Anda di halaman 1dari 6

PENEKANAN EKSPRESI ENZIM COX-2 PADA KULTUR SEL RAJI OLEH

EKSTRAK KLOROFORM DAUN CANGKRING (Erythrina fusca Lour.)

Zullies Ikawati, Agung Endro Nugroho, Widyah Astutiningsih


Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada

ABSTRAK
Prostaglandin, salah satu mediator yang bertanggung jawab terhadap proses inflamasi dan
perkembangan kanker, disintesis dari asam arakidonat dengan katalisasi enzim siklooksigenase (COX).
Enzim COX terdiri dari 2 isoform, yaitu COX-1 dan COX-2. Enzim COX-2 diketahui meningkat
ekspresinya pada inflamasi dan kanker. Daun cangkring (E. fusca) telah dilaporkan memiliki efek
antiinflamasi dan antiproliferatif. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan ekstrak kloroform
daun E. fusca dalam menekan ekspresi enzim COX-2 pada kultur sel Raji.
Penelitian diawali dengan uji sitotoksik ekstrak kloroform daun E. fusca dengan kadar masing-
masing: 2, 4, 8, 16, 32, dan 64 µg/ml, untuk menentukan harga LC50 yang akan digunakan uji penekanan
ekspresi enzim COX-2. Selanjutnya dilakukan uji penekanan ekspresi enzim COX-2 dengan metode
immunositokimia. Kemampuan penekanan dinyatakan dalam % dibandingkan dengan kontrol.
Hasil uji sitotoksik menunjukkan bahwa harga LC50 adalah sebesar 4,05 µg/ml. Hasil uji
penekanan ekspresi enzim COX-2 menunjukkan bahwa kenaikan kadar ekstrak uji berbanding lurus dengan
peningkatan kemampuan ekstrak dalam menekan ekspresi enzim COX-2. Penekanan ekspresi enzim COX-
2 pada kadar ekstrak uji 2, 4, dan 8 µg/ml berturut-turut adalah sebesar (dalam %) 45,54 ± 0,16; 53,88 ±
1,47; dan 73,35 ± 1,06.

Kata kunci: E. fusca, enzim COX-2, kultur sel Raji, imunositokimia

ABSTRACT
Prostaglandin, one of the mediators responsible for inflammation process and development of
cancer, is synthesized from arachidonic acid with catalization of cyclooxygenase (COX). COX exists in 2
isoforms, i.e. COX-1 and COX-2. COX-2 is highly expressed in inflammation process and cancer
development. The leaves of E. fusca has been reported to have antiinflammation and antiproliferation
activities. The research aims to study whether the chloroform extract of E. fusca Lour leaves could suppress
the expression of COX-2 enzyme that is exposed in Raji cell line.
The expression of COX-2 was observed using immunocytochemistry method. The concentration
of extract used was determined from LC50 in cytotoxicity study. The LC50 of the extract was 4,05 µg/ml.
Results shows that the extract with the concentration of 2, 4, and 8 µg/ml were able to suppress the
expression of COX-2 in Raji cell line, with the suppression activity of (in %) 45,54 ± 0,16; 53,88 ± 1,47;
and 73,35 ± 1,06, respectively.

