Anda di halaman 1dari 15

KINETIKA REAKSI ENZIM

I.Tujuan percobaan :

Diharapkan mahasiswa dapat memahami kinetika reaksi enzim dan faktor-faktor yang
mempengaruhi kondisi optimum suatu enzim

II.Teori dasar:

Enzim merupakan protein yang mengkatalisi reaksi biokimia yang secara kolektif
membentuk metabolism perantara dari sel. Enzim bekerja dengan urutan yang teratur, enzim
mengkatalisis ratusan reaksi yang menyimpang dan mengubah energy kimiawi dan yang
membuat makromolekul sel dari prekursor sederhana.

Enzim bekerja dengan menurunkan energi aktivasi suatu reaksi kimia tanpa mengubah
keseluruhan perubahan energi bebas reaksi atau letak kesetimbangan akhir. Enzim sebagai
katalisator menurunkan energi aktivasi reaksi-reaksi kimia dan meningkatkan fraksi molekul di
dalam suatu populasi molekul tertentu untuk lebih cepat bereaksi per satuan waktu di banding
dengan keadaaan tanpa katalisator. Enzim juga bergabung dengan substratnya selama siklus
katalitiknya.

Analisis kuantitatif kinetika reaksi enzim dapat dilakukan dengan dua asas pendekatan
yaitu asas keseimbangan menurut Michaelis-Menten dan asas teori keadaan tunak ( Steady state
theory) menurut Briggs-Haldone. Substrat tungal dapat dijelaskan dengan postulat reaksi berikut,
dimana E adalah enzim, S adalah substrat dan P adalah produk.

k1 k3
E+S ES E+P

Reaksi enzimatik berlangusng melalui pembentukan kompleks enzim substrat (ES). Bila
semua enzim dalam keadaan enzim keadaan ES ( system jenuh oleh substrat ), maka laju reaksi
akan mencapai nilai maksimum ( Vmaksimum).
Persamaan Michelis-Menten yang merupakan persamaan kecepatan bagi suatu reaksi
enzimatik substrat tunggal menyatakan mengenai hubungan kuantitatif diantara kecepatan reaksi
awal ( Vo), kecepatan reaksi maksimum ( v maksimum), konsentrasi substrat (S) dan konstanta
Michaelis Menten (Km) yang nilainya sama dengan ( k2+k3)/k1. Pendekatan dengan teori
keadaan tunak menurut Briggs-Haldane, dimana laju reaksi pembentukan kompleks ES sama
dengan laju reaksi penguraian ES menjadi P dan E juga akan menghasilkan persamaan yang
sama untuk berhubungan antara laju reaksi enzim dan konsentrasi substrat.

Persamaan Michelis-Menten dapat ditransformasikan/ di turunkan secara aljabar menjadi


bentuk lain yang lebih bermanfaat didalam pemetaan data percobaan menjadi persamaan
Lineweaver-burk, persamaan ini memiliki banyak manfaat karena menghasilkan penentuan V
maks secara lebih tepat yang hanya dapat di duga pada pemetaan Vo terhadap (S).

Dalam percobaan kinetika reaksi enzim kita bias mempelajari prinsip percobaannya :Laju
awal (V0) dari reaksi yang dikatalisis enzim meningkat dengan bertambahnya konsentrasi
substrat hingga di capai keadaan dimana penambahan substrat tidak lagi meningkatkan laju
reaksi dan bila semua enzim dalam keadaan ES ( jenuh oleh substrat) maka laju reaksi akan
mencapai nilai maksimum ( V maks).
Gambar:

V ---------------------------------------

kemiringan = Km/v maks

V= ½ V maks

--------

1/v masks

(S)=Km (S) -1/Km 1/(S)

III. Alat dan bahan:

Alat: Bahan:

1.Stop watch 1.Larutan TCA 20 %

2.Tabung reaksi 2.Larutan kasein 2 % ( b/v)

