani
Ibu Sri Wardani

Disusun oleh:
Kelompok 4 (empat)
Fajar Mahda A.S (4301408024)
Diah Ika Rusmawati (4301408054)
Santi Budiarti (4301408069)

JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI SEMARANG
2010
BAB I
PENDAHULUAN

A. LATAR BELAKANG
a. Sejarah
Kromatografi adalah istilah umum untuk berbagai cara
pemisahan berdasarkan partisi cuplikan antara fasa yang bergerak,
dapat berupa gas atau zat cair, dan fasa diam, dapat berupa zat cair atau
zat padat. Kita biasanya menganggap Tswett sebagai penemu
kromatografi, yang pada tahun 1903 menguraikan karyanya mengenai
pemakaian kolom kapur untuk memisahkan pigmen dalam daun.
Istilah ‘kromatografi’ dipakai oleh Tswett untuk menggambarkan
daerah berwarna yang bergerak ke bagian bawah kolom. Perlu
diketahui bahwa D.T> Day pada kira-kira saat yang sama memakai
kromatografi untuk memisahkan berbagai fraksi minyak bumi tetapi
Tswett-lah yang pertama kali mengenali dan menafsirkan proses
tersebut.
Kromatografi merana selama bertahun-tahun, biasanya dipakai
dalam bentuk kromatografi cair-padat (KCP). Kemudian, pada akhir
tahun 1930an dan pada awal tahun 1940an, cara ini mulai berkembang.
Dasar kromatografi lapis tipis (KLT) diletakkan oleh Izmailov dan
Schraiber pada tahun 1938, dan kemudian diperhalus oleh Stahl pada
tahun 1958. Karya Martin dan Synge, yang pada tahun 1041
membuahkan hadian Nobel, tidak hanya merevolusikan kromatografi
cair, tetapi juga secara umum meletakkan landasan bagi perkembangan
kromatografi gas dan kromatografi kertas. Pada tahun 1952, Martin
dan James mempublikasikan makalah pertamanya mengenai
kromatografi gas. Antara tahun 1952 dan akhir tahun 1960an
kromatografi gas berkembang menjadi alat analisis yang canggih.
FASE GERAK
ZAT CAIR GAS
FASE DIAM

ZAT
Kromatografi cair-padat (KCKT) Kromatografi gas-padat (KGP)
PADAT

ZAT CAIR Kromatografi cair-cair (KCC) Kromatografi gas-cair(KGC)