Key words : E. fusca leaves, COX-2 expression, Raji cell line, immunocytochemistry.
PENDAHULUAN
Tanaman E. fusca (cangkring) telah METODOLOGI
dilaporkan memiliki aktivitas antiinflamasi 1. Bahan
pada model kaki tikus terinduksi karagenin Daun E. fusca Lour, kloroform
(Nurliani, 2003; Ikawati, et al, 20061) dan (Brataco), RPMI (Rosewell Park Memorial
antiproliferatif pada kultur sel kanker HeLa Institute) 1640 (Sigma), Hepes (Sigma),
(Puspitasari, 2004). Tanaman ini juga terbukti Fetal Bovine Serum (FBS) 10% (v/v)
mengandung terpenoid, fenol, dan flavonoid (Gibco), penisilin-streptomisin 1% (v/v)
dalam ekstrak kloroform daun cangkring (Gibco), fungison 0,5% (v/v) (Gibco),
(Wahyuningsih, 2004), dimana flavonoid dan kultur sel Raji, DMSO 100%, COX-2-
terpenoid berperan dalam regulasi enzim mouse monoclonal antibody (Novo Castra),
siklooksigenase (COX) (Perera et al., 2001). biotinylated Goat Anti-Polyvalent (Lab
Enzim siklooksigenase merupakan Vision), Streptavidin-Peroxidase (Lab
enzim yang mengkatalisis pembentukan Vision), DAB (3,3’ Diaminobenzinidine)
prostaglandin, suatu mediator inflamasi, (Lab Vision).
produk metabolisme asam arakidonat. Enzim 2. Alat
COX terdiri dari 2 isoenzim yaitu: COX-1 dan Alat-alat gelas, mikroskop cahaya,
COX-2. Enzim COX-1 bersifat konstitutif tissue culture flask (Nunclon), tabung
untuk memelihara fisiologi normal dan conical (Nunclon), plate 96 wheel
homeostasis, sedangkan COX-2 merupakan (Nunclon), coverslip, poly-l-lysine slide,
enzim yang terinduksi pada sel yang plate 24 (Nunclon).
mengalami inflamasi (Leahy et al., 2000). 3. Jalannya Penelitian
COX-2 juga berperan dalam proliferasi sel Pembuatan ekstrak kloroform daun E
kanker. Overekspresi COX-2 ditemukan pada fusca Lour
kebanyakan tumor (Simmons and Moore, Ekstraksi dilakukan dengan
2000). maserasi serbuk daun E. fusca 500 gram
Mengingat besarnya peran COX-2 menggunakan kloroform. Serbuk
dalam proses inflamasi dan kanker, maka direndam sempurna dengan penyari
perlu dilakukan pencarian agen yang dapat berada 2 cm di atas serbuk sebanyak 3 x
mempengaruhi regulasi enzim COX-2, sampai sisa ampas jernih, masing-masing
misalnya melalui penekanan ekspresi enzim maserasi dilakukan selama 2 x 24 jam
COX-2. Tanaman E. fusca merupakan salah sambil sesekali digojog. Sari yang
satu tanaman yang berpotensi untuk diperoleh kemudian dihilangkan dari
dikembangkan sebagai agen penghambat penyarinya dengan menggunakan
COX-2 dengan aktivitasnya sebagai evaporator. Sari yang diperoleh disebut
antiinflamasi dan antiproliferasi sel kanker. sari kloroform. Sari kloroform diuapkan
Ekstrak etanolnya telah dilaporkan dapat hingga diperoleh ekstrak kental sebanyak
menekan ekspresi enzim COX-2 (Ikawati, et 42,04 gram.
al., 20062). Untuk itu, perlu diteliti apakah
ekstrak kloroform daun E. fusca Lour juga Uji sitotoksik dengan metode
dapat mempengaruhi regulasi COX-2 melalui penghiungan langsung
mekanisme penekanan ekspresi COX-2. Ke dalam 100,0 µl suspensi sel pada
Kultur sel Raji dipilih sebagai media karena setiap sumuran yang berbeda (kepadatan
memiliki ekspresi COX-2 yang tinggi. Sel Raji sel 2 x 104 sel /sumuran) masing-masing
