PRAKTIKUM I : Efek Komposisi Media Terhadap Kinetika Pertumbuhan Eschericia coli

A. TUJUAN
Praktikum ini bertujuan agar mahasiswa dapat mempelajari pertumbuhan bakteri dalam
kultur, efek dari pemberian sumber karbon dan medium terhadap pertumbuhan.

B. TINJAUAN PUSTAKA
Setiap organisme membutuhkan semua senyawa yang dibutuhkan untuk memproduksi
energi dan biosintesis seluler yang didapatkan dari lingkungannya. Elemen dan senyawa kimia dari
lingkungan hidup yang digunakan untuk pertumbuhan bakteri dikenal dengan nutrient atau
kebutuhan makanan. Di laboratorium, bacteria tumbuh di media kultur yang didesain untuk
menyediakan semua nutrient essensial dalam larutan untuk pertumbuhan bakteri.
Pada tingkat yang paling dasar, kebutuhan nutrisi bakteri misalnya Escherichia coli
ditunjukkan dari elemen penyusun sel yang terdiri dari C, H, O, N, S. P, K, Mg, Fe, Ca, Mn, juga
sedikit Zn, Co, Cu, dan Mo. Elemen ini dapat ditemukan dalam bentuk air, ion inorganic, molekul
kecil, dan makromolekul yang sesuai antara structural dan fungsionalnya di dalam sel.
Fungsi fisiologis dari elemen-elemen ditunjukkan pada table di bawah ini:
Tabel 1. Elemen utama, sumber dan fungsinya pada sel bakteri

% dari berat
Element Sumber Fungsi
kering
Kompenen organic Penyusun utama dari material
Karbon 50
atau CO2 seluler
Penyususn material sel dan cairan
H2O, komponen
Oksigen 20 sel; O2 merupakan akseptor
organik, CO2, dan O2
electron pada respirasi aerob
Constituent of amino acids,
NH3, NO3, komponen
Nitrogen 14 nucleic acids nucleotides, and
organik, N2
coenzymes
H2O, komponen Penyusun utama komponen
Hidrogen 8
organik, H2 organik dan cairan sel
Penyusun asam nukleat,
inorganic phosphates
Fosfor 3 nukleotida, fosfolipid, LPS, asam
(PO4)
teikoat
SO4, H2S, So,
Penyusun sisteine, methionine,
Sulfur 1 komponen sulfur
glutathione, beberapa coenzymes
organik
Kation inorganic seluler utama
Potassium 1 Garam Potassium
dan kofaktor untuk enzim tertentu
Magnesium 0.5 Garam Magnesium Kation inorganic seluler dan
kofaktor untuk reaksi enzimatik
 tertentu
Kation inorganic seluler, kofaktor
Kalsium 0.5 Garam Kalsium untuk enzim tertentu dan
komponen endospora
Komponen sitokrom dan protein
besi non-heme tertentu dan
Besi 0.2 Garam Besi
kofaktor untuk beberapa reaksi
enzimatik
Trace elements adalah ion metal yang dibutuhkan sel tertentu dalam jumlah kecil yang
sangat sulit ditentukan kadarnya, dan tidak diperlukan untuk ditambahkan pada media kultur seperti
nutrient. Trace elements dibutuhkan dalam jumlah kecil dan sebagai “kontaminan” air atau
komponen penyusun media. Trace elements berperan sebeagi kofaktor untuk reaksi enzimatik
essensial dalam sel. Contoh trace elements adalah Mn, Co, Zn, Cu dan Mo.
Untuk tumbuh di alam atau di laboratorium, bakteri harus mempunyai sumber energi,
sumber karbon dan nutrient lain dan kondisi yang memenuhi syarat seperti konsentrasi O2, suhu dan
pH. Bakteri hidup individu atau berkoloni berdasarkan pertumbuhan di bawah kondisi fisik dan
kimia yang berbeda. Contohnya fototrop merupakan organisme yang menggunakan cahaya sebagai
sumber energi; anaerob merupakan organisme yang tumbuh tanpa oksigen; termofil adalah
organisme yang dapat tumbuh pada suhu yang tinggi.
Sumber Karbon dan Energi untuk Pertumbuhan Bakteri
Semua organisme membutuhkan sumber energi. Organisme yang menggunakan energi
radiant (cahaya) disebut fototrof. Organisme yang menggunakan (oksidasi) komponen organic
disebut heterotrof or kemo(hetero)trof. Organisme yang mengoksidasi komponen inorganic disebut
lithotrof.
Kebutuhan karbon organisme dipenuhi dengan karbon organic (komponen kimia denag
ikatan karbon-hidrogen) atau dengan CO2. Organisme yang menggunakan karbon organic disebut
heterotrof dan organisne yang menggunakan CO2 sebagai sumber karbon disebut autotrof.
Table 2. Nutrisi Utama Tipe Prokariot