KROMATOGRAFI

KROMATOGRAFI CAIR
KROMATOGRAFI GAS

GAS-CAIR GAS-PADAT PERTUKARAN ION EKSKLUSI

KROMATOGRAFI PENYERAPAN CAIR-


PARTISI PADAT

KROMATOGRAFI KROMATOGRAFI
KERTAS LAPIS TIPIS

b. Pengertian
Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan unsur-unsur
yang akan dipisahkan terdistribusikan antara dua fasa, satu dari fasa-
fasa ini membentuk suatu lapisan stasioner dengan luas permukaan
yang besar dan yang lainnya merupakan cairan yang merembes lewat
atau melalui fase yang stasioner. Fasa stasioner mugkin suatu zat padat
atau suatu cairan, dan fasa yang bergerak mungkin suatu cairan atau
suatu gas. Maka semua jenis kromatografi yang dikenal, terbagi
menjadi empat golongan: cair-padat, gas-padat, cair-cair, dan gas-cair.
Pembahasan teknik kromatografi modern baru lengkap bila
disebut kromatografi cairan kinerja tinggi (HPLC). Kromatografi
cairan kolom klasik merupakan prosedur pemisahan yang sudah mapan
dalam mana fase cair yang mobil mengalir lambat-lambat lewat kolom
karena gravitasi. Umumnya metode itu dicirikan oleh efisiensi kolom
yang rendah dan waktu pemisahan yang lama. Namun sejak kira-kira
tahun 1969, perhatian dalam teknik kolom cairan hidup kembali
dengan sangat menyolok karena dikembangkannya sistem tekanan
tinggi oleh Kirchland dan Huber, yang bekerja pada tekanan sampai
2,07 x 107 Nm-2 (3000 p.s.i). Dalam metode ini digunakan kolom
berdiameter kecil (1-3 mm) dan eluen dipompakan ke dalamnya
dengan laju alir yang tinggi (sekitar 1-5 cm3m-1). Pemisahan dengan
metode ini dilakukan jauh lebih cepat (sekitar 100 kali lebih cepat)
daripada dengan kromatografi cairan yang biasa. Meskipun peralatan
yang tersedia di pasar dewasa ini agak mahal, HPLC telah terbukti luas
penggunaannya dalam kimia organik.
Umumnya metode kromatografi seperti adsorpsi, partisi, dan
penukar ion adalah contoh-contoh dari kromatografi kolom. Pada
metode kromatografi cair ini digunakan kolom tabung gelas dengan
bermacam diameter. Partikel dengan dimensi yang bervariasi
digunakan sebagai penunjang stasioner. Banyaknya cairan pada kolom
jumlahnya sedemikian rupa sehingga hanya cukup menghasilkan
sedikit tekanan untuk memelihara aliran fase bergerak yang seragam.
Secara keseluruhan pemisahan ini memakan waktu lama. Berbagai
usaha telah dilakukan untuk menambah laju aliran tanpa mengubah
tinggi piringan teoritis kolom. Penurunan ukuran partikel penunjang
stasioner tidak selalu menguntungkan. Kromatografi cair kinerja tinggi
atau high performance liquid chromatography (HPLC) berbeda dari
kromatografi cair klasik.
Bila dibandingkan terhadap kromatografi gas-cair/gas-liquid
chromatography (GLC), maka HPLC lebih bermanfaat untuk isolasi
zat tidak mudah menguap, demikian juga zat yang secara termal tidak
stabil. Tetapi ditinjau dari kecepatan dan kesederhanaan, GC lebih
baik. Kedua teknik ini komplementer satu sama lainnya, keduanya
efisien, sangat selektif hanya memerlukan sampel berjumlah sedikit
serta keduanya dapat digunakan untuk analisis kuantitatif.
Akhir-akhir ini, untuk pemurnian (misalnya untuk keperluan
sintesis) senyawa organik skala besar, HPLC (high precision liquid
chromatography atau high performance liquid chromatography) secara
ekstensif digunakan. Bila zat melarut dengan pelarut yang cocok, zat
tersebut dapat dianalisis. Ciri teknik ini adalah penggunaan tekanan
tinggi untuk mengirim fasa mobil kedalam kolom. Dengan
memberikan tekanan tinggi, laju dan efisiensi pemisahan dapat
ditingkatkan dengan besar. Kromatografi penukar ion menggunakan
bahan penukar ion sebagai fasa diam dan telah berhasil digunakan
untuk analisis kation, anion dan ion organik.
B. TUJUAN
Makalah ini disusun guna memenuhi tugas kelompok mata kuliah
Kimia Analisis Instrumen yang diampu oleh Ibu Sri Haryani dan Ibu Sri
Wardani. Adapun tujuan lain adalah sebagai berikut:
1. Mengetahui prinsip dasar dari Kromatografi cair kinerja tinggi atau
high performance liquid chromatography (HPLC).
2. Mengetahui proses Kromatografi cair kinerja tinggi atau high
performance liquid chromatography (HPLC) secara kualitatif dan
kuantitatif.
3. Mengetahui instrumenisasi dari Kromatografi cair kinerja tinggi atau
high performance liquid chromatography (HPLC).