merupakan ‘continous cell line’ yang ditambahkan 100,0 µl sampel dalam
diturunkan dari sel ß-Limfoma manusia media kultur RPMI 1640 hingga dicapai
(Anonim, 2001). Penelitian oleh Wun seri kadar akhir dalam sumuran yaitu 64;
melaporkan bahwa sel Raji terbukti 32; 16; 8; 4; dan 2µg/ ml. Pada kontrol
mengekspresikan COX-2 dalam jumlah yang media, 100,0 µl senyawa uji diganti
cukup besar yaitu 2,2 - 4,3 kali lebih besar dengan 100,0 µl media kultur, sedang
daripada sel B normal (Wun, dkk., 2004). pada kontrol pelarut, diganti dengan 5,0 µl
DMSO 0,25 % dan 95,0 µl media kultur. dengan metode probit untuk menentukan
Selanjutnya plate diinkubasikan dalam persamaan garis regresi dan harga LC50.
inkubator 5% CO2 selama 24 jam pada Uji immunositokimia
suhu 370C, lalu ditambahkan 50,0 µl Persen penekanan ekspresi COX-2
larutan biru triptan 0,5 % dalam akuades. dihitung dengan rumus:
Setelah itu larutan dalam tiap sumuran
diresuspensi kuat dan diambil 10,0 µl jml sel yang mengekspresikan COX-2
untuk penghitungan sitotoksistas % penekanan 100 %
total sel terhitung
x100
menggunakan metoda penghitungan
langsung dengan bantuan biru tripan. Persen penekanan ekspresi enzim COX-2
dianalisis secara statistik dengan metode
Uji penekanan ekspresi enzim COX-2 ANOVA satu jalan, dilanjutkan dengan
dengan media sel Raji uji LSD dengan taraf kepercayaan 95%.
Ke dalam suspensi sel pada setiap
sumuran yang berbeda (kepadatan sel 5 x
105 sel/ sumuran) ditambahkan 1000 µl HASIL DAN PEMBAHASAN
sampel dalam media kultur RPMI 1640 A. Uji Sitotoksisitas
hingga dicapai seri kadar akhir dalam Uji sitotoksisitas dilakukan untuk
sumuran yaitu 8; 4; dan 2 µg/ml. Pada memberikan gambaran kemampuan ekstrak
kelompok kontrol, 1000 µl sampel diganti kloroform daun E. fusca dalam memberikan
dengan 1000 µl media kultur. Selanjutnya efek toksik terhadap sel Raji yang dinyatakan
plate diinkubasikan dalam inkubator 5% dengan harga LC50 (konsentrasi senyawa uji
CO2 selama 24 jam pada suhu 370C. Sel yang dapat menghambat 50% pertumbuhan
yang telah diinkubasi kemudian dipanen sel). Uji sitotoksisitas ini dilakukan dengan
dan dibuat apusan pada gelas obyek (poly- metode perhitungan langsung (direct
l-lysine slide) untuk diuji secara counting) dengan bantuan neubauer
imunositokimia menggunakan antibodi haemocytometer.
(IgG) primer monoklonal mencit anti Ekstrak kloroform daun E. fusca larut
COX-2, dan divisualisasikan dengan dengan baik dalam DMSO sehingga sebagai
reaksi warna. Ekspresi COX-2 diamati pelarut digunakan DMSO. Penggunaan
menggunakan mikroskop cahaya. Sel yang DMSO sampai kadar 1,25% v/v pada sel Hela
mengekspresikan protein COX-2 akan dan sel Raji relatif tidak berpengaruh terhadap
memberikan warna coklat/gelap, proliferasi sel (Da’i, 2003). Pada percobaan
sedangkan yang tidak akan memberikan yang dilakukan untuk konsentrasi ekstrak
warna ungu/ biru. Jumlah sel dihitung kloroform daun E. fusca tertinggi, konsentrasi
pada luasan tertentu, baik yang berwarna pelarut DMSO yang digunakan adalah 0,64%
coklat/gelap maupun yang berwarna biru, v/v sehingga pengaruh pelarut kemungkinan
kemudian dianalisis seperti tertera di sangat kecil.
bawah ini.

