au? PENELITIAN BIOTEKNOLOGI REKAYASA GENETIKA DAN yf. PENDAYAGUNAAN PLASMA NUTFAH (TU 01.03) (ANALISA GENOM TANAMAN ETI MENGGUNAKAN TEKNIK RAPD DAN ISOENZIM) Puspita Lisdiyanti,.N. Sri Hartati, Amy Estiati dan Eddy Jusuf ABSTRAK Analisa genom tanaman HTI telah dilakukan dengan menggunakan teknik RAPD dan isoenzim. Kedua teknik ini dapat digunakan untuk analisa varia- si genetike tanaman. Komoditi HTZ yang digunakan dalem teknik RAPD adalah 7 nomor koleksi Acacia mangium dan 5 nomor koleksi Paraserianthes © falcataria, wasing-masing merupakan pohon seleksi hasil eksplorasi Pembakuan teknik isolasi genom DNA dan optimasi kondisi dan reakei PCR telah didapat. Penggunaan deun sebagai bahan yang divji, lebih baik Gibandingkan dengan biji ditinjau dari segi keragaman pola pita yang terjadi. | Komoditi HTI yang digunakan dalam teknik isoenzim adalah Pometia pinata dan Acacia mangium. Sistem elektroforesis yang digunakan adalah SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate-Poly Acrylamide Gel Blectro- phoresis) dan 3 sistem pewarnaan enzim yang digunakan adalah Peroksi- dase, Esterase, Asam fosfatase. Penelitian isoenzim dengan material dari aun dan biji menunjukken bahwa material dari daun muda lebih terlihat variasi keragamen penampakan pola pita. Penampilen pola pita isoenzim peroksidase A. mangium dipengaruhi oleh organ tanaman yang Gigunaken den oleh umur tanaman. Disimpulkan juga bahwa volume contoh dan umur tana- man mempengaruhi pola pita yeng muncul. PENDAHULUAN Salah satu kendala dalam perbaikan mutu tanaman adalah terbatasnya koleksi plasma rutfah dan informasi genetik tanaman. Kelemahan dari segi keterbatasan plasma nutfah dapat diatasi dengan cara menggiatkan aktifitas konservasi dan membangun kebun-kebun koleksi secara terarah. Sedangkan kelemahan dari segi ketersediaan informasi genetik dapat dibenahi melalui studi-studi genetik pada plasma nutfah yang telah ada. Terdapat beberapa pendekatan untuk studi genetik pada tanaman, antara lain berdasarkan analasis karakter morfologi-agronomi dan analisis pola pita isoenzim (isozim).RAPD (Random Amplification Polimorphisme DNA) pertama kali dikembangkan secara bersamaan dalam laboratorium yang terpisah oleh Williams (1990) dan Welsh and Mc. Clelland (1990). Teknik RAPD merupakan pengembangan teknik dari RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisme). Teknik RAPD membutuhkan alat PCR dan hanya dibutuhkan satu primer acak dengan urutan basa yang tidak terlalu panjang (9-10 basa) untuk mengamplifikasi DNA template. Prinsip kerja RAPD adalah primer tunggal yang acak dan pendek akan menempel pada beberapa lokus yang berbeda didalam genom tanaman dan mengamplifikasi DNA. Cara kerja RAPD adalah mudah, cepat dan hanya membutuhkan jumlah DNA yang sedikit. Dalam perkembangannya RAPD telah banyak diaplikasikan oleh para peneliti. Sebagai contohnya, RAPD telah berhasil Gigunakan untuk konstruksi peta genetika dari tanaman seper- ti Arabidobsis thaliana seperti dilaporkan oleh Reiter (1992). duga dengan teknik ini Martin (1991) berhasil memil- ih 2 galur tomat yang berbeda dalam ada dan tidak adanya gen pto pengkode gen yang resisten tanaman pada Pseudomonas dengan menggunakan 144 primer acak. Michelmore (1991) meng- gunakan RAPD untuk mendeteksi lokus Dm5/@ pada letas. RAPD juga dapat digunakan untuk studi identifikasi ataupun takso- nomi tanaman. Arnold (1991) berhasil mengidentifikasikan tanaman hias Iris serta hibridanya. Dan Wilde (1992) dapat mengidentifikasi sumber plasma nutfah dari kakao dengan menggunakan teknik ini. Pada penelitian yang dikemukakan disini, RAPD dapat @igunakan untuk analisa variasi genetika dari 2 tanaman kehutanan yaitu, A. mangium dan P. falcataria. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui variasi genetika tanaman kehutanan dari berbagai propinsi hasil eksplorasi. Informasi ini diharapkan dapat digunakan untuk studi popula- si genetika dari tanaman tersebut diatas. ‘Secara singkat Stebbins 2989) mendefinisikan isoenzim sebagai ragam yang berbeda dari enzim yang sama dan mempu- 33nyai fungsi yang identik atau serupa serta muncul pada indi- vidu yang sama. Penggunaan isoenzim sebagai penanda genetik pada tanaman, mulai berkembang sejak penemuan pertama kali oleh Hunter dan Market pada tahun 1957. Penggunaan isoenzim sebagai penanda. genetik mempunyai banyak keuntungan antara lain alel-alel resesif dari gen penentu karakter tertentu, yang umumnya tertutup alel dominan dalam penampilan visual, dapat teramati (Moore dan Collins, 1983). Sejumlah lokus iscenzim juga dapat diamati dengan jelas, demikian pula identifikasi dapat dilakukan pada organ yang berbeda, mis- alnya akar, daun atau biji (Simpson dan Withers, 1986). Selain itu karena isoenzim merupakan produk langsung dari gen, maka perannya sebagai penciri genetik suatu individu relatif tidak dipengaruhi oleh lingku-ngan (Moore dan Col- lins, 1983). Berdasarkan hal diatas maka teknik elektroforesis isoen- zim telah diterapkan pada tanaman HTI. Tujuan daripada penelitian ini adalah menetapkan metoda elektroforesis untuk mendapatkan pola pita isoenzim yang baik serta membuat Geskriptor khususnya untuk koleksi Acacia mangium berda- sarkan pola pita yang dihasilkan melalui elektroforesis Diharapkan melalui penelitian ini diperoleh suatu metoda elektroforesis yang tepat untuk memisahkan isoenzim gari keempat jenis tanaman HTI, khususnya A. mangium serta informasi dasar mengenai gambaran setiap populasi A. mangium yang diuji sehingga dapat digunakan sebagai salah salu landasan dalam pemuliaan lebih lanjut populasi tersebut. BAHAN DAN CARA KERJA Material tanaman. Material tanaman yang digunakan untuk penelitian adalah 7 nomor Acacia mangium asal Subanjeriji, Jawa Timur, Arga- makmur BRL, Jawa Barat, Kalimantan Barat, Cibinong dan 34Hibrida A. mangium dan A. auriculiformis asal BIOTROP dan 5 nomor P. falcataria asal Jawa Barat, Cibinong, Bogor, Jawa tengah dan Jawa Timur. Bahan yang diperlukan berupa organ tanaman dan bahan kimia Organ tanaman yang digunakan berupa biji dan daun sedangkan bahan kimia berupa akril amida, bis akril amida, trisma basa, TEMED, amonium persulfat, sodium dodesil sulfat, glisin, sukrosa, bromo phenol blue, gliserol, Tween 80, polivinil pirolidon, dithiothreitol, natrium asetat, kalsium klorida, peroksida, 3 amino 9 ethil carbazolum, aseton, natrium posfat, 1- naftil asetat, 2- naftil asetat, fast garnet GBC Salt, etanol dan akuades. Isolasi genom DNA tanaman Acacia. Genom DNA diekstrak dari daun muda mengikuti metoda Murray and Thompson (1980) dengan modifikasi. 