C. MANFAAT
Dari makalah ini, diharapkan dapat :
1. Menambah pengetahuan bagi penulis dan pembaca mengenai metode
analisis instrumen khususnya Kromatografi cair kinerja tinggi atau high
performance liquid chromatography (HPLC) baik secara kualitatif
maupun secara kuantitatif.
2. Memudahkan mahasiswa dalam kegiatan analisis instrumen
Kromatografi cair kinerja tinggi atau high performance liquid
chromatography (HPLC).
BAB II
KAJIAN PUSTAKA

A. PENGERTIAN
Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut
dengan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan
metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis
kualitatif dan kuantitatif. KCKT paling sering digunakan untuk :
menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam amino,
asam- asam nukleat, dan protein-protein dalam cairan fisiologis;
menetukan kadar senyawa-senyawa aktif obat, produk hasil samping
proses sintesis, atau produk-produk degradasi dalam sediaan farmasi.
Pada HPLC terdapat kolom terbuka yaitu : Low pressure (tekanan
rendah), dan High pressure (tekanan tinggi 76 bar biasanya memakai
satuan kpa/kilo paskal). Pada HPLC terdapat oven untuk pemanas karena
pada partikel kecil, cairan ditekan terjadi gesekan maka digunakan
pendingin dan tekanan tinggi (cairan ditekan menggunakan pompa
kemudian didorong, jika ditarik cairan masuk). Tekanan harus 76 bar,
antara fase diam dan fase gerak terjadi gesekan sehingga temperatur
meningkat maka harus diturunkan (dengan pendingin liebig/ ion exchange)
karena ikatannya bisa lepas dan bisa juga terjadi bleeding. Temperatur
pada HPLC digunakan untuk menjaga temperatur dalam kolom konstan
sehingga KD tetap.
Jenis HPLC
Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika
fase diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase
terbalik (jika fase diamnya kurang non polar dibanding dengan fase
geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC
dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik.
Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan
berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme
sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:
1. Kromatografi Adsorbsi
Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana
dalam kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan
kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan
menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian
sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya.
Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi
dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang
berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat
menyebabkan puncak yang berekor.
2. Kromatografi fase terikat
Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang
dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang
digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon
non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil.
Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS
atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik.
Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril
dengan air atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam
lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH
fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau
protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan
ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut
dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang
mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.
3. Kromatografi penukar ion
KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat
menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak
penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling
luas penggunaannya adalah polistiren resin. Kebanyakan pemisahan
kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena
sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran
misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar
ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam
total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar
garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan
oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak
untuk gugus penukar ion pada resin.
4. Kromatografi Pasangan ion
Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk
pemisahan sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang
melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion
yang mempunyai muatan yang berlawanan.
5. Kromatografi Eksklusi Ukuran
Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi
gel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis
senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton. Fase diam yang
digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus
sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau
berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang
jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-
molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh
lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak
melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan
demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi
interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi
yang lain.
6. Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi
biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus
molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi
yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang
sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi).
Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein
(enzim) dari campuran yang sangat kompleks.
Teknik HPLC lebih bermanfaat dibandingkan dengan GC (Gas
Chromatography).
Kelebihan dari teknik HPLC ini antara lain :
1. HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap
dan zat yang tidak stabil.
2. HPLC memiliki detector dengan kepekaan yang tinggi
3. Teknik ini memiliki daya memisah yang tinggi
4. Dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya
5. Dalam HPLC dapat memberikan beberapa ribu lempeng teoritis hanya
dalam beberapa cm sehingga memungkinkan analisis kolom yang
sangat kecil (sedikit fase gerak yang dikonsumsi)
6. Biaya pelarut jauh lebih rendah dibandingkan LC kuno, sehingga dapat
menurunkan biaya karyawan.
7. Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar.

B. PRINSIP DASAR
Prinsip kerja HPLC :
Dengan bantuan pompa fasa gerak air dialirkan melalui kolom ke
detector. Cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara
penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen
ampuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap
fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam
akan keluar dari kolom lebih dulu. Sebaliknya, solute-solut yang kuat
berinteraksi dengan fasa diam maka solute-solut tersebut akan keluar dari
kolom lebih lama. Setiap komponen campuran yang keluar kolom
dideteksi oleh detector kemudian direkam dalam bentuk kromatogram.