3.Pengaduk gelas 3.Larutan dapar fosfat 0.1 pH 8.0

4.Pipet ukur 1 ml, 5ml, 10 ml 4.Larutan NaOH 0.5 N

5.Water bath 350 C 5.Aquadest

6. Kertas saring 6.Reagen Folin-Ciocalteu

7. Kuvet 7.Larutan tripsin

8. Spektrofotometer/ kolorimeter

9.Corong kaca
IV. Prosedur Percobaan dan Hasil Pengamatan

Cara kerja Hasil pengamatan


Tabung t= 0 menit
-Dalam tabung reaksi berpengaduk, masukkan Pada tabung I di masukan buffer fosfat di
larutan buffer fosfat dan tripsin serta tambah tripsin di tambah TCA hasil larutan
tambahkan masing-masing 3 ml larutan TCA menjadi bening
20 % aduk perlahan, ingkubasi 30 menit dalam Pada tabung II di masukan buffer fosfat di
water bath 35oC. tambah tripsin di tambah TCA hasil larutan
- Tambahkan larutan kasein sesuai table dan menjadi bening
diamkan selama 20 menit dalam air es Pada tabung III di masukan buffer fosfat di
- Sentrifuga 10 menit dan saring melalui kertas tambah tripsin di tambah TCA hasil larutan
saring untuk diambil supernatanya. menjadi bening
- Filtrat diperlakukan lebih lanjut munurut Pada tabung IV di masukan buffer fosfat di
metode anson tambah tripsin di tambah TCA hasil larutan
menjadi bening
Pada tabung V di masukan buffer fosfat di
tambah tripsin di tambah TCA hasil larutan
menjadi bening

Setelah di ingkubasi dan di beri kasein


Pada tabung I terdapat endapan
Pada tabung II terdapat endapan
Pada tabung III terdapat endapan
Pada tabung IV terdapat endapan
Pada tabung V terdapat endapan

Keterangan:
Tabung 1 endapan (+++++)
Tabung II endapan (++++)
Tabung III endapan (+++)
Tabung IV endapan (++)
Tabung V endapan (+)
Tabung t= 20 menit
-Inkubasi masing-masing tabung berpengaduk
yang berisi kasein sesuai table selama 5 menit
pada water bath 350C sambil di aduk perlahan
( jarang sampai berbusa), kemudian Setelah di ingkubasi
tambahkan berturut-turut larutan buffer fosfat Hasil pengamatan kasein di tambah buffer
dan larutan tripsin fosfat
-Inkubasi selama tepat 20 menit dalam Tabung I warna bening
incubator 350C di hitung setelah penambahan Tabung II warna bening
tripsin. Tabung III warna bening ada sedikit endapan
-Hentikan reaksi dengan penambahan 3 ml Tabung IV warna keruh terdapat endapan
TCA 20 % ke dalam masing-masing tabung Tabung V warna keruh terdapat endapan
dan aduk dengan kuat
-Diamkan selama 20 menit dalam air es untuk Setelah penambahan tripsin
menyempurnakan pengendapan Tabung I terjadi sedikit endapan/agak putih
-Sentrifugasi selama 10 menit kemudian saring Tabung II terjadi sedikit endapan /agak keruh
untuk diambil supernatanya. Tabung III terjadi endapan/keruh
-Filtrat di perlakukan lebih lanjut dengan Tabung IV terjadi endapan/putih
metode anson. Tabung V terjadi endapan/putih banyak

N Tabung Tripsin Kasein Buffer fosfat Setelah di dinginkan dengan es 20 menit


o t= 0 (ml) (ml) (ml) Tabung I warna agak putih/ endapan sedikit
t= 20 1 0.1 5.9
Tabung II warna agak putih/endapan sedikit
I t= 0 1 0.1 5.9
t= 20 1 0.5 5.5
Tabung III warna putih/endapan sedikit
II t= 0 1 0.5 5.5 Tabung IV warna putih/ endapan sedikit
t= 20 1 1.0 5.0 Tabung V warna putih/ endapan banyak
III t= 0 1 1.0 5.0
t= 20 1 3.0 3.0
Setelah di sentrifugasi
IV 1 3.0 3.0
t= 0 Tabung I warna bening
V t= 20 1 5.0 1.0 Tabung II warna bening
1 5.0 1.0
Tabung III warna bening
Tabung IV warna bening
Tabung V warna bening