Tipe Sumber Energi Sumber Karbon Contoh

Fotoautotrof Cahaya CO2 Cyanobacteria, beberapa
Purple dan Green Bacteria
fotoheterotrof Cahaya Komponen Beberapa Purple dan Green
organik Bacteria
Kemoautotrof atau komponen inorganik, CO2 Sedikit Bacteria and
Lithotrof seperti H2, NH3, NO2, banyak Archaea
(Lithoautotrof) H2S
Kemoheterotrof atau Komponen organik Komponen Hampir semua Bacteria,
Heterotrofs organik beberapa Archaea
(Todar, 2008)
C. ALAT DAN BAHAN
Alat :
a. Labu erlenmeyer
b. Mikro pipet
c. Tabung reaksi
d. Ph meter digital
e. Turbidimeter
Bahan :
a. Inokulum bakteri yang sudah ditumbuhkan semalam pada suhu 37o C dalam shaker
b. Media:
1. M9 minimal + 0.5% Glukosa
2. M9 minimal + 0.5% Glukosa & 0.5% Laktosa
3. M9 minimal + 1% Glukosa
4. M9 minimal + 0.5% Laktosa
5. M9 minimal + 1% Laktosa
c. M9 minimal media (defined media)
Ke dalam 750 mL aquadest tambahkan :
5X garam M9 200 mL
1 M MgSO4 2 mL
20% larutan sumber karbon 20 mL (filtered sterilized)
0,1 M CaCl2 1 mL
Thiamine 0,02% w/v 1 mL (filtered sterilized)
Buat larutan sampai volume akhir 1000 mL
d. 5X garam M9
NH4Cl 5 g/L
Na2HPO4 64 g/L
KH2PO4 15 g/L
NaCl 2,5 g/L
Larutan garam dibuat dalam aliquot 200 mL disterilisasi dalam autoklaf 121 oC selama 15
menit.

D. CARA KERJA
Siapkan dan sterilkan alat dan bahan yang diperlukan

Tambahkan jumlah glukosa(20%) dan laktosa(20%) dalam media kultur (Vakhir = 200 ml)

Inokulasikan E. coli sebanyak 5 ml, ambil sampel pada menit 0, ukur pH

 Ukur OD670 sampel dalam kuvet bundar dengan Turbidimeter

Sampling tiap 20 menit sebanyak 20 ml, ukur OD670, hingga 6 kali pengambilan

Ukur pH nya dengan pHmeter digital pada suhu ruang

Catat dan share data dengan kelompok lain

E. DATA DAN PERHITUNGAN

a. Pengambilan stok untuk media, Stok Glukosa 20 % dan Laktosa 20 %
Menggunakan formula M1 V1 = M2 V2
V1 : Volume Media V2 : Volume Stok yang dibutuhkan
M1 : Konsentrasi dalam media M2 : konsentrasi stok
1. M9 minimal + 0.5% Glukosa
0.5 % x 200 ml = 20 % x V2
V2 = 5 ml
2. M9 minimal + 0.5% Glukosa & 0.5 % Laktosa
0.5 % x 200ml = 20 % x V2
V2 = 5 ml Laktosa dan 5 ml Glukosa
3. M9 minimal + 1 % Glukosa
1 % x 200 ml = 20 % x V2
V2 = 10 ml
4. M9 minimal + 0.5 % Laktosa
0.5 % x 200 ml = 20 % x V2
V2 = 5 ml
5. M9 minimal + 1 % Laktosa
1 % x 200ml = 20 % x V2
V2 = 10 ml
b. Data OD670
t OD670
(menit) 1 2 3 4 5
0’ 21.6 17.1 23.1 22.9 16.1
20’ 19 19.5 16.4 23.8 28.5
40’ 17.1 20.7 24.5 25.3 25
60’ 23.7 27.5 23.6 22.5 33.3
80’ 22.4 23.5 25.9 38.6 43.1
100’ 27.5 27.7 32.9 39.5 43.4
120’ 30.9 24.4 36.2 47.1 44.1

