Anda di halaman 1dari 6

Akta Kimindo Vol. 1 No.

2 April 2006: 99-104 AKTA KIMIA


INDONESIA

Model Fermentasi Lovastatin*

Tigor Nauli**1 dan Linar Z. Udin2

1Pusat Penelitian Informatika - LIPI, Jalan Cisitu, Bandung 40135


2Pusat Penelitian Kimia - LIPI, Jalan Cisitu, Bandung 40135

ABSTRAK
Lovastatin adalah suatu ‘pro-drug’, yang memiliki arti penting secara medis sebagai zat penurun
kadar kolesterol darah dan diindikasikan berguna untuk mengurangi resiko arteriosklerosis. Biosintesis
lovastatin dapat dilakukan melalui fermentasi cair terhadap jamur Aspergillus terreus dengan tersedianya
sumber karbon yang cukup dan kondisi proses yang terjaga pada agitasi 150 rpm dan suhu 28 oC. Produk
dipanen setelah 6 hari fermentasi dan selanjutnya diekstraksi untuk memperoleh lovastatin murni. Profil
pertumbuhan sel Aspergillus terreus selama waktu fermentasi dapat dinyatakan sebagai
d [Sel ] [Sel ]
= k1 × [Sel ] × (1.0 − )
dt k2
dimana k1 adalah 0.09 untuk tahap awal pertumbuhan hingga tahap stasioner, dan k1 adalah -0.058 untuk
tahap kematian sel. Sedangkan nilai k2 untuk semua tahapan adalah 61.57. Dengan menggunakan lima
konsentrasi tepung jagung sebagai sumber karbon, maka laju produksi lovastatin akan mengikuti model
pembentukan
d [Lovastatin ]
= k 3 × [Sel ] + k 4 × [Lovastatin ]
dt
dimana k3 adalah 0.01, 0.06, 0.037, 0.024, dan 0.024 untuk berturut-turut 2.5 %, 5 %, 7.5 %, 10 %, dan
12.5 % tepung jagung. Nilai tetapan kinetika k4 adalah sama untuk semua konsentrasi, yaitu sebesar
0.027. Dalam lingkupan kondisi proses fermentasi yang diteliti, kadar lovastatin tertinggi sebesar 2808 g/L
media dicapai pada penggunaan 5 % tepung jagung. Optimalisasi perolehan lovastatin ini lebih lanjut dapat
diupayakan dengan memanfaatkan model kinetika proses yang telah didapatkan.
Kata kunci: fermentasi, laju reaksi, lovastatin, model kinetika

ABSTRACT
Lovastatin is a pro-drug for reduction of plasma cholesterol. It was indicated as an agent for
preventing arteriosclerosis risk in human. Lovastatin is biosynthetically produced from a liquid fermentation
of Aspergillus terreus with sufficient amount of C-source in a controlled condition of 150 rpm agitation and
28 0C temperature. Product was harvested after 6 days of fermentation and followed by an extraction to
obtain the pure lovastatin.

The cell growth of Aspergillus terreus during the fermentation period can be expressed as

d [ Sel ] [ Sel ]
= k1 × [ Sel ] × (1.0 − )
dt k2
where k1 is 0.09 for the beginning until the stationary phase and k1 is -0.058 for the cell death phase. The
value of k2 is 61.57 for all phases.

* Makalah ini disajikan pada Seminar Nasional Kimia VII,


di Surabaya 9 Agustus 2005
** Corresponding author Phone : (022) 2504711, Fax.:

(022) 2504712; e-mail: tigor@lipi.go.id

© Kimia ITS – HKI Jatim 99


Nauli dan Udin-Model Fermentasi Lovastatin

By introducing five different concentrations of cornstarch as the C-source, the biosynthesis of lovastatin can
be modeled as

d [ Lovastatin]
= k 3 × [ Sel ] + k 4 × [ Lovastatin]
dt
where k3 are 0.01, 0.06, 0.037, 0.024 and 0.024 for 2.5 %, 5 %, 7.5 %, 10 %, and 12.5 % cornstarch,
respectively. The kinetic constant k4 is 0.027 for all cornstarch concentrations.