C. INSTRUMEN ALAT
Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak,
pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor,
wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator
atau perekam. Diagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini :
a. Fasa gerak
Fasa gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau
pelarut. Selain berfungsi sebagai pembawa komponen-komponen
campuran campuran menuju detector, fasa gerak dapat berinteraksi dengan
solut-solut. Oleh karena itu, fasa gerak dalam HPLC merupakan salah satu
faktor penentu keberhasilan proses pemisahan.
Persyaratan fasa gerak HPLC:
1. Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang
akan dianalisis.
2. Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran
yang dapat mengganggu interpretasi kromatografi.
3. Zat air harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada
kolom.
4. Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan
tidak beracun.
5. Zat air tidak kental. Umumnya kekentalan tidak melebihi 0,5 cP (centi
Poise).
6. Sesuai dengan detector.
Jenis fasa gerak berdasarkan kepolaran fasa diam dan fasa gerak:
a) HPLC fasa normal: HPLC dengan kombinasi antara fasa diam polar
dan fasa gerak non-polar. Fasa diam yang digunakan seperti silica,
alumina, atau trietilenaglikol yang dilapiskan pada partikel silica.
Sedangkan fasa gerak yang digunakan adalah heksana atau i-
propileter.
b) HPLC fasa terbalik: HPLC dengan kombinasi antara fasa diam non-
polar dan fasa gerak polar. Fasa gerak yang digunakan seperti air,
methanol, atau asetinitril.
Fasa gerak yang baik memberikan factor kapasitas k’ pada rentang yang
sesuai. Untuk cuplikan dengan 2-3 komponen, sebaiknya menggunakan
fasa gerak yang memberikan k’ antara 2-5.
b. Pompa
Pompa dalam HPLC dapat dianalogkan dengan jantung pada manusia
yang berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair melalui kolom yang
berisi serbuk halus.
Persyaratan pompa yang digunakan dalam HPLC:
1. Menghasilkan tekanan sampai 600psi (point/in2)
2. Keluaran bebas pulsa
3. Kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 ml/menit
4. Bahan tahan korosi
Tiga jenis pompa yang digunakan dalam HPLC:
a) Pompa reciprocating
Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa
dengan cara gerakan piston mundur-maju yang dijalankan oleh motor.
Piston berupa gelas dan berkontak langsung dengan pelarut. Ketika
piston mundur maka bola gelas bawah terangkat dan pelarut masuk,
sebaliknya ketika piston maju maka bola bawah menutup saluran
pelarut dan pelarut yang telah berada di ruang pompa didorong masuk
ke dalam kolom.