0,2 g pucuk daun Acacia digerus dalam keadaan dingin dan cepat. Kemudian ditambah 1 ml bufer pengekstraksi (100 mM Tris.HCl pH 8,0, 1,4 M NaCl, 20 mM EDTA, 2% (w/v) CTAB, 2% (v/v) mercaptoeta- nol) yang telah dipanaskan terlebih dahulu pada suhu 60°C. Masukkan 0,5 ml campuran ke dalam ependorf tube, inkubasi pada 60°C dengan sekali-sekali dikocok perlahan sampai terlihat gerusan daun menjadi kental. Tambahkan 0,5 ml kloroform:isoamil alkohol = 24:1, kocok dengan keras untuk menghilangkan protein dan kotoran-kotoran daun. Proses ini sebaiknya dilakukan di ruang asam karena kloroform selain berbau juga jika dikocok keras-keras akan mudah meletup. Sentrifugasi selama 5 menit 5000 rpm dalam suhu ruang. Pisahkan larutan jernih pada bagian atas tube dengan hati- hati agar bagian bawah tidak terambil. Hitung banyaknya volume yang terambil, tambahkan 2 volume bufer presipitasi (50MM Tris.HCl pH8,0, 10mM EDTA, 1% (w/v) CTAB). Diamkan selama 15 menit dalam suhu ruang. Sentrifugasi 5000 rpm selama 10 menit. Buang supernatan, larutkan endapan dengan 0,5ml 1.5M NaCl dan inkubasi pada 60°C sampai endapan ter- 35larutkan. Selama proses inkubasi tengah berlangsung tambah- kan 10 mg/ml RNase sebanyak 5y1. Kemudian tambahkan 1 ml 96% etanol, sentrifugasi 5000 rpm selama 10 menit, ambil endapan dan cuci endapan dengan 70% etanol. Keringkan endapan dan darutkan dengan 50u1 bufer TE (10mM Tris.HCl pH 8,0, imM EDTA) Primer. 1 buah primer dari Operon Technology sepanjang 10 basa, yang digunakan untuk penelitian adalah OPH-04 (5'- AGTCGTCCCC-3'). PCR. Kondisi optimum PCR adalah dengan komposisi reaksi PCR volume total 2541 adalah 20mM Tris.HCl pH 8,4, 50mM KCL, 0,2uM Primer, 100mM GNTP. 1U Tag polimer- ase (GIBCO, BRL), SmM MgCl2, 20ng DNA. Reaksi amplifikasi PCR adalah 94°C selama 1 menit, 36°C selama 1 menit, 72°C selama 2 menit, sebanyak 45 siklus. Elektroforesis. 251 dari produk PCR dielektroforesis pada agarose gel 2% dengan ix bufer TBE (89mM Tris, 89mM asam borat dan 2mM EDTA. Gel diwarnai dengan Etidium bromida kemudian difoto @ibawah sinar UV. Peralatan yang digunakan adalah perangkat peralatan Pharma- cia Vertical Gel Electroforesis System serta peralatan gelas Analisis isoenzim daun matoa Bahan tanaman berupa daun muda matoa koleksi Puslitbang Bioteknologi LIPI Cibinong asal Seram (3 tanaman) dan Suka- sari (1 tanaman). Konsentrasi gel yang digunakan 7,5% dan 12,6% dengan sistem pewarnaan enzim peroksidase, esterase dan posfatase asam. 36Analisis enzim biji A. mangium Bahan berupa biji koleksi Puslitbang Bioteknologi LIPI Cibinong asal Riau (6 nomor), Bengkulu (6 nomor), Seram (5 nomor) dan Yogyakarta (6 nomor). Konsentrasi gel adalah 7,5% dengan sistem pewarnaan enzim peroksidase. Analisis isoenzim daun A. mangium Bahan tanaman berupa daun muda A. mangium koleksi Puslit- bang Bioteknologi LIPI Cibinong asal Bengkulu, Cibinong, Kalimantan Barat dan Yogyakarta masing-masing 10 individu dari satu tanaman. Konsentrasi gel 7,5% dengan sistem pewar- naan enzim peroksidase. Pengaruh umur tanaman A. mangium terhadap penampilan pola pita Bahan tanaman berupa daun muda A, mangium koleksi Puslit- bang Bioteknologi LIPI Cibinong asal Sintang ( umur 4 bulan, 7 bulan dan 6 tahun ). Konsentrasi gel 7,5 % dengan sistem pewarnaan peroksidase. SDS-PAGE Metoda elektroforesis dan pembuatan gel mengacu pada baemli (1970) seperti yang tertera pada buku manual perala- tan elektroforesis Pharmacia. Volume sampel yang digunakan adalah 10 yl. Sistem pewarnaan enzim peroksidase Komposisi bahan yang digunakan: -50 wM bufer natrium asetat pH 5,0 100 m1 -Kalsium klorida 50 mg -3% Peroksida 0,5 mL -3 amino 9 ethyl carbazolum 50 mg -Aseton 5 ml Cara pewarnaan adalah dengan menuangkan larutan pewarna pada gel poliakril amida yang telah dielektroforesis. 37Kemudian disimpan pada suhu ruang selama 15 menit. Larutan pewarna dibuang dan gel dicuci dengan akuades. 