CAPÍTULO 3
Cultura e isolamento de bactérias
3.1 - Introdução
3.1.1 - Generalidades
A maior parte das técnicas bacteriológicas (conservação, isolamento, identificação, ou
contagem de bactérias), exigem a utilização de meios de cultura, sendo a composição
dos meios de cultura função dos conhecimentos sobre os princípios de nutrição
microbiana. Os meios de cultura devem conter, de uma forma utilizável, os nutrientes
necessários ao crescimento das bactérias, nomeadamente, macronutrientes (C, H, N, O,
P, S, K, Mg, Na, etc.), micronutrientes (Fe, Cu, Zn, etc.), e factores de crescimento (por
ex. vitaminas e aminoácidos). Para que se observe crescimento bacteriano há ainda que
incubar os meios em condições adequadas de pH, tensão de oxigénio e temperatura.
a) Consistência
Existem meios de cultura em três estados físicos:
• líquido
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• semi-sólido
• sólido
Os meios líquidos, como os caldos nutritivos de crescimento, podem ser utilizados para
a multiplicação de microrganismos em estudos de fermentação e em vários testes
bioquímicos. Apresentam no entanto, dois inconvenientes: 1) as culturas desenvolvidas
não revelam em geral quaisquer características especiais e portanto o seu valor é
limitado na identificação de bactérias; 2) é impossível a separação de espécies
bacterianas que se encontrem em misturas.
Uma colónia é um número elevado de células bacterianas em meio de cultura sólido que
é visível a olho nú como uma entidade discreta. Assume-se que uma colónia provém de
uma única célula e portanto representa um clone de uma cultura pura.
b) Composição
Os microrganismos podem ser cultivados utilizando dois tipos diferentes de meios. Os
meios sintéticos, ou quimicamente definidos que são compostos por produtos químicos
bem definidos e dissolvidos em água destilada em proporções determinadas, de modo a
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c) Tipo de utilização
• Meios de isolamento
Os meios de isolamento permitem a obtenção de culturas puras e podem ser de vários
tipos:
Meios basais - Permitem o crescimento de bactérias pouco exigentes. Não existe um
meio de cultura universal (ex. caldo nutritivo, água peptonada, triptona sal, gelose
nutritiva).
Meios selectivos - Permitem o crescimento só de um tipo de bactérias em detrimento
das outras cujo crescimento é inibido. Torna-se útil, no caso de uma população
plurimicrobiana, porque permite favorecer a cultura preferencial de certas bactérias.
Meios diferenciais - São utilizados quando se pretende diferenciar entre vários
microrganismos presentes no meio de cultura. Por exemplo, no caso da gelose sangue,
dado que algumas bactérias produzem enzimas (hemolisinas) que vão lisar os glóbulos
vermelhos enquanto outras não; dependendo do padrão de hemólise pode-se distinguir
entre bactérias hemolíticas (Streptococcus pyogenes) e não hemolíticas.
Meios selectivos e diferenciais - Alguns meios de cultura são simultaneamente
selectivos e diferenciais. São sobretudo utilizados em microbiologia clínica e na área da
saúde pública, como por exemplo na determinação da qualidade da água ou num surto
de intoxicações alimentares. Temos como exemplos deste tipo de meio:
a. Gelose de McConkey - É um meio selectivo, uma vez que contém sais biliares e
cristal violeta que inibem o crescimento das bactérias Gram positivas, permitindo o
crescimento, apenas das bactérias Gram negativas. É diferencial porque a lactose está
presente neste meio e permite diferenciar entre as bactérias Gram negativas que utilizam
a lactose como substrato fermentativo e as que não utilizam. As bactérias Gram
negativas fermentadoras de lactose, tornam o meio ácido e o indicador de pH do meio
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• Meios de enriquecimento
São meios líquidos, que favorecem o crescimento de determinadas espécies aumentando
a sua quantidade relativamente a outras, podendo conduzir depois a culturas puras por
sobreposição de espécies (ex. meio de enriquecimento para organismos fotoautotróficos
- meio sem fonte de carbono adicionada; ex. caldo de selenito de sódio para
enriquecimento de fezes em Salmonella e Shigella, agentes causadores de intoxicações
alimentares).