Metode anson

-Campurkan 2 ml TC-filtrat di atas dengan 4


ml NaOH 0.5 M
-Tambahkan 1 ml larutan Folin-Ciocalteu ( 1
volume reagen di tambah 1 volume aquades
sehingga mengandung 1 N asam).
-Diamkan 10 menit kemudian tetapkan
serapannya pada 650 nm
( pengukuran harus dilakukan tepat setelah 10
menit).

Pengolahan data
Absorbansi ( A) = A = At20-At0

T= t20-t0
V= A/ t

S= (aliquot/Vtotal)x 2%

Buat grafik yang menggambarkan antara 1/V


terhadap 1/S (grafik lineweaver-Burk) dan
tentukan nilai maks dan Km!
V. Pembahasan

Pada percobaan T=O . Larutan fosfat dan tripsin ditambahkan secara bersamaan di
karenakan agar enzim dapat bekerja secara optimum , dan dalam praktikum ini menggunakan
TCA, TCA merupakan larutan yang dapat menghentikan rekasi enzimatik sehingga enzim
emnjadi in aktiv dan enzim akan kehilangan fungsi katalitiknya sehingga fungsi dari TCA
tersebut yaitu untuk mengehentikan reaksi enzim

Dan dalam praktikum ini juga menggunakan buffer fosfat yang berfungsi agar larutan
tripsin bekerja secara optimal.Enzim bekerja pada suhu 250-300C, pada hewan enzim bekerja
pada suhu 250C dan pada manusia ezim bekerja pada suhu 300C, PH enzim 6-8

Dan setelah larutan tripsin di campur dengan buffer fosfat dan di tambah larutan TCA
dan langsung di waterbath lalu di simpan di ingkubator yang bertujuan agar enzim bias bekerja
mengkatalisis substrat. Dan setelah di ingkubator di beri larutan kasein di akhir karena enzim
pada t=0 sudah di nonaktivkan

Lalu di diamkan di dalam es bertujuan agar larutan mengendap karena air dingin akan
menurunkan larutan . Lalu setelah itu di sentrifugasi supaya larutan/endapan terpisah menjadi
bening dan terdapat endapan dari campurannya. Dan filtrate nya utuk di uji dengan metoda anson

Pada percobaan T=20 enzim bekerja sebagai katalisis jadi tidak diaktivasi jadi enzim dan
substrat bekerja, membentuk kompleks enzim substrat. Dan dalam percobaan ini larutan di
ingkubasi menyebabkan enzim bekerja optimum/ aktif. Lalu di tambahkan TCA sehingga enzim
tidak bekerja, lalu didiamkan dalam air es agar lautan mengendap lalu di setrifugasi supaya
larutan atau endapan terpisah menjadi bening dan terdapat endapan dari campurannya . Dan
filtartnya nya untuk di uji dengan metode anson.

Lalu setelah itu T=0 dan T=20 di uji dengan menggunakan metode anson, metode ini
bertujuan supaya jumlah substrat bias di ketahui yang di katalisis oleh enzim, di tambahkan
NaOH untuk menetralkan filtrate TCA dan di tambahkan folin berfungsi memberikan warna.
Dan lalu didiamkan serapannya pada 650nm yaitu spekto tampak.