50% etanol dituang pada gel untuk fiksasi. Gel direndam paling sedikit selama 4 jam. Semua pekerjaan dilakukan selalu dalam kondisi tertutup. Sistem pewarnaan enzim esterase Komposisi bahan yang diperlukan: Larutan A -10 mM natrium posfat pH 7 50 ml -1 naftil asetat 50 mg -2 naftil asetat 50 mg ~Aseton 4 mi Larutan B -10 mM natrium asetat pH 7 50 ml -Fast garnet GBC Salt 100 mg Cara pewarnaan adalah dengan menuangkan larutan A kepada gel yang telah dielektroforesis serta didiamkan selama 10 menit pada suhu 37°C. Tambahkan larutan B dan diamkan selam 30 menit dlam suhu 379 C. Larutan pewarna dibuang dan gel dicuci dengan akuades. 50% etanol dituang pada gel untuk fiksasi. Gel direndam paling sedikit selama 4 jam. Semua pekerjaan dilakukan selalu dalam kondisis tertutup. Sistem pewarnaan Posfatase asam Komposisi bahan yang digunakan: -50 mM bufer natrium asetat pH 5 100 mi -a-naphtyl acid posphate Na 50 mg -MgC12. 6H20 100 mg -Fast garnet GBC salt 100 mg 4m - Aseton cara pewarnaan adalah dengan menuangkan larutan pewarna kedalam gel yang telah dielektroforesis dan diamkam selama 120 menit pada suhu 37° Cc. Larutan pewarna dibuang dan gel Gicuci dengan akuades. 50% etanol dituang pada gel untuk 38fiksasi. Gel direndam paling sedikit selama 4 jam. Semua pekerjaan dilakukan selalu dalam kondisi tertutup. Metoda pewarnaan ketiga sistem enzim di atas mengacu pada Seido (1983). HASIL DAN PEMBAHASAN RAPD (random Amplified Polymorphic DNA) adalah suatu teknik yang dapat digunakan untuk investigasi variasi gene- tika di alam yang berguna untuk studi populasi genetika suatu tanaman. Pada penelitian ini telah dilakukan analisa genom dari 2 tanaman kehutanan yaitu A. mangium sebanyak 7 nomor dan P, falcataria sebanyak 5 nomor dengan menggunakan teknik RAPD. Material-material tanaman ini merupakan pohon seleksi hasil eksplorasi staf Puslitbang Bioteknologi LIPI- Cibinong. Kriteria dari pada pohon seleksi adalah jika pada suatu lahan seluas paling sedikit 100m2 terdapat sekumpulan pohon komediti yang dimaksud, dipilih satu pohon yang dia- nggap unggul dari segi penampilannya. Pada penelitian RAPD pertama-tama diisolasi genom DNA dari sampel daun muda sebanyak 0,2g. Cara isolasi mengguna- kan senyawa CTAB yang bersifat dapat mengikat molekul-mole- kul DNA yang berbobot molekul tinggi. Kemudian di akhir step isolasi, setelah endapan DNA dilarutkan dalam bufer TE, Gilakukan sekali lagi ekstraksi dengan kloroforn : isoami- alkohol dilanjutkan dengan presipitasi etanol sehingga didapat DNA yang cukup bersih. Primer tunggal yang dipilih secara acak dengan urutan basa 5'-AGTCGTCCCC-3' digunakan dalam reaksi PCR. Optimasi reaksi PCR telah didapat (lihat Bahan dan Cara Kerja) dengan menambahkan 5mM MgC12. Hasil penelitian untuk kedua komoditi tanaman tersebut dapat dilihat pada gambar 1 dan gambar 2). 39Lane : 1. Subanjeriji 2. Jawa Timur 3. Argamakmur BRL . Jawa Barat Kalimantan Barat Hibrida Cibinong | zoos Lit It Gambar 1. RAPD dari 7 nomor A. mangium dengan menggunakan primer OPH-04. Lane : 1. Jawa Barat 2. Cibonong 3. Bogor 4. Jawa Tengah 5. Jawa Timur Gambar 2. RAPD dari 5 nomor P. falcataria dengan menggunaken primer OPH-04. Untuk dapat mengetahui keragaman genetika tanaman dengan RAPD sebenarnya diperlukan primer yang lebih dari satu macam. Satu primer saja kurang untuk bisa menyimpulkan keragaman atau ketidak ragaman™suatu tanaman. Penelitian di atas lebih ditekankan sebagai