Analisis hasil
Uji sitotoksisitas
Persentase kematian sel dengan rumus
sebagai berikut:.
jml sel hidup kontrol – jmlh sel hidup sampel
% kematian = x 100 %
jumlah sel hidup
Selanjutnya dibuat grafik hubungan
antara kadar sampel terhadap persentase
kematian sel dan dilakukan uji korelasi
Tabel 1. Prosentase kematian dan nilai probit pada uji sitotoksisitas dengan perlakuan pemberian
seri konsentrasi ekstrak kloroform daun E. fusca pada kultur sel Raji

Kadar (µg/ml) Log Kadar % kematian sel probit


2 0,3010 42,70 4,82
4 0,6021 50,52 5,02
8 0,9031 57,81 5,20
16 12,041 62,50 5,30
32 15,051 72,39 5,58
64 18,062 81,25 5,88

Tabel 2. Purata penekanan ekspresi enzim COX-2 oleh ekstrak kloroform daun E. fusca pada kultur sel
Raji, dibandingkan dengan kontrol negatif. Percobaan dilakukan 3 kali secara duplikat.

Perlakuan Purata penekanan ekspresi enzim COX-2


(dalam %) ± SEM
Kontrol negatif 0.11 ± 0.11
Kadar 2 µg/ml 45.54 ± 0.16
Kadar 4 µg/ml 53.88 ± 1.47
Kadar 8 µg/ml 73.35 ± 1.06

A B

C D E

Gambar 1. Hasil pengecatan immunositokimia terhadap COX-2 dengan media sel Raji pada pengamatan di
bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 40 X. A. kontrol negatif, yaitu kelompok tanpa larutan uji dengan
pengecatan antibodi spesifik COX-2. Terlihat semua sel tercat coklat, menunjukkan hasil positif terhadap enzim
COX-2. B. blangko; kelompok tanpa senyawa uji dan tanpa pengecatan antibodi spesifik COX-2. C s/d E :
Perlakuan ekstrak kloroform daun E. fusca dengan kadar 2 µg/ml (C), 4 µg/ml (D), dan kadar 8 µg/ml (E).
Tanda panah hitam menunjukkan hasil positif COX-2, tanda panah kuning menunjukkan hasil negatif COX-2.