The highest production of lovastatin for 2808 g/L medium was discovered in the usage of 5 % cornstarch.
The optimum product recovery of lovastatin can be found by applying these kinetic models.

PENDAHULUAN berada di bawah permukaan media. Melalui cara


Lovastatin adalah suatu pro-drug, yang di ini maka jenis dan konsentrasi komponen dalam
dalam tubuh akan segera terhidrolisis media cair dapat diatur agar mencapai kondisi
menghasilkan suatu senyawa yang dapat optimum pertumbuhan dan pemakaian media
menghambat bersaing kerja dari HMG-CoA yang lebih efisien. Sehingga akan dapat dicapai
reduktase, yaitu sebuah enzim yang perolehan produk metabolit sekunder yang
mengkatalisis perubahan HMG-CoA menjadi maksimum.
mevalonat, yang merupakan sebuah tahap Pada proses fermentasi, Aspergillus terreus
penting dalam biosintesis kolesterol. Hambatan memerlukan sumber karbon sebagai sumber
enzim ini meningkatkan densitas reseptor LDL nutrisi untuk dapat tumbuh dan melakukan
dalam sel hati sehingga terjadi penurunan LDL- metabolisme. Sumber ini dapat diperoleh dari
kolesterol. Aktivitas lovastatin ini memiliki arti senyawa yang mengandung karbohidrat (atau
penting secara medis sebagai obat anti senyawa gula), seperti misalnya glukosa, laktosa,
hiperkolesterol-emia [Hardmann, et al., 1996] dan gliserol, dan tepung dalam berbagai konsentrasi.
diindikasikan dapat menurunkan resiko
arteriosklerosis [Cottingham, 1998]. Model Fermentasi
Kinetika proses fermentasi dapat dimodelkan
Biosintesis Lovastatin sebagai ekspresi laju reaksi dalam bentuk
Lovastatin telah diketahui dapat diturunkan persamaan diferensial biasa (ordinary differential
dari asetat melalui lintas poliketida [Moore, equation). Secara umum, proses batch fermentasi
1985]. Biosintesis poliketida di dalam bakteri dan tersebut dapat diwakili oleh laju pertumbuhan sel
jamur adalah berkaitan dengan metabolisme dan laju pembentukan metabolit sekunder.
asam lemak meski memiliki perbedaan dimana Ekspresi laju reaksi yang dicocokan
beberapa reaksi reduksi atau dehidrasi yang (mathematical fiting) terhadap data percobaan
dikatalisa oleh poliketida sintase (PKS) akan dapat dicarikan solusinya dengan menggunakan
ditekan pada tahap biosintesis tertentu. Substrat- metoda analisis regresi tak linier (non linear
substrat selain asetil-CoA dan malonil-CoA dapat regression analysis).
digunakan oleh PKS untuk menyusun suatu rantai Model fermentasi yang terdiri dari sejumlah
karbon. Dengan menggabungkan produk persamaan diferensial dapat ditunjukkan dalam
metabolisme asam lemak dan modifikasi PKS bentuk
maka dimungkinkan diperolehnya berbagai
Y ′ = g ( x ,Y , b) (1)
macam metabolit sekunder yang bersifat biologis
aktif [O’Hagan, 1991]. dimana Y′ = vektor turunan dari Y, g = vektor dari
Aspergillus terreus merupakan salah satu fungsi, x = variabel bebas, Y = vektor dari variabel
jamur PKS yang diharapkan dapat menghasilkan tak bebas, dan b = vektor dari parameter. Solusi
salah satu metabolit sekunder poliketida, yaitu: terhadap model adalah mencari nilai parameter b
Lovastatin. Aspergillus terreus mengalami dari persamaan diferensial tersebut
metabolisme sekunder ketika sumber makanan [Constantinides, 1987].
dalam media telah berkurang akibat digunakan Jika kondisi batas dapat terpenuhi dan jika
untuk metabolisme primer. Sumber makanan vektor b dapat diperkirakan, maka persamaan
yang tersisa di dalam media akan digunakan oleh diferensial (1) dapat diintegrasikan secara
Aspergillus terreus untuk melakukan numerik atau analitik menjadi
metabolisme sekunder tersebut. Hasil dari
Y = f ( x , b) (2)
metabolisme sekunder ini disebut sebagai
metabolit sekunder Jumlah kuadrat residu, Φ, diberikan oleh
Proses pembentukan metabolit sekunder persamaan
dapat dilakukan dengan cara fermentasi
menggunakan metode batch dengan sistem Φ = (Y * − Y − AΔb)T (Y * − Y − AΔb) (3)
terendam, dimana kultur Aspergillus terreus