waktu ph media
(t) 1 2 3 4 5
 0' 7.41 7.38 7.40 7.39 7.36
20' 7.41 7.38 7.40 7.39 7.36
40' 7.38 7.39 7.40 7.38 7.35
60' 7.39 7.37 7.38 7.35 7.38
80' 7.39 7.37 7.39 7.36 7.36
100' 7.39 7.37 7.39 7.38 7.35
120' 7.39 7.37 7.38 7.38 7.38

c. Perhitungan jumlah sel

Formula yang digunakan:

N = (OD670 sampel - OD670 blanko) x (1.6 x106)

N = Jumlah sel
1. Data perhitungan jumlah sel (N)
t (menit) 1 2 3 4 5
0’ 34560000 27360000 36960000 36640000 25760000
20’ 30400000 31200000 26240000 38080000 45600000
40’ 27360000 33120000 39200000 40480000 40000000
60’ 37920000 44000000 37760000 36000000 53280000
80’ 35840000 37600000 41440000 61760000 68960000
100’ 44000000 44320000 52640000 63200000 69440000
120’ 49440000 39040000 57920000 75360000 70560000

2. DataPerhitungan Log N
t (menit) 1 2 3 4 5
0’ 7.539 7.437 7.568 7.564 7.411
20’ 7.483 7.494 7.419 7.581 7.659
40’ 7.437 7.520 7.607 7.607 7.602
60’ 7.579 7.643 7.556 7.556 7.727
80’ 7.554 7.575 7.791 7.791 7.839
100’ 7.643 7.647 7.801 7.801 7.842
120’ 7.694 7.592 7.877 7.877 7.849

3. Kurva logaritmik pertumbuhan mikroba (Log N) vs (waktu)

Kurva kelompok 1

Kurva kelompok 2

Kurva kelompok 3
 Kurva kelompok 4

Kurva kelompok 5
Berdasarkan data-data di atas, dapat dilakukan perhitungan laju pertumbuhan spesifik (μ)
dan doubling time (tg).

d. Laju pertumbuhan spesifik (μ)

Laju pertumbuhan spesifik mikroba dapat diperhitungkan dengan menggunakan formula

μ = (2.303 (Log N – Log No)) / (t-to)

μ : Laju pertumbuhan spesifik ( /menit)

N : jumlah sel setelah waktu tertentu
No : jumlah sel saat menit 0
to : waktu awal
t : waktu yang dihitung
 t (menit) 1 2 3 4 5
0’ - - - - -
20’ -0.0064 0.0066 -0.0172 0.0020 0.0286
40’ -0.0059 0.0048 0.0022 0.0025 0.0110
60’ 0.0015 0.0079 -0.0005 -0.0003 0.0121
80’ 0.0004 0.0040 0.0064 0.0065 0.0123
100’ 0.0024 0.0048 0.0054 0.0055 0.0099
120’ 0.0030 0.0030 0.0060 0.0060 0.0084

e. Perhitungan Doubling time (tg)

Doubling time dapat dihitung dengan menggunakan formula
tg = 0.693 / μ

tg = Doubling time (menit)

μ = konstanta kecepatan pertumbuhan spesifik ( /menit)

t (menit) 1 2 3 4 5
0’ - - - - -
20’ -108.2813 105 -40.2907 346.5 24.2308
40’ -117.4576 144.375 315 277.2 63
60’ 462 87.7215 -1386 -2310 57.2727
80’ 1732.5 173.25 108.2813 106.6154 56.3415
100’ 288.0844 144.375 128.3333 126 70
120’ 231 231 115.5 115.5 82.5

