isolasi

Dasar Teori

DNA pada organisme tingkat tinggi seperti manusia, hewan dan tumbuhan terdapat di dalam

inti sel, dan beberapa organ lain di dalam sel seperti mitokondria dan kloroplast. Penyebutan

nama DNA juga didasarkan pada lokasi asalnya. DNA genome inti (nuclear DNA genome)

berasal dari inti sel, DNA genom mitokondria (mitochondrial DNA genome) berasal dari

mitokondria, DNA genom kloroplast berasal dari kloroplast. Pada organisme tingkat rendah,

DNA penyusun kromosom dan plasmid dibungkus oleh dinding sel (pada bakteri) atau

dibungkus oleh protein tertentu (pada virus). Kromosom eukariot berbentuk linear

sedangkan kromosom prokariot berbentuk sirkular. Selain itu prokariot juga mengandung

satu atau lebih plasmid. Plasmid merupakan mulekul DNA sirkular dengan ukuran yang jauh

lebih kecil dibanding kromosom.

Isolasi DNA kromosom.

Prinsipnya adalah memisahkan DNA kromosom atau DNA genom dari komponen-

komponen sel lain. Sumber DNA bisa dari tanaman, kultur mikroorganise, atau sel manusia.

Membran sel dilisis dengan menambahkan detergen untuk membebaskan isinya, kemudian

pada ekstrak sel tersebut ditambahkan protease (yang berfungsi mendegradasi protein) dan

RNase (yang berfungsi untuk mendegradasi RNA), sehingga yang tinggal adalah DNA.

Selanjutnya ekstrak tersebut dipanaskan sampai suhu 90 oC untuk menginaktifasi enzim

yang mendegradasi DNA (DNase). Larutan DNA kemudian di presipitasi dengan etanol dan

bisa dilarutkan lagi dengan air.

Isolasi DNA plasmid

DNA plasmid merupakan wadah yang digunakan untuk kloning gen, sehingga DNA plasmid

harus di pisahkan dari DNA kromosom. DNA plasmid mempunyai ukuran yang jauh lebih
kecil daripada DNA kromosom. Untuk memisahkan DNA plasmid, maka memerlukan

perlakuan yang sedikit berbeda dengan prosedur di atas. Pertama, membran sel dilisis

dengan penambahan detergen. Proses ini membebaskan DNA kromosom, DNA plasmid,

RNA, protein dan komponen lain. DNA kromosom dan protein diendapkan dengan

penambahan potasium. DNA + protein + potasium yang mengendap dipisahkan dengan

cara sentrifugasi. Supernatan yang mengandung DNA plasmid, RNA dan protein yang

tersisa dipisahkan. Kemudian ditambahkan RNase dan protese untuk mendegradasi RNA

dan protein. Akhirnya DNA plasmid dapat dipresipitasi menggunakan etanol.

Isolasi RNA

RNA, terutama mRNA merupakan materi genetik yang mengkode suatu protein. Jumlah populasi
mRNA akan lebih banyak dibanding dengan DNA. mRNA eukariot dapat

dipisahkan dari DNA dengan menggunakan oligonukleotida dT. Atau RNA total juga dapat di

isolasi dari sel dengan menambahkan enzim DNase yang berfungsi untuk mendegradasi

DNA

Ekstraksi DNA dari organisme eukaryote (manusia, hewan dan tumbuhan) dilakukan melalui

proses penghancuran dinding sel (lysis of cell walls), penghilangan protein dan RNA (cell

digestion) dan pengendapan DNA (precipitation of DNA) dan pemanenan. Berbagai teknik

ekstraksi DNA telah dikembangkan dari prinsip dasar tersebut, sehingga saat ini muncul

berbagai teknik ekstraksi dan purifikasi DNA. Prinsip dasar ekstraksi DNA adalah

serangkaian proses untuk memisahkan DNA dari komponen-komponen sel lainnya. Hasil

ekstraksi tersebut merupakan tahapan penting untuk langkah berikutnya. Oleh sebab itu

dalam pelaksanaannya harus dilakukan dengan baik dan bebas kontaminasi.

Secara kimiawi penghancuran sel dilakukan dengan memanfaatkan senyawa kimia seperti

EDTA (ethyllenediamine tetraacetic), dan SDS (Sodium Dodecyl Sulfate). EDTA berfungsi

sebagai perusak sel dengan cara mengikat ion magnesium (ion ini berfungsi untuk

mempertahankan integritas sel maupun mempertahankan aktivitas enzim nuclease yang

merusak asam nukleat). SDS merupakan sejenis deterjen yang berfungsi merusak
membrane sel. Enzim proteinase K dapat digunakan untuk menghancurkan protein. Kotoran

akibat lisis sel dipisahkan dengan cara sentrifugasi. Kemudian molekul nuleotida (DNA dan

RNA) yang telah dipisahkan dibersihkan dari protein yang masih ada dengan menggunakan

phenol. Dalam proses ini sebagian kecil RNA juga dapat dibersihkan. Sedangkan choloform

digunakan untuk membersihkan sisa-sisa protein dan polisakarida dari larutan. Enzim

RNAase digunakan untuk menghancurkan RNA sehingga DNA dapat diisolasi secara utuh.

Pemurnian atau purifikasi DNA dapat dilakukan dengan mencampur larutan DNA tersebut

dengan NaCl yang berfungsi memekatkan, memisahkan DNA dari larutan, dan

mengendapkan DNA sewaktu dicampur dengan ethanol. Proses sentrifugasi dengan

kecepatan tinggi akan mengendapkan tepung berwarna putih (DNA) dan menempel di dasar

tabung ependorf.

Pada manusia, hanya sel darah putih yang mempunyai inti dan mengandung DNA. Agar

lebih efisien, isolasi DNA dilakukan hanya terhadap sel darah putih. Oleh sebab itu sampel

darah total (whole blood) yang masih segar langsung dipisahkan menjadi serum, sel darah

merah dan sel darah putih (dilapisan buffy coat) dengan teknik sentrifugasi. Setelah

disentrifugasi, sampel darah total akan terbagi menjadi tiga lapisan, yaitu lapisan paling atas

merupakan serum, lapisan tengah berwarna putih tipis adalah sel darah putih (buffy coat)

dan lapisan bawah adalah sel darah merah. Lapisan kedua yang merupakan sel darah putih

diambil dengan klinipette.