100 © Kimia ITS – HKI Jatim


Akta Kimindo Vol. 1 No. 2 Oktober 2005: 99-104

dimana Y* = vektor dari variabel tak bebas hasil menit. Filtrat dipisahkan dari endapannya dan
pengamatan percobaan, A = matriks Jacobi dari diekstraksi 2 kali dengan heksana (perbandingan
turunan parsial Y terhadap b yang dihitung volume 1 : 1) menggunakan corong pisah, agar
terhadap semua titik pengamatan percobaan. bersih dari pengotor minyak. Fasa air dipisahkan
Dengan mengambil turunan parsial Φ terhadap dan diekstraksi dengan pelarut etil asetat dengan
Δb dan membuat ruas persamaan menjadi nol, menggunakan dua metoda pemisahan. Fraksi
dan Δb diselesaikan, maka diperoleh akhir etil asetat kemudian dipisahkan dan
dievaporasi. Ekstraknya disimpan dalam botol
Δb = ( AT A) −1 AT (Y * − Y ) (4) sampel dan dibiarkan mengering pada suhu
kamar, untuk selanjutnya diukur kadar produk
dimana Δb = vektor koreksi yang digunakan untuk
memperkirakan nilai b dalam pendekatan vektor (lovastatin) nya dengan HPLC.
parameter yang baru
Analisa Kualitatif Lovastatin
bbaru = blama + Δb (5)
Analisa kualitatif terhadap ada/tidaknya
Metoda Gauss-Newton digunakan untuk lovastatin dilakukan dengan cara
melakukan iterasi terhadap persamaan (5) membandingkan waktu retensi puncak yang
dengan setiap kali memasukan nilai Δb dari muncul pada kromatogram dengan waktu retensi
persamaan (4) yang dihitung dari data percobaan, lovastatin standar, menggunakan TLC. Rf sampel
sehingga berakhir pada saat Φ tidak berubah lagi hasil ekstraksi dan kristal putih dibandingkan
atau Δb menjadi sangat kecil. Pada akhir iterasi dengan Rf standar lovastatin (SIGMA).
tersebut, maka bbaru adalah vektor parameter
yang dicari. Penentuan Kadar Lovastatin
Dalam penelitian ini akan dilakukan Penentuan kadar lovastatin dilakukan dengan
biosintesis lovastatin melalui fermentasi cair menggunakan HPLC, pada kolom C18, fase gerak
terhadap jamur Aspergillus terreus. metanol : air (9 : 1), panjang gelombang (λ) 254
Serta akan ditentukan model kinetika nm, dan flow/pressure 1/88 kg cm m-1, terhadap
pertumbuhan sel dan pembentukan metabolit ekstrak hasil pemisahan dengan etil asetat. Kadar
sekundernya. lovastatin diperoleh dengan membandingkan luas
area lovastatin sampel dengan luas area
BAHAN DAN METODE lovastatin standar, yaitu:
Csampel = (Lsampel / Lstandar) x Cstandar.
Mikroorganisme
Jamur Aspergillus terreus ATCC 20542 yang Kinetika Fermentasi
digunakan dalam percobaan, diperoleh dari Ditetapkan model pertumbuhan sel Aspergillus
koleksi Pusat Penelitian Kimia - LIPI. terreus dan model pembentukan lovastatin dalam
bentuk persamaan-persamaan laju reaksi. Solusi
Media Fermentasi terhadap kedua persamaan simultan ini dicari
Media fermentasi cair steril terdiri dari laktosa dengan menggunakan analisis regresi tak linier
9 g; pepton 0.6 g; corn steep liquor 1 g; gliserol 3 berganda (multiple non-linear regression)
g; susu skim 0.42 g; tepung jagung (dalam terhadap data percobaan dengan memasukan
beberapa konsentrasi) dan aquades. pH media hasil fermentasi sebagai variabel tak bebas dan
diatur sebesar 6.8 dengan penambahan NaOH waktu fermentasi sebagai variabel bebasnya.
1.125 N atau HCl 25 %, lalu media disterilisasi
pada 121 °C selama 15 menit. HASIL DAN PEMBAHASAN