b) Pompa displacement
Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang
dilengkapi pendorong yang digerakkan oleh motor. Pompa ini juga
menghasilkan aliran yang cenderung tidak bergantung pada tekanan
balik kolom dan viskositas pelarut.
c) Pompa pneumatic
Dalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi. Pompa
jenis ini murah dan bebas pulsa. Akan tetapi mempunya keterbatasan
kapasitas dan tekanan yang dihasilkan (<2000 psi) serta kecepatan alir
bergantung pada viskositas pelarut dan takanan balik kolom.
c. Pemasukan cuplikan
Beberapa teknik pemasukan cuplikan ke dalam system HPLC:
1. Injeksi syringe
Syringe disuntikan melalui septum (seal karet) dan untuk ini dirancang
syringe yang tahan tekanan sampai 1500 psi. akan tetapi keterulangan
injeksi syringe ini sedikitb lebih baik dari 2-3% dan sering lebih jelek.
2. Injeksi ‘stop-flow’
Injeksi ini adalah jenis injeksi syringe kedua tapi di sini aliran pelarut
dihentikan sementara, sambungan pada ujung kolom dibuka dan
cuplikan disuntikan langsung ke dalam ujung kolom. Setelah
menyambungkan kembali kolom maka pelarut dialirkan kembali.
3. Kran cuplikan
Jenis pemasukan uplikan ini disebut juga loop. Untuk memasukkan
cuplikan ke dalam aliran fasa gerak perlu dua langkah:
a) Sejumlah volume cuplikan disuntikkan ke dalam loop dalam posisi
“load”, cuplikan masih berada dalam loop
b) Kran diputar untuk mengubah posisi “load” menjadi posisi
“injeksi” dan fasa gerak membawa cuplikan ke dalam kolom.
d. Kolom dan Fase diam
Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan
kolom mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat
fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit.
Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan
kolom konvensional, yakni:
a) Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil
dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor
kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 μl/menit).
b) Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor
lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.
c) Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat,
karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel
terbatas misal sampel klinis.
Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan
kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.
Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi
secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren
dan divinil benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena
adanya residu gugus silanol (Si-OH). Silika dapat dimodifikasi secara
kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-
reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan
gugus-gugus fungsional yang lain.
Contoh Pembuatan fasa diam dengan reaksi antara silika dengan
alkilklorosilana (reaksi silanisasi) :

CH3 CH3

Si OH + Cl Si R Si O Si R +HCl

CH3 CH3

Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling
banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan
kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang
lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika
aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika
yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan
waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air
yang digunakan.
e. Detektor HPLC
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu:
detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak
bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias
dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik
yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti
detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia.
Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai
berikut:
a. mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel;
b. mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut
pada kadar yang sangat kecil;
c. stabil dalam pengopersiannya;
d. mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan
pelebaran pita;
e. signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada
kisaran yang luas (kisaran dinamis linier);
f. tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.

Karakteristik detector HPLC:


Dasar Jenis Maksimum Peka terhadap Sensitivitas
Pendeteksian sensitifitas kecepatan alir suhu
Absorbsi UV Spesifik 2 x 10-16 Tidak Rendah
Absorbsi IR Spesifik 10-6 Tidak Rendah
Flourometri Spesifik 10-11 Tidak Rendah
Indek bias Umum 1 x 10-7 Tidak + 10-4 0 C
Konduktometri Spesifik 10-8 Ya 2% 0C
Spektometri Umum 10-10 Tidak Tidak ada
massa
elektrokimia Spesifik 10-12 Ya 1,5% 0C

D. ANALISA KUALITATIF dan KUANTITATIF


Aplikasi analisis HPLC adalah untuk penentuan kualitatif dan
penentuan kuantitatif. HPLC digunakan untuk analisa kualitatif didasarkan
pada waktu retensi untuk identifikasi. Identifikasi dapat diandalkan apabila
waktu retensi sampel dibandingkan dengan larutan standar.
Sedangkan beberapa hal yang harus diperhatikan agar HPLC dapat
dipergunakan untuk penentuan secara kuantitatif adalah:
1. Parameter percobaan sama antara standar dan sampel
2. Penentuan berdasarkan waktu retensi sampel dan standar yang sama
3. Penentuan kadar dilakukan berdasarkan hubungan (korelasi) dengan
menggunakan larutan standar seri pada waktu retensi tertentu. Yaitu
berdasarkan area kromatogram dan tinggi puncak kromatogram.
Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram.
Dalam kromatogram akan terdapat peak-peak yang menggambarkan
banyaknya jenis komponen dalam sample. Sample yang mengandung
banyak komponen didalamnya akan mempunyai kromatogram dengan
banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk (overlap).
Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi.
Oleh karena itu biasanya untuk sample jenis ini dilakukan tahapan
preparasi sample yang lebih rumit agar sample yang siap diinjeksikan ke
HPLC sudah cukup bersih dari impuritis. Sample farmasi biasanya jauh
lebih mudah karena sedikit mengandung komponen selain zat aktif.
Sample ini umumnya hanya melalui proses pelarutan saja.
Contoh hasil analisa HPLC