F. PEMBAHASAN
 Percobaan kali ini bertujuan untuk mempelajari pertumbuhan bakteri dalam suatu kultur,
efek dari pemberian sumber karbon dan medium terhadap pertumbuhan. Bakteri yang digunakan
dalam percobaan ini yaitu Escherichia coli. E. coli merupakan jenis bakteri yang termasuk dalam
enterobakteri karena E. coli hidup di dalam usus manusia dan hewan.
Bakteri memiliki kemampuan untuk menggandakan diri secara eksponensial dikarenakan
sistem reproduksinya adalah pembelahan biner melintang, dimana tidap sel membelah diri menjadi
dua sel. Selang waktiu yang dibutuhkan sel untuk membelah diri disebut dengan waktu generasi.
Tiap spesies bakteri memiliki waktu generasi yang berbeda-beda, seperti Escherichia coli, bakteri
umum yang dijumpai di saluran pencernaan dan di tempat lain, memiliki waktu generasi 15-20
menit. Hal ini artinya bakteri E. coli dalam waktu 15-20 menit mampu menggandakan selnya
menjadi dua kali lipat.
Apabila satu bakteri tunggal (seperti E. coli di atas) diinokulasikan pada suatu medium dan
memperbanyak diri dengan laju yang konstan/tetap, maka pada suatu waktu pertumbuhannya akan
berhenti dikarenakan sokongan nutrisi pada lingkungan sudah tidak memadai lagi, sehingga
akhirnya terjadi kemerosotan jumlah sel akibat banyak sel yang sudah tidak mendapatkan nutrisi
lagi. Hingga akhirnya pada titik ekstrim menyebabkan terjadinya kematian total bakteri. Kejadian di
atas apabila digambarkan dalam bentuk kurva adalah sebagaimana di bawah.

             Gambar 4 : Kurva Pertumbuhan Bakteri

Kurva di atas disebut sebagai kurva pertumbuhan bakteri. Ada enam fase pada pertumbuhan bakteri
sebagaimana tampak pada kurva, yaitu :

1. Fase adaptasi
Pada awal ditempatkan di suatu medium, bakteri akan membutuhkan waktu untuk
menyesuaikan diri dengan lingkungannya. Faktor-faktor yang mempengaruhi fase ini adalah
medium dan lingkungan pertumbuhan. Semakin mirip dengan keadaan sebelumnya, waktu
adaptasinya akan semakin singkat. Selain itu yang mempengaruhi adalah jumlah inokulumnya.
Sel dalam jumlah besar akan dapat beradaptasi lebih cepat.
2. Fase lag
Tidak ada pertumbuhan populasi karena sel mengalami perubahan komposisi kimiawi dan
ukuran serta bertambahnya substansi intraseluler sehingga siap untuk membelah diri.
3. Fase logaritma atau eksponensial
 Mikroba pada fase ini membela diri dengan laju yang konstan, massa menjadi dua kali lipat
sehingga membutuhkan energi yang besar dan keadaan pertumbuhan seimbang. Pada fase ini
kultur paling sensitif dengan keadaan lingkungan.
4. Fase perlambatan
Pada fase ini pertumbuhan mikroba melambat yang disebabkan oleh nutrien yang tersedia
semakin menipis dan terjadinya penumpukan racun akibat metabolisme sel, akibatnya terjadi
kompetisi nutrisi sehingga beberapa sel mati
5. Fase tetap (stationary)
Pada fase ini walaupun beberapa sel telah mati akibat kompetisi nutrisi, tetapi terdapat sel
yang masih dapat tumbuh. Sehingga jumlah sel menjadi konstan
6. Fase kematian
Sel menjadi mati akibat penumpukan racun dan habisnya nutrisi, menyebabkan jumlah sel
yang mati lebih banyak sehingga mengalami penurunan jumlah sel secara eksponensial.