Fermentasi Aspergillus terreus Pertumbuhan sel Aspergillus terreus


Produksi metabolit sekunder dari Aspergillus Ketika mikroorganisme Aspergillus terreus
terreus dilakukan melalui metode fermentasi tumbuh di dalam fermentor dalam kondisi yang
kultur curah atau media cair dengan melakukan terjaga, maka sel akan bertambah dengan laju
peragaman konsentrasi tepung jagung yaitu 2.5, yang dapat dimodelkan sesuai kaidah logistik,
5, 7.5, 10, dan 12.5 %. Inokulum 10 % dengan yaitu:
usia 30 jam diinokulasikan ke dalam tabung
dy1 y
Erlenmeyer 500 mL yang berisi 100 mL media = k1y1 (1.0 − 1 ) (6)
fermentasi cair steril. Biakan dikocok dengan dt k2
pengocok orbital kecepatan 150 rpm, suhu 28 °C dimana y1 adalah konsentrasi (atau banyaknya)
selama 144 jam (atau 6 hari). sel dalam satuan gram berat kering atau satuan
kekeruhan larutan.
Selama masa fermentasi berlangsung,
Ekstraksi Hasil Fermentasi perubahan konsentrasi sel yang diamati pada
Hasil fermentasi disentrifugasi dengan setiap 6 jam sekali, memberikan profil
kecepatan 2500 rpm, suhu 4 °C, selama 20 pertumbuhan seperti yang terdapat pada

© Kimia ITS – HKI Jatim 101


Nauli dan Udin-Model Fermentasi Lovastatin

Gambar 1. Profil yang ditunjukkan oleh percobaan Pembentukan Metaboliut Sekunder Lovastatin
ini merupakan model normal yang umum terjadi Laju pembentukan metabolit sekunder
pada suatu pertumbuhan sel. Disana terlihat lovastatin secara matematis dapat dikuantifikasi
dengan jelas adanya fasa awal pertumbuhan (6 melalui persamaan
jam pertama), fasa eksponensial (hingga hari
dy 2
kedua fermentasi), fasa stasioner (antara hari = k 2 y1 + k3y 2 (9)
kedua hingga hari ketiga), dan fasa kematian sel dt
(melewati hari ketiga fermentasi). dimana y2 adalah konsentrasi lovastatin dalam
g/mL media dan y1 adalah banyaknya sel yang
70
berasal dari persamaan (6) sebelumnya.
60 Dengan pemakaian lima macam konsentrasi
50 tepung jagung sebagai sumber karbon di dalam
media fermentasi, maka diperoleh gambaran
Sel (% T)

40
mengenai laju pembentukan lovastatin seperti
30 pada Gambar 2. Kurva laju tersebut hanya terlihat
20
sebanyak empat buah, karena kinetika laju
pembentukan lovastatin dengan penggunaan
10
10% dan 12.5% tepung jagung adalah tepat sama
0 besarnya (atau kedua kurva saling berhimpitan).
0 24 48 72 96 120 144 168
Waktu fermentasi (jam)
2.5% 5% 7.5% 10% 12.5% tepung jagung
Gambar 1. Profil pertumbuhan sel 3500
Aspergillus terreus.
3000