Seperti pada kromatografi gas, jumlah peak menyatakan jumlah


kompone sedangkan luas peakmenyatakan konsentrasi komponen dalam
campuran. Komputer dapat digunakan untuk mengontrol kerja system
HPLC dan mengumpulkan serta mengolah data hasil pengukuran HPLC.
Efisiensi kolom biasanya dinyatakan secara matematika dengan istilah plet
teori, konsep yang dipinjam dari teori distilasi. Penerapannya dalam
kromatografi, jumlah teori plat N, untuk kolom ditentukan dari lebar peak
dan waktu retensi.
Untuk peak-peak berbentuk simetri seperti terjadi pada kebanyakan
peak-peak kromatografi gas, jumlah teori plat dapat diformulasi sebagai:

menyatakan waktu retensi dan menyatakan leher peak pada


setengah tinggi. Akan tetapi untuk peak-peak yang tidak simetri
disarankan menggunakan persamaan:

Gambar grafik asimetri:

Peak asimetri dengan parameter A dan B untuk menghitung haraga


N. Berdasarkan gambar, adalah waktu retensi, adalah lebar peak
pada ketinggian 10% atau A+B, A adalah lebar sebelah kanan, dan B
adalah lebar setengah peak sebelah kiri.
Tujuan utama dari kromatografi cairan kinerja tinggi sama dengan
kromatografi gas adalah mendapat pemisahan yang sempurna. Derajat
pemisahan (Rs) dalam kromatografi cair kinerja tinggi-pun dinyatakan
dengan istilah resolusi yang di formulasi sebagai berikut:

Berdasarkan persamaan di atas, terlihat bahwa resolusi dipengaruhi


oleh tiga factor yaitu efisiensi (N), selektivitas (α), dan retensi (k’). lebih
sederhana dari kromatografi gas, di sini selektivitas cukup dinyatakan
sebagai:

Dimana:
α adalah selektivitas, dan adalah masing-masing factor
kapasitas senyawa 1 dan senyawa 2. Harga selektivitas dapat sama dengan
satu atau lebih besar dari satu. Bila harga berarti senyawa 1 dan 2
keluar dari kolom bersama-sama. Dengan kata lain senyawa 1 tidak dapat
dipisahkan dari senyawa 2, sebaliknya bila harga maka senyawa 1

keluar dari kolom lebih cepat dari pada senyawa 2. Semakin besar harga
, semakin baik pemisahan.
Efisiensi Pemisahan:
Tingkat efisiensi pemisahan dengan kromatografi tercermin pada
pek-peak kromatogram yang dihasilkan. Semakin lebar suatu peak
kromatogram maka dapat dikatakan pemisahan semakin kurang efisien.
Parameter efisiensi pemisahan dinyatakan dlam bentuk HETP (height
equivalent to a theoretical plate) yang diformulasikan sebagai berikut:

Dimana: H : HETP (height equivalent to a theoretical plate)


L : panjang kolom dalam centimeter
N : jumlah total theoretical plate

Nilai H menunjukkan ukuran efisiensi yang diberikan kolom tiap


unit panjang kolom. Nilai H yang kecil menyatakan kolom yang lebih
efisien dan nilai N yang besar. Objek yang paling penting dalam KCKT
adalah meminimalkan nilai H sehingga nilai N maksimum dan efisiensi
kolom paling tinggi.
Nilai H menurun dengan:
1. Ukuran partikel kolom yang kecil
2. Laju alir fase gerak yang rendah
3. Fase gerak yang kurang kental
4. Pemisahan pada temperature tinggi
5. Molekul-molekul sample yang kecil
6. Meningkatkan panjang kolom.
Jarak diantara puncak maksimal menunjukkan selektivitas system.
Lebar punak kromatografi menunjukkan efisiensi. Efisiensi dan
selektivitas merupakan descriptor pelengkap yang tergantung pada
parameter-parameter kromatografi yang berbeda-beda. Efisiensi lebih
tergantung pada kualitas packing kolom, ukuran partikel, laju alir, dan
optimasi instrumental, sedangkan selektivitas lebih tergantung pada
komponen fasa diam dan analit itu sendiri.

