TP d’histologie

La méthode peut prendre entre 10 jours et 15 minutes.

But de la méthode: Débiter en coupe mince (5 à 6
m) un tissu, un

organe, de le colorer et qu’il résiste des dizaines d’années.

Les différentes étapes:

• Fixation
• Rinçage
• Inclusion
• Coupe
• Coloration
• Montage

La fixation
Le tissu doit être le plus frais possible. Il peut venir de l’abattoir.
On doit d’abord tuer les cellules en appliquant une coagulation
irréversible du cytoplasme. Ainsi, on empêche l’autolyse et la décomposition
post-mortem. Pour que le fixateur agisse correctement sur l’ensemble du tissu,
celui-ci ne doit pas excéder les 10mm de diamètre.

Les différents fixateurs:

• Ethanol 96%
Mais il provoque une brusque déshydratation du tissu entraînant
des artéfacts.
• Formol
Il s’agit de formaldéhyde qui peut être pur: 40% ou bien à 10%. Il
pénètre vite et bien dans le tissu mais il a tendance à durcir ce
dernier, qui sera alors plus dur à couper.
• Acide picrique
Il s’agit de poudre jaune explosive qui est diluée dans de l’eau
picriquée saturée. Les protéines précipitent alors sous forme de
picrate.
La coloration sera, par la suite, très bonne mais ce fixateur ne
convient pas pour tous les tissus qui ont alors tendance a gonfler
(surtout quand il présente beaucoup de collagène)
• Acide acétique glacial
Il est utilisé pur, à 100% (dans le vinaigre, il est a 80%). Il est très
bon pour les structures nucléaires mais il a tendance à détruire
ces structures si on le laisse agir trop longtemps.
• Tétroxyde d’osmium (OsO4)
Il est très bon pour tous les systèmes membranaires mais coûte
très cher et est très toxique

Dans la pratique, on mélange ces différents fixateurs pour obtenir par

exemple le liquide de Bouin de couleur jaune :
 - 75 mL d’eau picriquée saturée
- 25 mL de formol 40%
- 5 mL d’acide acétique glacial
Mais ce liquide lyse beaucoup de globules rouges et a tendance à faire
gonfler le collagène.

Attention, la fixation n’est pas éternelle, à l’exception du formol qui est

également un conservateur.

Le temps de la fixation varie en fonction de la taille de la pièce
:

- 5 mm de diamètre
: 24heures de fixation
- 2 cm «
3 jours «

Si la pièce est plus grosse, après quelques heures dans le fixateur, on fait une
incision dans le tissu pour que le fixateur rentre aussi par l’intérieur.

Le rinçage
On sort la pièce du fixateur puis on la baigne dans du carbonate de
lithium pour enlever la coloration jaune s’il y a lieu. Sinon, pour un fixateur
comme l’acide picrique, on passe juste la pièce sous l’eau courante.

L’inclusion
On inclut ensuite la pièce dans de la paraffine, substance à la fois dure
et molle, ou bien dans du cellomidine, de la gélatine, ou encore de la résine
hypoxie, substance beaucoup plus dure, utilisée pour des coupes très minces.
Il faut d’abord déshydrater le tissu car la paraffine est très hydrophobe.
On utilise pour cela des alcools de degré croissant
: 40% puis 90% et enfin
l’alcool absolu. Mais la paraffine n’est pas non plus miscible avec l’alcool. Il
faut donc laver le tissu. On le plonge alors dans trois bains successifs de 24h
d’hydrocarbures benzéniques (qui peuvent causer les leucémies). On peut
également utiliser le butanol, qui a pour avantage de finir une
déshydratation, qui aurait été mal faite. Le butanol est pourtant un alcool,
mais il se mélange très bien avec la paraffine.
On place ensuite la pièce déshydratée dans trois bains de paraffine
liquide, en étuve, à 58 ou 60°C, pendant trois fois 24h. Puis on coule la pièce
dans de la paraffine liquide qui va se solidifier. La pièce est conservable ainsi
pendant des siècles.