Panjangnya selang waktu pada setiap fasa 2500


Lovastatin (g/L media)

adalah khas untuk setiap sel dan bergantung pula


pada pengaturan kondisi fermentasi yang 2000
dilakukan. Informasi yang diperoleh ini akan
1500
menjadi pertimbangan pada fermentasi
berikutnya, apabila perolehan produk fermentasi 1000
tidaklah sesuai dengan yang telah diperkirakan.
500
Dari hasil perhitungan kinetika terhadap data
percobaan, maka laju pertumbuhan sel 0
Aspergillus terreus hingga fasa stasioner dapat 0 24 48 72 96 120 144 168

dimodelkan menjadi Waktu fermentasi (jam)

d [Sel ] [Sel ] Gambar 2. Laju pembentukan lovastatin pada


= 0.09 × [Sel ] × (1.0 − ) (7) lima kondisi fermentasi.
dt 61.57
Sedangkan setelah fasa stasioner, model Dari perhitungan terhadap kadar metabolit
pertumbuhan sel Aspergillus terreus adalah sekunder yang terbentuk selama perioda
d [Sel ] [Sel ] fermentasi, maka dapat dimodelkan laju
= −0.058 × [Sel ] × (1.0 − ) (8) pembentukan lovastatin sebagai
dt 61.57
Nilai tetapan kinetika k1 yang negatif (pada d [Lovastatin ]
=
persamaan 8) menyatakan laju pertumbuhan sel dt (10)
yang menurun, yaitu pada saat sel-sel mulai k 3 × [Sel ] + k 4 × [Lovastatin ]
berhenti tumbuh setelah melewati hari ketiga
fermentasi. Waktu itu merupakan saat dimana dimana nilai dari tetapan kinetika k3 adalah 0.01,
sel-sel Aspergillus terreus mulai membentuk 0.06, 0.037, 0.024, dan 0.024 untuk berturut-
metabolit-metabolit sekunder, terutama turut pemakaian 2.5%, 5%, 7.5%, 10%, dan
lovastatin. Konfirmasi terhadap peristiwa sintesis 12.5% tepung jagung. Dan nilai tetapan kinetika
metabolit sekunder terlihat nyata pada kurva- k4 adalah sama untuk semua konsentrasi, yaitu
kurva laju pembentukan (dalam Gambar 2) yang sebesar 0.027.
menaik secara tajam setelah hari ketiga (atau 72 Model kinetika pembentukan lovastatin
jam) fermentasi. Kemudian kurva tersebut (persamaan 10) memperlihat-kan bahwa laju
mencapai maksimumnya pada hari ke enam pembentukan ditentukan oleh banyaknya sel
fermentasi, dimana sel sudah tidak ada lagi yang pada satu waktu fermentasi dan ditentukan oleh
tumbuh. banyaknya lovastatin yang telah dihasilkan pada
saat itu. Dalam keadaan konsentrasi lovastatin
tertentu (yang diekspresikan oleh parameter k4
yang tetap), maka faktor penentu laju lebih
102 © Kimia ITS – HKI Jatim
Akta Kimindo Vol. 1 No. 2 Oktober 2005: 99-104

dominan pada banyaknya sel (yang dinyatakan perolehan lovastatin pada pemakaian 2.5%
oleh tetapan laju k3 yang bervariasi). tepung jagung.
Laju pembentukan paling rendah, dimana k3 = Pada perancangan penelitian yang berikutnya,
0.01, terjadi pada proses fermentasi dengan dapat diupayakan variasi konsentrasi yang lebih
menggunakan 2.5% tepung jagung. Sedangkan cermat pada selang 2.5% hingga 7.5% tepung
laju pembentukan tertinggi, dimana k3 = 0.06, jagung, agar dapat ditemukan secara akurat
teramati pada pemakaian 5% tepung jagung. perolehan lovastatin yang maksimum.