langkah awal untuk mengetahui 40optimasi reaksi dan kondisi PCR yang diperlukan dan pemba- kuan teknik RAPD. Tetapi disamping itu pula telah dapat diperlihatkan variasi pola pita dari nompr-nomor koleksi yang digunakan. Dilihat dari foto elektroforesis hasil PCR dengan primer OPH-04 dapat diketahui bahwa pada 7 nomor tanaman A. mangium terdapat 3 macam keragaman pola pita. Koleksi asal Subanjeriji dan Jawa Timur menunjukkan polimorfisme. Koleksi asal Argamakmur BRL, Jawa Barat dan Kalimantan Barat juga menunjukkan polimorfisme. Koleksi asal Cibinong tidak terli- hat pita yang jelas, tetapi cenderung mempunyai pola pita yang sama dengan kelompok pola pita yang kedua. Dan pola pita dari hibrida a. mangium dan a. auriculiformis asal BIOTROP menunjukkan pola pita yang berlainan dengan kelompok sebelumya. Diharapkan jika dilakukan RAPD dari induk tana- man hibrida ini dapat membedakan keturunan dari tanaman hibrida ini. Lima koleksi P. falcataria asal Jawa Barat, Cibinong, Bogor, Jawa tengah dan Jawa Timur setelah dilakukan RAPD dengan menggunakan primer OPH-04 semuanya terlihat polimor- fisme. Tidak terlihat adanya keragaman pada komoditi tanaman ini. Analisis isoenzim daun matoa Dari pengamatan yang dilakukan pada empat individu tanaman matoa dengan menggunakan sistem enzim peroksidase, esterase dan posfatase asam diperoleh hasil bahwa penampakan pita pada konsentrasi gel 12,6% lebih jelas dibandingkan dengan konsentrasi gel 7.5%. Hal ini disebabkan karena dengan semakin besarnya konsentrasi gel maka pori-pori gel akan semakin kecil. Dengan berubahnya pori-pori gel maka kecepatan migrasi dari pada isoenzim akan berubah. Dengan demikian lokasi pita isoenzim maupun intensitas warna dari pada pita yang tampak pada zymBgram akan berubah pula. Dari keempat individu tanaman yang dicoba dengan menggunakan 41sistem enzim peroksidase, esterase @iperoleh 3 pola pita dan posfatase asam, Sampel nomor 1 memiliki pola pita yang sama dengan sampel nomor 4 (Gambar 1). Ganbar 1.Pola pita isoenzim peroksidase, esterase dan posfatase asam dari tanaman matoa Analisis isoenzim biji A. mangium Dari analisis terhadap 23 nomor koleksi, pola pita yaitu pola 1,2, di 2 wilayah diperoleh & 3,4,5,6,7 dan 8 yang terbagi menja- Seluruh nomor koleksi tersebut dikelompokkan 42berdasarkan pola pita seperti yang tampak pada gambar 2. Pola 1 : No. 21, 23, 24, 25, 57, 62 dan 127 Pola 2 : No. 26, 27 dan 60 Pola 3 : No. 2,3,6 Pola 4 : No. 4,19 Pola 5 : No. 61 Pola 6 : No. 126 Pola 7: No. 1, 1A,5 Pola 8 : No. 41, 46, 50 2 4 26 Bengkyly Jawa Gambar 2. Pola pita isoenzim peroksidase biji A. mangium Analisis isoenzim daun A. mangium 43Dari analisis terhadap 40 nomor koleksi, diperoleh 20 pola pita yang terbagi menjadi 5 wilayah (Gambar 3). Gambar 3. Pola pita isoenzim peroksidase dari daun A. mangium 44Dari zimogram yang diperoleh tampak bahwa percobaan dengan menggunakan sampel daun muda memberikan keragaman pola pita yang lebih tinggi dibandingkan dengan sampel biji.Oleh karena itu untuk analisis selanjutnya digunakan daun muda. Pengaruh umur terhadap penampilan pola pita yang tampak Dari hasil zymogram yang didapat tampak bahwa A. mangi- um asal Sintang yang berumur 4 bulan, 7 bulan, dan 6 tahun memiliki pola pita yang berbeda (Gambar 4). Menurut Simpson dan Withers (1986), perubahan pola pita isoenzim termasuk nadir atau tidak hadirnya pita dipengaruhi oleh tingkat perkembangan tanaman dan organ tanaman yang digunakan. Gambar 4. Pola pita