Keuntungan dan keterbatasan HPLC


Ada beberapa keuntungan HPLC, yaitu:
1. Dapat menganalisis sampel yang tidak mudah menguap atau tidak
stabil dengan pemanasan.
2. Interaksi yang lebih selektif dengan molekul sample kerena fasa gerak
dan fasa diam berperan dalam proses kromatografi.
3. Berbagai jenis kolom yang selektif.
4. Menghasilkan pemisahan dengan kecepatan tinggi.
5. Waktu analisis yang cepat.
6. Pemasukan sample yang tepat dan mudah dikendalikan sehingga
menjamin presisi kuantitatif.
7. Resiko peruraian sample yang lebih kecil karena tidak dilakukan
pemanasan.
8. Keragaman kolom dan detector berarti bahwa selektivitas metode
tersebut dapat disesuaikan dengan mudah.
Keterbatasan HPLC adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika
HPL dihubungkan dengan spektrofotometer massa (MS). Selain itu,
keterbatasan lainnya adalah jika sample dianalisis sangat kompleks, maka
resolusi yang baik sulit diperoleh.

BAB III
SIMPULAN

Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut dengan
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan metode yang
tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif.
Dilihat dari jenis fase diam dan fase gerak, KCKT (kolomnya) dibedakan
menjadi: Kromatografi fase normal dan fase terbalik. Beberapa kegunaan HPLC
yaitu HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi
dan pestisida.
Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan
kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu
sebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi
lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak.
Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan kecepatannya
untuk sampai ke detektor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati
pada spektrum yang puncak-puncaknya terpisah.
Alat yang berperan penting di dalamnya, antara lain yaitu pompa, injektor,
kolom, deterktor, dan fase gerak. HPLC digunakan untuk analisa kualitatif
didasarkan pada waktu retensi untuk identifikasi. Identifikasi dapat diandalkan
apabila waktu retensi sampel dibandingkan dengan larutan standar.
Sedangkan beberapa hal yang harus diperhatikan agar HPLC dapat
dipergunakan untuk penentuan secara kuantitatif adalah:
1. Parameter percobaan sama antara standar dan sampel
2. Penentuan berdasarkan waktu retensi sampel dan standar yang sama
3. Penentuan kadar dilakukan berdasarkan hubungan (korelasi) dengan
menggunakan larutan standar seri pada waktu retensi tertentu. Yaitu
berdasarkan area kromatogram dan tinggi puncak kromatogram.
DAFTAR PUSTAKA
Gritter, Roy J, dkk. 1991. Pengantar Kromatografi Edisi Kedua. Bandung: ITB
Bandung.
Hendayana, Sumar, dkk. 1994. Kimia Analitik Instrumen Edisi Kesatu. Semarang:
IKIP Semarang Press.
. 2006. Kimia Pemisahan Metode Kromatografi dan
Elektroforesis Modern. Bandung: PT Remaja Rosdakarya
Offset.
Johnson, Edward L, dkk. 1991. Dasar Kromatografi Cair. Bandung: ITB
Bandung.
Bella, Lisa.2009. Skripsi ‘Optimasi Fase Gerak Laju Alir pada Penetapan Kadar
Campuran Guaifenesin dan Dextrometorfan HBr dalam
Sirup dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
(KCKT). Medan: Fakultas Farmasi Universitas Sumatra
Utara.
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC) | Chem-Is-Try.Org | Situs Kimia
Indonesia |
HPLC (High Performance Liquid Chromatography) ~ Lansida
Dasar Analisis Vitamin C dengan Metode HPLC | BLoG kiTa