HPLC adalah alat yang sangat bermanfaat dalam analisis.

Bagian ini menjelaskan bagaimana

pelaksanaan dan penggunaan serta prinsip HPLC yang sama dengan kromatografi lapis tipis dan
kromatografi kolom.

Pelaksanaan HPLC

Pengantar

HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain
dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, didukung melalui tekanan tinggi
sampai dengan 400 atm. Ini membuatnya lebih cepat.

HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk material
terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang lebih besar
berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang melintasinya. Hal ini memungkinkan
pemisahan yang lebih baik dari komponen-komponen dalam campuran.

Perkembangan yang lebih luas melalui kromatografi kolom mempertimbangkan metode

pendeteksian yang dapat digunakan. Metode-metode ini sangat otomatis dan sangat peka.

Kolom dan pelarut

Membingungkan, ada dua perbedaan dalam HPLC, yang mana tergantung pada polaritas relatif
dari pelarut dan fase diam.

Fase normal HPLC

Ini secara esensial sama dengan apa yang sudah anda baca tentang kromatografi lapis tipis atau
kromatografi kolom. Meskipun disebut sebagai “normal”, ini bukan merupakan bentuk
yang biasa dari HPLC.
Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non polar misalnya heksan.
Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan mungkin kurang dari nilai ini)
dengan panjang 150 sampai 250 mm.

Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika
yang polar dibanding degan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non
polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom.

Fase balik HPLC

Dalam kasus ini, ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar melalui
pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa
atom karbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol
seperti metanol.

Dalam kasus ini, akan terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam
campuran yang melalui kolom. Atraksi yang terjadi tidak akan sekuat atraksi antara rantai-rantai
hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase diam) dan molekul-molekul polar dalam larutan.
Oleh karena itu, molekul-molekul polar dalam campuran akan menghabiskan waktunya untuk
bergerak bersama dengan pelarut.

Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi dengan gugus
hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Senyawa-senyawa ini juga akan kurang
larut dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana halnya
senyawa-senyawa tersebut berada dalam molekul-molekul air atau metanol misalnya. Oleh
karenanya, senyawa-senyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak
lambat dalam kolom.

Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom.

Fase balik HPLC adalah bentuk yang biasa digunakan dalam HPLC.Melihat seluruh proses

Diagram alir HPLC

Injeksi sampel

Injeksi sample seluruhnya otomatis dan anda tidak akan mengharapkan bagaimana mengetahui
apa yang terjadi pada tingkat dasar. Karena proses ini meliputi tekanan, tidak sama halnya
dengan kromatografi gas (jika anda telah mempelajarinya).

Waktu retensi

Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor disebut
sebagai waktu retensi. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan
sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu.
Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda. Untuk beberapa senyawa,
waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada:
  tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut)
 kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran
partikel)
 komposisi yang tepat dari pelarut
 temperatur pada kolom

Itu berarti bahwa kondisi harus dikontrol secara hati-hati, jika anda menggunakan waktu retensi
sebagai sarana untuk mengidentifikasi senyawa-senyawa.

Detektor
Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. Metode umum yang
mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan ultra-violet.

Banyak senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang. Jika
anda menyinarkan sinar UV pada larutan yang keluar melalui kolom dan sebuah detektor pada
sisi yang berlawanan, anda akan mendapatkan pembacaan langsung berapa besar sinar yang
diserap.

Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang melewati
melalui berkas pada waktu itu. Anda akan heran mengapa pelarut yang digunakan tidak
mengabsorbsi sinar UV. Pelarut menyerapnya! Tetapi berbeda, senyawa-senyawa akan
menyerap dengan sangat kuat bagian-bagian yang berbeda dari specktrum UV.

Misalnya, metanol, menyerap pada panjang gelombang dibawah 205 nm dan air pada gelombang
dibawah 190 nm. Jika anda menggunakan campuran metanol-air sebagai pelarut, anda sebaiknya
menggunakan panjang gelombang yang lebih besar dari 205 nm untuk mencegah pembacaan
yang salah dari pelarut.

Interpretasi output dari detektor

Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing puncak

mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap sinar UV.
Sepanjang anda mengontrol kondisi kolom, anda dapat menggunakan waktu retensi untuk
membantu mengidentifikasi senyawa yang diperoleh, tentunya, anda (atau orang lain) sudah
mengukur senyawa-senyawa murninya dari berbagai senyawa pada kondisi yang sama.
Anda juga dapat menggunakan puncak sebagai jalan untuk mengukur kuanti?tas dari senyawa
yang dihasilkan. Mari beranggapan bahwa tertarik dalam senyawa tertentu, X.

Jika anda menginjeksi suatu larutan yang mengandung senyawa murni X yang telah diketahui
jumlahnya pada instrumen, anda tidak hanya dapat merekam waktu retensi dari senyawa
tersebut, tetapi anda juga dapat menghubungkan jumlah dari senyawa X dengan puncak dari
senyawa yang dihasilkan.

Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor, dan area
ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer. Area dihitung sebagai bagian yang
berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana).

Jika larutan X kurang pekat, area dibawah puncak akan berkurang meskipun waktu retensi akan
sama. Misalnya,

Ini berarti dimungkinkan mengkalibrasi instrumen sehingga dapat digunakan untuk mengetahu
berapa jumlah substansi yang dihasilkan meskipun dalam jumlah kecil.

Meskipun demikian, harus berhati-hati. Jika anda mempunyai dua substansi yang berbeda dalam
sebuah campuran (X dan Y), dapatkah anda mengatakan jumlah relatifnya? Anda tidak dapat
mengatakannya jika anda menggunakan serapan UV sebagai metode pendeteksinya.

Dalam gambar, area di bawah puncak Y lebih kecil dibanding dengan area dibawah puncak X.
Ini mungkin disebabkan oleh karena Y lebih sedikit dari X, tetapi dapat sama karena Y
mengabsorbsi sinar UV pada panjang gelombang lebih sedikit dibanding dengan X. Ini mungkin
ada jumlah besar Y yang tampak, tetapi jika diserap lemah, ini akan hanya memberikan puncak
yang kecil.

Rangkaian HPLC pada spektrometer massa

Ini menunjukkan hal yang sangat menakjubkan! Pada saat detektor menunjukkan puncak,
beberapa senyawa sementara melewati detektor dan pada waktu yang sama dapat dialihkan pada
spektrometer massa. Pengalihan ini akan memberikan pola fragmentasi yang dapat dibandingkan
pada data komputer dari senyawa yang polanya telah diketahui. Ini berarti bahwa identifikasi
senyawa dalam jumlah besar dapat ditemukan tanpa harus mengetahui waktu retensinya.