isoenzim peroksidase A.mangium asal sintang umur 4 bulan, 7 bulan dan 6 tahun 45KESIMPULAN Teknik RAPD ini menunjukkan bahwa teknik ini. sangat cocok untuk studi variasi genetika terutama untuk studi populasi genetika suatu tanaman. Telah diketahui cara isolasi genom, reaksi dan kondisi optimun PCR untuk 2 macam tanaman kehutanan yaitu, A. mangium dan P, falcataria. Penampilan pola pita isoenzim peroksidase, esterase dan posfatase asam tanaman matoa dengan konsentrasi gel 12,6%, lebih baik dibandingkan dengan konsentrasi gel 7,5 %. Keragaman pola pita isoenzim peroksidase dari daun muda A. mangium, lebih tinggi dibandingkan dengan mengguna kan biji. Umar dan organ tanaman A. mangium yang digunakan ber- pengaruh terhadap penampilan pola pita isoenzim perok- sidase. DAFTAR PUSTAKA Arnold, M. L., Buchner, C. M., and Robinson, J. J. (1991) Poolen-mediated@ introgression and hybrid speciation in Louisiana irises. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 88 : 1398-1402. 46Martin, G. B., Williams, J. G. K. and Tanksley, S. D. (1991) Rapid identification of markers linked to Pseudomonas resistance gene in tomato by using random primers and isogenic lines. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 88 : 2336-2340. Michelmore, R. W., Paran, I. and Kesseli, R. V. (1991) Identification of markers linked to disease resistance genes by bulk segregant analysis : a rapid method to detect markers in spesific genomic regions using segre- gation populations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 88 : 9826-9832. Moore, G.A. and G.B. Collins. 1983. New challenges confron- tating plant breeders. In §.D. Tanskley and T.J. Orton (eds.). Isozymes in plant genetics and breeding. Part A. Elsevier , Amsterdam. pp 25-28. Murray, M. G. and Thompson, W. F. (1980) Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nuc. Ac. Res., Vol. 8 (19) : 4321-4325. Reiter, R. S., Williams, J., Feldmann, K. A., Rafalski, J. A., Tingey, S. V. and Scolnik, P. A. (1992) Global and local genomic mapping in Arabidobsis thaliana by using recombinant inbred lines and random amplified poly- morphic DNAs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 89 =: 1477-1481. 47Seido, K. 1983. Manual of isozyme analysis. Japan Interna- tional Cooperation Agency (JICA) and Directorate Gener- al of Reforestration And Land Rehabilitation Ministry of Forestry In Indonesia. 34 p. Simpson, M.J.A and L. Withers. 1986. Characterization using isozyme electro- foresis: A guide to the literature. International Board For Plant genetic Resources. 102 p. Stebbins, G.L. 1989. Introduction. In D.B. Soltis and P.S. Soltis (eds). Isozymes in plant biology. Dioscorides Press. Portland, Oregon. pp 1-4. Tingey, S. V. and del Tufo, J. P. (1993) Genetic analysis with Random Amplified Polymorphic DNA Markers. Plant Physiology. 101 : 349-352. Waugh, R. and Powell, W. (1992) Using RAPD markers for crop improvement. Tibtech June (Vol10), 186-191. Welsh, J. and Mc. Clelland, M. (1990) Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic. Acids. Res. 18 : 7213-7218. Wilde, J., Waugh, R. and Powell, W. (1992) Genetic finger printing of Theobroma clones using Randomly Amplified Polymorphic DNA markers. Theor. Appl. Genet. 83 : 871- 877. Williams, J. G. K., Kubelik, A. R., Livak, K. d., Rafalski, J. A., and ingey, $. V. (1990) DNA polymorphisms ampli- fied by arbrirary primers are useful as genetic mark- ers. Nuc. Ac. Res., Vol. 18, No. 22 : 6531-6535. 48