Perolehan Lovastatin KESIMPULAN


Profil pertumbuhan sel Aspergillus terreus Dari hasil percobaan fermentasi
yang terlihat normal (pada Gambar 1), dapat Aspergillus terreus menggunakan tepung jagung
menyatakan bahwa proses fermentasi telah sebagai sumber karbon, maka disimpulkan
berjalan secara baik. Sehingga dapat diharapkan bahwa:
akan diperolehnya metabolit sekunder lovastatin
dalam jumlah yang menggembirakan. 1. Profil pertumbuhan Aspergillus terreus
Perolehan lovastatin pada lima batch terlihat mengikuti kaidah logistik umum dan
fermentasi ditunjukkan pada Gambar 3 berikut dapat dimodelkan sebagai
ini. Kecenderungannya adalah mirip dengan laju
d [Sel ] [Sel ]
pembentukannya, dimana terlihat lonjakan yang = 0.09 × [Sel ] × (1.0 − )
tajam antara penggunaan 2.5% dan 5% tepung dt 61.57
jagung. Dan menurun kembali hingga stagnan pada fasa awal pertumbuhan hingga fasa
pada pemakaian tepung jagung yang lebih tinggi stasioner. Dan dapat dimodelkan sebagai
lagi.
d [Sel ] [Sel ]
= −0.058 × [Sel ] × (1.0 − )
2808
dt 61.57
3000
pada fasa kematian sel.
2500
2. Laju pembentukan lovastatin selama
Lovastatin (g/L media)

2000 1804
enam hari (atau 144 jam) fermentasi cair
1500 dapat dimodelkan sebagai
1060 1060
1000
d [ Lovastatin]
500
484
=
dt
0
k 3 × [Sel ] + k 4 × [ Lovastatin]
2.5 5.0 7.5 10.0 12.5
Konsentrasi tepung jagung (%)
dengan tetapan k3 adalah 0.01, 0.06, 0.037,
Gambar 3. Perolehan lovastatin pada lima 0.024, dan 0.024 untuk pemakaian 2.5%, 5%,
kondisi fermentasi. 7.5%, 10%, dan 12.5% tepung jagung. Dan
tetapan k4 adalah 0.027 untuk semua
Aspergillus terreus menggunakan tepung konsentrasi.
jagung secara optimal pada konsentrasi 5%
(5 g/100 mL). Penam-bahan konsentrasi tepung 3. Dalam kondisi percobaan yang telah
jagung lebih besar dari 5% ternyata justru dilakukan, kadar lovastatin tertinggi
menurunkan konsentrasi lovastatin yang sebesar 2808 g/L media dicapai pada
dihasilkan. Peristiwa ini mirip seperti kinetika penggunaan 5 % tepung jagung.
enzimatis substrat tunggal, dimana penambahan
substrat yang lebih banyak dari suatu konsentrasi DAFTAR PUSTAKA
tertentu akan dapat menurunkan jumlah Constantinides, A., 1987, Applied Numerical
produknya [Laidler, 1973]. Methods with Personal Computers, McGraw-
Disini kemungkinan telah terjadi suatu Hill Book Co., New York, 563-571.
peristiwa inhibisi balik (feed-back inhibition), Cottingham, J., 1998, Lovastatin/ Mevacor™:
dimana penambahan konsentrasi tepung jagung Cholesterol Control, The Parkins List Drug
yang melebihi dari kadar optimalnya justru akan Database Index, 1-3.
menghambat terbentuknya lovastatin, sehingga Hardmann, J.G. et al., Eds., 1996, Goodman and
akhirnya jumlah lovastatin yang dihasilkan akan Gilman’s The Pharmaceutical Basis of
menjadi lebih sedikit. Therapeutics, McGraw-Hill Book Co., New York,
Dari kondisi fermentasi yang telah ditetapkan 885-887.
dalam percobaan ini, maka perolehan tertinggi Laidler, K.J., Bunting, P.S., 1973, The Chemical
produk lovastatin adalah sebanyak 2808 g/L Kinetics of Enzyme Action, Clarendon Press,
media. Perolehan ini hampir enam kali lipat Oxford.
© Kimia ITS – HKI Jatim 103
Nauli dan Udin-Model Fermentasi Lovastatin

Moore, R.N. et al., 1985, Biosynthesis of the O’Hagan, D., 1991, The Polyketide Metabolites,
hypocholesterolemic agent mevinolin by Ellis Horwood, New York.
Aspergillus terreus. Determination of the origin
of carbon, hydrogen, and oxygen atoms by
carbon-13 NMR and mass spectrometry, J. Am.
Chem. Soc. 107:12, 3694-3701.

104 © Kimia ITS – HKI Jatim