09/12/21

USULAN PENELITIAN
USULAN PENELITIAN

KEANEKARAGAMAN GENETIK KERANG TOTOK

(Polymesoda erosa) DI SUNGAI DONAN CILACAP BERDASARKAN
PENANDA RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA)

Oleh:
Oleh:
Pangeran Andareas
Pangeran Andareas
B1J007124
B1J007124
Pembimbing
Pembimbing 1:
1: Dr.
Dr. Agus
Agus Nuryanto,
Nuryanto, S.Si.,M.Si
S.Si.,M.Si
Pembimbing
Pembimbing 2:
2: Drs.
Drs. Agus
Agus Hery
Hery Susanto,
Susanto, M.S.
M.S.
 09/12/21

I. PENDAHULUAN

Salah satu kerang yang memiliki

Polymesoda erosa habitat di Sungai Donan Cilacap

Dikenal sebagai kerang totok

Banyak dikonsumsi

www.aquarium.co.jp
Mengandung daging protein hewani

FAKULTAS BIOLOGI UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN PURWOKERTO

 09/12/21

Populasi kerang overeksploitasi

totok mengalami
penurunan Pencemaran perairan

Penurunan keanekaragaman genetik

Penurunan kemampuan adaptasi, ketahanan

populasi, dan produktivitas

Kelestarian populasi kerang totok terancam

zoster-lingkungankita.blogspot.com

Diperlukan upaya pelestarian

FAKULTAS BIOLOGI UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN PURWOKERTO

 09/12/21

Upaya pelestarian

Studi keanekaragaman genetik pada populasi yang

bersangkutan

Memberikan evaluasi mengenai keanekaragaman

genetik yang terjadi pada suatu populasi

FAKULTAS BIOLOGI UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN PURWOKERTO

 09/12/21

Studi
keanekaragaman
genetik

Tidak langsung langsung

Berdasarkan
Berdasarkan polimorfisme DNA
polimorfisme enzim

Menggunakan marka
genetik berupa DNA

Salah satu marka DNA: Random

Amplified Polymorphic DNA (RAPD)

FAKULTAS BIOLOGI UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN PURWOKERTO

 09/12/21

Salah satu teknik molekuler untuk

RAPD mendeteksi keanekaragaman DNA
atas dasar penggandaan DNA

Sering digunakan karena

memiliki beberapa
keuntungan

www. scielo.cl
Relatif murah dan mudah dilakukan serta cepat
diketahui hasilnya

Tidak membutuhkan informasi sekuens DNA yang

akan diamplifikasi

membutuhkan sampel DNA yang relatif rendah

FAKULTAS BIOLOGI UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN PURWOKERTO

 09/12/21

PERUMUSAN MASALAH

1. primer apa saja yang menghasilkan marka RAPD yang

konsisten dan memberikan pita polimorfik pada DNA
kerang totok di Sungai Donan?

2. berapa besar keanekaragaman genetik populasi kerang

totok di Sungai Donan?

FAKULTAS BIOLOGI UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN PURWOKERTO

 09/12/21

TUJUAN PENELITIAN

1. mendapatkan primer yang menghasilkan marka RAPD

yang konsisten dan memberikan pita polimorfik pada
DNA kerang totok di Sungai Donan

2. mendapatkan informasi tentang keanekaragaman genetik

populasi kerang totok di Sungai Donan

FAKULTAS BIOLOGI UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN PURWOKERTO

 09/12/21

KEGUNAAN PENELITIAN

dapat memberikan informasi mengenai

keanekaragaman genetik kerang totok di
Sungai Donan Cilacap sehingga dapat
digunakan sebagai bahan dasar dalam
upaya pelestarian populasi kerang
tersebut.

FAKULTAS BIOLOGI UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN PURWOKERTO

 09/12/21

II. MATERI DAN METODE PENELITIAN

MATERI PENELITIAN

BAHAN

rizalfishery.blogspot.com

Kerang totok dari Sungai Donan Cilacap, larutan Chelex,

ditiothreitol, proteinase-K, alkohol 70%, alkohol 96%, ddH2O, bufer
PCR 10X, larutan magnesium klorida, larutan dNTP, enzim Taq DNA
Polimerase, primer, etidium bromida, lodying dye, dan Agarosa

FAKULTAS BIOLOGI UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN PURWOKERTO

 09/12/21

MATERI PENELITIAN

ALAT
Alat penunjang: kontainer plastik, sarung
tangan, bak preparat dan pinset.

UV transiluminator
Mesin PCR

Seperangkat elektroforesis

Mikrosentrifuse Micro
Tabung
Lemari pipette
mikro
Tippendingin
Disecting set Thermomixer

FAKULTAS BIOLOGI UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN PURWOKERTO

 09/12/21

LOKASI DAN WAKTU PENELITIAN

Analisis penanda RAPD di

Laboratorium Taksonomi
LOKASI Hewan Fakultas Biologi
Unsoed Purwokerto

WAKTU Enam bulan

FAKULTAS BIOLOGI UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN PURWOKERTO

 09/12/21

METODE PENELITIAN

survei Pengambilan
sampel kerang
totok

Teknik incidental
sampling

FAKULTAS BIOLOGI UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN PURWOKERTO