Perhitungan sel pada uji sitotoksik dilakukan hidup akan berwarna terang jelas. Hasil uji
dengan mengamati sel hidup dan mati akibat sitotoksisitas dapat dilihat pada tabel 1.
perlakuan. Sel mati ditampilkan dengan warna Terlihat bahwa terjadi hubungan yang linier
biru oleh biru tripan, sedangkan sel yang antara kenaikan kadar ekstrak uji dengan
persen kematian sel Raji. Dari hasil analisis mempunyai kemampuan dalam penekanan
probit diperoleh bahwa harga LC50 ekstrak ekspresi enzim COX-2 secara tergantung
kloroform daun E. fusca adalah sebesar 4,05 dosis.
µg/ml. Dari hasil uji sitotoksisitas ini Hasil penelitian ini mendukung
ditetapkan kadar untuk uji penekanan ekspresi penelitian sebelumnya mengenai aktivitas
enzim COX-2 adalah dengan kisaran kadar 2, ekstrak kloroform daun E. fusca sebagai
4, dan 8 µg/ml. antiinflamasi (Nurliani, 2003; Ikawati, et al,
B. Uji penekanan ekspresi enzim COX-2 20061), dan antiproliferasi sel kanker
dengan metode immunositokimia (Puspitasari, 2004). Enzim COX-2 merupakan
Dalam penelitian ini pengamatan uji enzim yang bertanggung jawab terhadap
penekanan ekspresi enzim COX-2 dilakukan respon inflamasi dan produksi prostaglandin
dengan cara imunnositokimia metode Labeled (Leahy et al., 2000) dan terekspresi tinggi
Streptavidin Biotin (LSAB) yang kemudian dalam sel tumor (Abukhalaf, 2004).
dianalisa secara kualitatif dan kuantitatif. Prostaglandin dilaporkan berperan dalam
Dari analisis secara kualitatif dapat upregulasi VEGF dan menginduksi
terlihat bahwa dengan peningkatan kadar angiogenesis pada sel tumor (Akarasereenont
ekstrak uji, sel-sel yang mengekspresikan et al., 2002). Penekanan produksi
COX-2 positif semakin sedikit, menunjukkan prostagandin PGE2 akan menurunkan ekspresi
bahwa telah terjadi penurunan ekpresi enzim bcl-2, suatu antiapoptosis (Shacter and
COX-2 pada sel Raji. Hasil pengecatan Weitzman, 2002). Dengan demikian diduga,
immunositokimia dapat dilihat pada gambar 1. aktivitas ekstrak uji sebagai antiinflamasi dan
Selanjutnya, dilakukan analisis antikanker diperantarai oleh penghambatan
kuantitatif untuk mengetahui % penekanan COX-2 sebagai salah satu mekanismenya.
ekspresi enzim COX-2 oleh ekstrak uji Ekstrak kloroform nampaknya memiliki
Kuantifikasi % penekanan ekspresi enzim potensi yang lebih besar dalam penekanan
COX-2 dilakukan dengan terlebih dahulu ekspresi COX-2 dibandingkan dengan ekstrak
menghitung % ekspresi protein COX-2. Hasil etanol. Jika ekstrak etanol memerlukan
perhitungannya dapat dilihat pada tabel 2. konsentrasi 250 µg/ml untuk memberikan
Pada tabel 2 terlihat bahwa kenaikan penekanan ekspresi COX-2 pada sel Raji
konsentrasi ekstrak kloroform 2; 4; 8 (µg/ml) sebesar 70,19 % (Ikawati, et al, 20062),
memberikan rata-rata % penekanan ekspresi ekstrak kloroform dapat menekan ekspresi
COX-2 yang semakin meningkat, yaitu COX-2 sebesar 75.35% pada konsentrasi
masing-masing sebesar 45,54±0,16%; hanya 8 µg/ml. Karena itu, ekstrak kloroform
53,88±1,47%; dan 73,35±1,06%. Sedangkan ini lebih potensial untuk dikembangkan
pada kontrol rata-rata penekanan enzim adalah sebagai obat, penekan ekspresi COX-2.
sebesar 0,11±0,11%. Senyawa aktif apa yang terutama
Selanjutnya data % penekanan bertanggungjawab terhadap semua efek ini
ekspresi enzim COX-2 pada masing-masing belum diteliti lebih lanjut, namun ada dugaan
kelompok perlakuan dan kontrol dianalisis bahwa senyawa aktifnya adalah flavonoid dan
secara statistik menggunakan analisis statistik terpenoid, karena Perera et al (2001)
parametrik ANOVA satu jalan dilanjutkan melaporkan bahwa flavonoid dan terpenoid