• Meios de transporte
Servem para o transporte de um determinado material biológico a partir do qual se
propõe isolar um ou mais organismos. É então importante manter a viabilidade dos
microrganismos nele existentes sem que haja multiplicação dos mesmos (durante um
período de 48 a 72 horas) e também a sua quantidade relativa no produto biológico para
que depois a inoculação dos meios origine resultados que reflictam a proporção relativa
dos microrganismos nesse produto biológico (ex. meio de Stuart).
• Meios de identificação
São meios que permitem pôr em evidência as características bioquímicas das bactérias
e, por conseguinte, resolver os problemas de identificação postos entre espécies (ex.
meio Clark-Lubs - permite distinguir entre bactérias que fazem a fermentação
butanodiólica da glucose e bactérias que fazem a fermentação ácida mista da glucose).
• Meios de conservação
São meios que permitem a manutenção das bactérias num estado de vida latente durante
meses, anos ou décadas.
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a) Inundação
É utilizada uma suspensão (que pode previamente ser submetida a várias diluições),
com que se inunda a superfície do meio sólido a usar. O excesso de inóculo é removido
por sucção a vácuo após agitação e a superfície do meio é deixada secar ao ar em
atmosfera asséptica.
b) Espalhamento
É utilizada para contagem de colónias e o inóculo (suspensão) é, neste caso, aplicado à
superfície de meio sólido com um espalhador em L ou, simplesmente, com uma pipeta
de Pasteur dobrada a quente, ou ainda por intermédio de uma zaragatoa.
c) Estrias
A inoculação por estrias é realizada com a finalidade de obter colónias isoladas, e
realiza-se à superfície de meio sólido, com uma ansa de Henle, a partir de uma
suspensão ou de uma colónia isolada (Fig. 3.1).
Figura 3. 1. Esquema
da inoculação de meios
de cultura sólidos pela
técnica das estrias.
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d) Incorporação
A inoculação por incorporação é utilizada para contagem de colónias à superfície e no
interior de meio sólido e realiza-se por incorporação do inóculo (suspensão) no meio,
enquanto quente (não mais do que 40ºC para não destruir o inóculo) e portanto ainda
liquefeito.
e) Picada central
Este tipo de inoculação é utilizado por exemplo, no estudo da mobilidade bacteriana e
realiza-se por picada central com a ansa de Henle, ou pipeta de Pasteur fechada, num
meio gelosado em tubo.
a) Tamanho
• colónias pequenas - diâmetro (d) < 1 mm
• colónias médias - 1.5 < d < 3 mm
• colónias grandes - d > 3 mm
b) Forma geral
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• forma de relevo:
lisas
convexas
semi-convexas
acuminadas
mamelonadas
umbilicadas
c) Transparência:
• transparentes
• translúcidas
• opacas
• lactescentes
d) Aspecto da superfície:
• colónias lisas
bordos regulares
superfície lisa e brilhante por vezes
consistência cremosa
suspensão homogénea
muitas vezes semi-convexas
• colónias rugosas
bordos muitas vezes dentados
superfície rugosa, baça
consistência pulvurulenta
suspensão heterogénea
sobretudo lisas
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• colónias mucosas
bordos lisos e regulares
convexas
superfície lisa e brilhante
suspensão heterogénea
e) Pigmentação:
A elaboração de um pigmento por certas bactérias pode ser um elemento precioso de
identificação. Exemplos:
Serratia marcescens - colónias vermelhas
Pseudomonas aeruginosa - colónias verdes azuladas (pigmentos - pioverdina e
piocianina)
Forma
Forma
Ponto
Ponto Circular
Circular Filamentosa
Filamentosa Irregular
Irregular Rizoidal
Rizoidal Fuso
Fuso
Elevação
Elevação
Achatada
Achatada Elevada
Elevada Convexa
Convexa Pulverulenta
Pulverulenta Umbilical
Umbilical
Margem
Margem
Inteira
Inteira Ondulada
Ondulada Lobulada
Lobulada Erusionada
Erusionada Filamentosa
Filamentosa Encaracolada
Encaracolada
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2) No meio de Drigalsky, dividir a placa em duas partes e inocular Proteus spp. e E. coli
por estrias, usando a ansa de Henle.
4) Na gelose chocolate, dividir a placa em três partes e inocular por estrias, utilizando
uma zaragatoa as seguintes bactérias: E. coli, Proteus spp. e Staphylococcus spp.
2) Com a ansa, tirar 4 ou 5 gotas das suspensões anteriores para lâminas, fazer
esfregaços, e realizar para cada uma a coloração de Gram.
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