Pengetahuan akan kurva pertumbuhan bakteri sangat penting untuk menggambarkan

karakteristik pertumbuhan bakteri, sehingga akan mempermudah di dalam kultivasi
(menumbuhkan) bakteri ke dalam suatu media, penyimpanan kultivasi dan penggantian media
(Rachdi, 2006).
Pertumbuhan mikroba dapat merupakan suatu rangkaian reaksi kimia yang mengendalikan
sintesis penyusun biomassa yang diperoleh pada akhir kultur secara global. Proses ini mengikuti
prinsip kekekalan massa. Oleh karena itu, pertumbuhan mikroba dapat dinyatakan dalam reaksi
kimia sebagai berikut :
Substrat mikroba + produk
Sumber karbon metabolit
Nitrogen CO2
Oksigen H2O
Fosfor enzim
Belerang
Mineral
Berdasarkan reaksi di atas terjadi suatu pemecahan substrat oleh mikroba untuk
menghasilkan produk yang berguna untuk proses pertumbuhannya. Substrat akan dipecah menjadi
molekul – molekul yang lebih kecil dan proses ini memerlukan bantuan suatu enzim tertentu,
misalnya hidrolisis pati menjadi glukosa yang dikatalisis oeh enzim amilase. Pada medium yang
mengandung lebih dari satu macam substrat, mikroba mampu memproduksi semua enzim yang
diperlukan untuk mencerna berbagai substrat tersebut. Tetapi sel mikroba hanya akan memproduksi
enzim yang diperlukan untuk mencerna substrat yang lebih sesuai atau lebih disukai terlebih dahulu,
yang biasanya adalah glukosa. Substrat yang lebih disukai ini disebut substrat primer. Jika substrat
primer dalam medium tidak tersedia lagi, mikroba akan mensintesa enzim yang diperlukan untuk
mencerna substrat sekunder.
Selama perang dunia kedua, Monod menguji efek kombinasi obat sebagai sumber nutrient
untuk E. coli. Dia menemukan bahwa pertumbuhan bakteri dengan dua gula yang berbeda sering
menunjukkan dua fase pertumbuhan. Contoh, jika glukosa dan laktosa tersedia, glukosa akan
dimetabolisme pertama kali (fase pertumbuhan I, liat gambar) baru kemudian laktosa (fase
pertumbuhan II. Fenomena ini disebut ‘diauksik’ (Anonim, 2009)