dengan uji LSD. Analisis statistik pberperan dalam regulasi enzim COX-2.
menunjukkan % penekanan ekspresi enzim Namun demikian, Perlu dilakukan penelitian
COX-2 pada berbagai kelompok perlakuan lebih lanjut untuk mengetahui fraksi aktif apa
dan kontrol memberikan perbedaan yang dari ekstrak uji yang memiliki efek penekanan
bermakna (p < 0,05). Kenaikan kadar ekstrak ekspresi COX-2. Hal ini diharapkan dapat
uji yang diberikan mampu memberikan memperkaya bukti-bukti ilmiah akan aktivitas
peningkatan % penekanan ekspresi enzim ekstrak tersebut sebagai antiinflamasi dan
COX-2 secara signifikan bila dibandingkan antikanker.
dengan kontrol. Dengan demikian maka
ekstrak kloroform daun E. fusca dikatakan KESIMPULAN
Dari penelitian dengan menggunakan Biological Properties, 434-465, Taylor
ekstrak kloroform daun E. fusca Lour dapat and Francis, London.
ditarik kesimpulan bahwa ekstrak kloroform Puspitasari, E., 2004, Efek Antiproliferatif Ekstrak
daun E. fusca Lour dengan kadar 2; 4; dan 8 Kloroform Daun Tumbuhan E. fusca Lour
(Erythrina fusca Lour.) dan Beberapa
µg/ml mampu menekan ekspresi enzim COX-
Isolatnya terhadap Sel HeLa, Skripsi,
2 secara bermakna dibandingkan kelompok Fakultas Farmasi Universitas Gadjah
kontrol pada media sel Raji, berturut-turut Mada, Yogyakarta
sebesar (dalam %) 45,54 ± 0,16; 53,88 ± 1,47; Shacter, E., and Weitzman, S.A., 2002, Chronic
dan 73,35 ± 1,06. Inflammation and Cancer, Oncology, 16
(2), 217-232.
DAFTAR PUSTAKA Simmons, D.L., Moore, B.C., 2000, COX-2
Abukhalaf, I.K., von Deutsch, D.A., Bayorh, M.A., Inhibition, Apoptosis, and
2004, Cyclooxygenase Inhibitors, Chemoprevention by Nonsteroidal Anti-
Disease-Modifying Antirheumatic Agents, inflammatory Drugs, Curr Med Chem, 7,
and Drugs Used in Gout, dalam Handbook 1131-1144
of Drug Interaction A Clinical and Wahyuningsih, P., 2004, Isolasi dan Identifikasi
Forensic Guide, 2004, 337-365, Homana Senyawa yang Terkandung dalam Ekstrak
Press, New Jersey Kloroform Daun Cangkring (Erythrina
Akarasereenont, P.C., Techatraisak, K., Thaworn, fusca Lour.), Skripsi, Fakultas Farmasi
A., and Chotewuttakorn, S., 2002, The Universitas Gadjah Mada Yogyakarta
expression of COX-2 in VEGF-treated Wun T, Mc Knight H, Tuscano JM., 2004,
endothelial cells is mediated through Increased cyclooxygenase-2 (COX-2): a
protein tyrosine kinase, Mediators potential role in pathogenesis of
Inflamm., 11 (1), 17-24 lymphoma, Leuk Res. 28(2):179-90.
Anonima, 2001, Raji, http://www.biowhittaker.be.,
Juni 2005
Ikawati, Z., Sismindari, Nugroho, A.E., 20061,
Efek ekstrak daun Erythrina fusca Lour
terhadap edema dan rekrutmen neutrofil
pada respon inflamasi akut pada tikus,
MOT, 11(36), 37-41
Ikawati Z., Nugroho, A.E., Windha, W., 20062,
Efek ekstrak etanol daun Erythrina fusca
Lour terhadap penekanan ekspresi enzim
siklooksigenase-2 pada kultur sel Raji,
MFI, accepted, in press
Leahy, K.M., Ornberg, R.L., Wang, Y., Zweifel,
B.S., Koki, A.T., dan Masferrer, J.L.,
2002, Cyclooxygenase-2 Inhibition by
Celecoxib Reduces Proliferation and
Induces Apoptosis in Angiogenic
Endothelial Cells in Vivo, Cancer Res.,
62, 625–631
Nurliani, M., 2003, Uji Antiinflamasi Ekstrak
Metanol Daun Cangkring (Erythrina fusca
Lour.) terhadap Inflamasi Akibat Reaksi
Anafilaksi Kutaneus Aktif pada Tikus
Wistar Jantan, Skripsi, Fakultas Farmasi
Universitas Gadjah Mada, Yoyakarta
Perera, P., Ringbom, T., Huss, U., Vasage, M., and
Bohlin, L., 2001, Search for Natural
Product which Affect Cyclooxygenase-2,
in Tringali, C., (Ed.), Bioactive
Compounds from Natural Sources:
Isolation, Characterisation, and

Beri Nilai