 09/12/21

CARA KERJA

Pengumpulan Plasma Nutfah

Isolasi DNA

Amplifikasi marka RAPD

Visualisasi DNA

FAKULTAS BIOLOGI UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN PURWOKERTO

 09/12/21

PENGUMPULAN
PENGUMPULAN PLASMA
PLASMA NUTFAH
NUTFAH

Kerang totok

Dipotong jaringan ototnya

dengan ukuran ± 5 mm www.conchology.be

Diawetkan dalam Disimpan pada suhu 4°C hingga analisis

alkohol 96% DNA dilakukan

FAKULTAS BIOLOGI UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN PURWOKERTO

 09/12/21

2.
2.Isolasi
Isolasi DNA
DNA genomik
genomik dengan
dengan metode
metode
chelex (Walsh et
chelex (Walsh et al
al.,., 1991)
1991)

Tabung
Tabung mikro
mikro (100
(100 mL
mL chelex
chelex 5%
5% ++ 55
Jaringan
Jaringanotot
otot mL
mLditiothreitol
ditiothreitol++ 44mL
mLproteinase-K)
proteinase-K)
kerang
kerang

Sentrifugasi
Sentrifugasi(1
(1menit,
menit, Inkubasi
Inkubasi (54°C,
(54°C, 4-6
4-6 jam,
jam,
13.000
13.000rpm)
rpm) 1000
1000rpm)
rpm)

Inkubasi
Inkubasi
Supernatan
Supernatan Migrasi
Migrasipd
pd
(95°C,
(95°C,5-10
5-10
dipindahkan
dipindahkankekedalam
dalam Gel
Gelagarosa
agarosa
menit
menit))
Tabung
Tabungmikro
mikrobaru
baru

FAKULTAS BIOLOGI UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN PURWOKERTO

 09/12/21

AMPLIFIKASI
AMPLIFIKASI DNA
DNA

Marka RAPD akan di amplifikasi dengan 10 primer acak yaitu:

GEN11 (5’-TGCGCGATCG-3’)
GEN12 (5’-CAGGGTCGAC-3’)
GEN13 (5’-ACGGTGCCTG-3’)
GEN14 (5’-CGCATTCCGC-3’)
GEN15 (5’-GAGATCCGCG-3’)
GEN16 (5’-GGACTCCACG-3’)
GEN17 (5’-ATCTCCCGGG-3’)
GEN20 (5’-CAGACACGGC-3’)
GEN23 (5’-GTGTAGGGCG-3’)
GEN24 (5’-CGGGTCGATC-3’)
(Aranisi dan Okimoto, 2004)

FAKULTAS BIOLOGI UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN PURWOKERTO

 09/12/21

AMPLIFIKASI
AMPLIFIKASI DNA
DNA

Proses amplifikasi marka RAPD dilakukan dengan teknik PCR (Polymerase chain
reaction) dengan volume total campuran sebanyak 25 μL

0,1 µL Taq DNA polimerase

2,5 µL PCR reaction buffer 10x

1 µL dNTP (5 mM)
Campuran
1 µL masing-masing primer (1mM)
reaksi PCR
yaitu: 1 µL DNA templat
Air ultrapure (dd H2O) sampai volume
akhir mencapai 25 µL

FAKULTAS BIOLOGI UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN PURWOKERTO

 09/12/21

AMPLIFIKASI
AMPLIFIKASI DNA
DNA

Denaturasi awal selama 3 menit pada suhu 94 °C

Denaturasi selama 1 menit pada suhu 94°C

Penempelan primer (annealing) pada suhu 40°C 35 siklus

selama 2 menit ulangan

Tahap pemanjangan (elongation) pada suhu 72°C

selama 1 menit

Tahap pemanjangan akhir (final extension) dilakukan

selama 5 menit pada suhu 72 °C

FAKULTAS BIOLOGI UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN PURWOKERTO

 09/12/21

VISUALISASI
VISUALISASI DNA
DNA

Produk PCR dimigrasikan dalam elektroforesis gel agarosa

1,2 % dan diwarnai dengan cara merendamnya dalam
larutan etidium bromida

Diletakkan di atas lampu UV transilluminator

Divisualisasikan dan didokumentasikan

Produk hasil amplifikasi dianalisis www.huntercole.org

FAKULTAS BIOLOGI UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN PURWOKERTO

 09/12/21

METODE ANALISIS

Penentuan primer terseleksi deskriptif

Penentuan besarnya nilai amova (analysis of

keanekaragaman genetik molecular variances)

Perhitungan dilakukan dengan bantuan software arlequin versi 2.0

FAKULTAS BIOLOGI UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN PURWOKERTO

 09/12/21

III. JADWAL PENELITIAN

Bulan
No Kegiatan
I II III IV V VI
1 Penyusunan dan  
         
pengajuan proposal
2 Seminar proposal            
3  
Pelaksanaan penelitian
a.pengambilan sampel
b.isolasi DNA genom          
c.amplifikasi marka RAPD
d.visualisasi marka RAPD

4 Analisis dan pengolahan  

         
data
5  
Penyusunan skripsi dan
         
Seminar Hasil Penelitian

FAKULTAS BIOLOGI UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN PURWOKERTO

 09/12/21

Terima kasih

FAKULTAS BIOLOGI UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN PURWOKERTO