Gambar: Kurva pertumbuhan diauksik

Pada percoabaan ini E. coli dikultur pada lima macam media yang berbeda yaitu :
1. M9 minimal + 0.5% glukosa
2. M9 minimal + 0.5% glukosa dan 0.5% laktosa
3. M9 minimal + 1% glukosa
4. M9 minimal + 0.5% laktosa
5. M9 minimal + 1% laktosa
Setelah bakteri dikultur kemudian dihitung jumlah bakteri yang ada dalam kultur tersebut.
Cara menghitung jumlah sel dalam kultur dapat dilakukan dengan beberapa metode, yaitu:
A. Pengukuran jumlah sel
 Perhitungan mikroskopis langsung (hemositometer).
 Perhitungan cawan (menghitung hanya jumlah sel yang hidup saja).
 Perhitungan sel secara otomatis.
B. Pengukuran massa sel
o Pengukuran berat kering.
o Kekeruhan.
o Volume sel yang dipadatkan.
C. Pendugaan massa sel secara tidak langsung
 Pengukuran konsumsi nutrien.
 Pengukuran komponen sel.
 Pengukuran produk yang terbentuk.
 Pengukuran panas yang terbentuk.
 Perubahan viscositas.
Pada perecobaan kali ini digunakan metode pengukuran massa sel dengan cara mengukur
kekeruhan media kultur. Metode ini merupakan metode yang paling banyak digunakan untuk
perhitungan pertumbuhan bakteri atau khamir. Dimana OD (optical density) berbanding lurus
dengan konsentrasi sel. OD merupakan fungsi negatif dari log % transmitan (T).
OD = - log % T
OD = - log (T/100)
= log 200 – log T
 = 2 – log T
Pengukuran kekeruhan biasanya dilakukan pada  anatara 600 – 700 nm (biasanya 660 nm).
Satu unit absorbans yang diukur pada  antara 600 – 700 nm setara dengan 1.5 g/L berat kering sel.
Dengan perbandingan tersebut dapat diketahui berat kering sel yang ada.
Dari hasil pembacaan absorbans tersebut didapatkan harga OD dalam satuan NFU
(Nephelometer Turbidity Unit), dimana 1 NFU = 1.6 x 106 CFU (Colony Forming Unit). Sehingga
dari pengukuran turbiditas media kultur ini akan dapat diketahui jumlah sel dalam kultur setiap
waktu pengamatan.
Media 3 adalah media M9 yang ditambahkan dengan 1% glukosa. Glukosa merupakan sumber
karbon organik untuk pertumbuhan E.coli. Sedangkan media 1 adalah media M9 yang ditambahkan
dengan 0,5% glukosa. Glukosa merupakan sumber karbon organik untuk pertumbuhan E.coli.
Secara teoritis konsentrasi gula yang berbeda memberikan laju pertumbuhan yang berbeda.
Konsentrasi glukosa yang tinggi akan memberikan sumber karbon yang lebih besar untuk
pertumbuhan bakteri E.coli sehingga diperoleh laju kecepatan pertumbuhan yang lebih tinggi.
Pada media 2 terdapat penggunaan dua sumber karbon yaitu glukosa dan laktosa dalam
suatu media pertumbuhan akan memberikan kurva pertumbuhan yang bifase (diaxie), dimana akan
terjadi dua kali fase logaritmik. Hal ini berbeda jika dalam media hanya digunakan glukosa atau
laktosa saja sebagai sumber karbon. Escherichia coli akan tumbuh lebih cepat dalam waktu singkat
dan maksimal pada media yang mengandung glukosa dibanding laktosa. Tetapi pada media yang
mengandung laktosa (seperti pada media 5 dan 4) pertumbuhan Escherichia coli berlangsung
dalam waktu yang lebih panjang.
Dari data dan perhitungan laju pertumbuhan spesifik, doubling time, dan kurva
pertumbuhannya, dapat dilihat bahwa pada media 5 yang ditambahkan 1% laktosa memiliki
doubling time dan laju pertumbuhan spesifik paling besar. Hal ini berbanding terbalik dengan
teoritisnya dimana pertumbuhan E.coli dengan media laktosa akan tumbuh dalam waktu yng lebih
lama.
Dari hasil percobaan juga diperoleh OD yang naik turun. Hal ini mungkin disebabkan oleh
pengesetan alat turbidimeter yang tidak tepat yaitu pengesetan rentang sensitivitas, sehingga nilai
yang kecil tisak terbaca tepat. Hal ini baru diketahui di akhir praktikum sehingga tidak dapat
dilakukan pengulangan karena masalah waktu.
Pada akhir percobaan juga dilakukan pengukuran pH media. Dari hasil pengukuran
didapatkan hasil bahwa pH media mengalami perubahan menjadi lebih asam walau hanya sedikit
perubahan. Hal ini sesui dari teori yang ada. Karena adanya produk–produk metabolisme dari sel
yang diekskresikan keluar sel ke dalam medium, misalnya asam laktat ataupun etanol.

G. KESIMPULAN
1. Pemberian sumber karbon yang berbeda pada media mempengaruhi laju
pertumbuhan sel bakteri, hal ini terkait keberadaan enzim pemetabolisme sumber karbon
tersebut untuk dikonversi ke bentuk energi.
2. Pemberian sumber karbon yang berbeda menyebabkan terjadinya dua kali fase
pertumbuhan.
3. Dari hasil percobaan diperoleh media 5 (1% laktosa) memiliki laju pertumbuhan
yang tinggi, hal ini tidak sesuai teori dimana pada media 3 (1% glukosa) seharusnya memiliki
laju pertumbuhan yang paling tinggi

H. DAFTAR PUSTAKA

Fardiaz, S., 1987, Fisiologi Fermentasi, Pusat Antar Universitas Institut Pertanian Bogor, Bogor.
Hill, Mc Graw. 1961. Fundamental Principle of Bacteriology. Book Company, Inc, New York.
Huge, W.B., 1987, Pharmaceutical Microbiology, 4th edition, Blackwell Scientific Publications,
London
Rachman, A., 1989, Pengantar Teknologi Fermentasi, Departemen Pendidikan dan Kebudayaan
Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi Institut
Pertanian Bogor, Bogor.
Sa’id, Gumbira E., 1987,Bioindustri, Penerapan Teknologi Fermentasi, PT. Mediyatama Sarana
Perkasa, Jakarta