Pada enzim faktor-faktor yang mempengaruhi konduksi optimum enzim ialah

1.PH

2.Suhu

3.Konsentrasi

4.Inhibitor

5.aktivator

Pada Metode Anson

T=0

Tabung I warna hitam bening

Tabung II warna bening kebiruan

Tabung III warna bening kebiruan

Tabung IV warna bening kebiruan

Tabung V warna bening kebiruan

T=20

Tabung I warna biru

Tabung II warna biru

Tabung III warna biru


Tabung IV warna hijau

Absorbansi

T= 0

Tabung I hasilnya A=0.113

Tabung II hasilnya A=0.041

Tabung III hasilnya A= 0.037

Tabung IV hasilnya A=0.128

Tabung V hasilnya A= 0.010

T=20

Tabung I hasilnya A=0.193

Tabung II hasilnya A=0.169

Tabung III hasilnya A=0.204

Tabung IV hasilnya A=0.364

Tabung V hasilnya A=0.058

A A= At20-At0

Tabung I= 0.193-0.041=0.152

Tabung II= 0.169-0.113=0.056

Tabung III= 0.204-0.037=0.167

Tabung IV= 0.364-0.128=0.236


Tabung V= 0.058-0.010=0.048

t = t20-t0

Semua tabung 1 sampai 5

t= 20-0 = 20

V= A/ t

Tabung I : 0.152/20= 7.60x10-3

Tabung II : 0.056/20=2.80x10-3

Tabung III : 0.167/20=8.35x10-3

Tabung IV : 0.236/20=1.18x10-2

Tabung V : 0.048/20=2.40x10-3

S= (aliquot/Vtotal)x 2 %

Tabung I : (0.1/7)x2%=2.85x10-4

Tabung II : (0.5/7)x2%=1.42x10-3

Tabung III : (1.0/7)x2%=2.85x10-3

Tabung IV : (3.0/7)x2%=8.57x10-3

Tabung V : (5.0/7)x2%=1.42x10-2
Grafik yang menggambarkan antara 1/V terhadap 1/S

(Grafik lineweaver-Burk)

0.02

0.01

0.01

0.01

0.01
Linear ()
0.01

0
0 0 0 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.02 0.02 0.02

Diketahui

1/v:

Tabung I= 131,57

Tabung II= 357,14


Tabung III= 119,7

Tabung IV= 84,74

Tabung V= 416,6

1/S

Tabung I= 3508,77

Tabung II= 704,22

Tabung III= 350,87

Tabung IV= 116,68

Tabung V= 70,42

Grafik yang menggambarkan antara V terhadap S

Grafik Michelis-Menten

0.02

0.01

0.01

0.01

0.01
Linear ()
0.01

0
0 0 0 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.02 0.02 0.02
Diketahui:

Tabung I =0.0076

Tabung II =0.0028

Tabung III =0.00835

Tabung IV =0.018

Tabung V =0.0024

Tabung I =0.000285

Tabung II =0.00142

Tabung III =0.00285

TabungIV =0.00857

Tabung V =0.0142
VI. Kesimpulan

Enzim merupakan protein yang mengkatalisis reaksi kimiawi spesifik. Enzim mengikat
molekul substrat membentuk komplek enzim substrat yang bersifat sementara yang terurai
membentuk enzim bebas dan produknya.

Konsentrasi Substrat mencapai setengah Vmaks adalah tetapan Michelis Menten yang
bersifat khas bagi masing-masing enzim yang bekerja pada substrat tertentu.

Enzim menyebabkan berlangsungnya reaksi kimia dengan mengarahkan substrat dengan


sisi karakteristik.

Pada T=0 . setelah melakukan percobaaan yaitu absorbansi di hasilkan pada tabung 1
adalah 0,113 , tabung II adalah 0,041, tabung III 0,037, tabung IV 0,128, tabung V 0,110.

Pada T=20 hasilnya pada tabung I 0,193 tabung II 0,169,tabung III 0,204,tabung IV
0,364, tabung V 0,058.

VII. Daftar Pustaka

1. Feseenden dan Fessenden. 1997. Dasar-Dasar Kimia Organik. Binarupa Aksara. Jakarta.
2.Lehninger Maggy Thenawijaya.1982.Dasar-Dasar Biokimia.Erlangga .Jakarta.
3.Poedjiaji,Anna. 1994.Dasar-Dasar Biokimia. Universitas Indonesia.Jakarta.

Anda mungkin juga menyukai