La coupe
On utilise un appareil très lourd et très coûteux
: un microtome. On
récupère ensuite la coupe que l’on place sur une lame de verre. L’adhésion
doit être bonne. On peut utiliser divers liquide pour la faciliter, puis on laisse
sécher.

La coloration
Si on ne colore pas, on ne peut rien observer du tout.
Il existe différents types de coloration
:
1/ La coloration topographique
: trichrome de Masson
 2/ La coloration histochimique
: APS = Acide périodique réactif
de Schiff

1/ La coloration topographique
Elle fait appel à des colorants à base d’eau.

• Il faut d’abord enlever la paraffine, sinon, le colorant ne peut pas entrer

dans le tissu. On utilise donc trois bains de toluol de 5 minutes.

• On réhydrate la coupe avec des bains d’alcool décroissants
: 100%,

90% et 70% puis un bain d’eau distillée.

• Le 1er colorant, basique, l’hématoxyline, colore tout ce qui est acide,

comme le noyau, en bleu foncé
: 5 minutes

• On lave a l’eau courante (si elle est basique) pour renforcer la

coloration qui deviendra bleue/noire.

• Le 2ème colorant, acide, la fuscine Ponceau, colore quasi toutes les

protéines, en rose pour le cytoplasme, en rouge pour la kératine par
exemple. 5 minutes.

• On rince ensuite à l’eau acidifiée, c'est-à-dire de l’eau distillée avec 1%

d’acide acétique.

• On effectue un 2ème rinçage à l’eau acidifiée.

• On plonge la coupe dans un mélange
: orange G (colorant acide qui

se fixe sur les globules rouges et les colore en orange) / acide
phosphomolibdique (qui annule l’effet de la fuscine ponceau au
niveau du tissu conjonctif et rend le collagène et l’élastine
transparente)
: 5 minutes

• On rince deux fois la coupe à l’eau acidifiée.

• 3ème colorant, le vert lumière, se fixe au conjonctif, surtout le collagène

et le colore en vert
: 5 minutes.

• On rince deux fois la coupe à l’eau acidifiée et on peut l’y laisser

2heures.

2/ La coloration histochimique
: APS

Elle met en évidence les glucides en général, mais sans précision. Les
deux 1ères étapes de cette coloration sont identiques à la précédente.

• Il faut d’abord enlever la paraffine, sinon, le colorant ne peut pas entrer

dans le tissu. On utilise donc trois bains de toluol de 5 minutes.
 • On réhydrate la coupe avec des bains d’alcool décroissants
: 100%,
90% et 70% puis un bain d’eau distillée.

• On plonge la coupe dans un bain d’acide périodique (Hi O4). Il va se

produire une oxydation modérée entraînant la formation d’aldéhydes
à partir d’hydroxydes
: 5 à 10 minutes.

• On lave la coupe à l’eau du robinet.

• On la plonge dans du réactif de Schiff où la fuscine est décolorée par

le dioxyde de souffre. Dès 10 minutes, les aldéhydes sont révélés en
rouge magenta
: 20 minutes

• On rince à l’eau distillée puis à l’eau du robinet

• Pour voir les noyaux, on effectue une contre coloration, avec

l’hématoxine, ce qui permet de mieux discerner les cellules.

• On rince à l’eau courante.

Le montage
Pour éviter que la coupe ne s’abîme, on va la protéger par une lamelle
qui sera collée grâce à un baume synthétique. Mais ce dernier n’est pas
miscible à l’eau.
Il faut donc de nouveau déshydrater la coupe. Mais cette fois-ci, on la
baignera rapidement dans deux bains successifs d’alcool à 100% pour éviter
que le vert lumière ne diffuse.
On baignera ensuite la coupe dans un bain de toluol, miscible au
baume synthétique.
La coupe est maintenant prête à être montée
:
On pose une lamelle sur la table, on y dépose au centre une goutte de
baume et on applique délicatement la lame avec la préparation dessus. Une
fois collée, on retourne rapidement la lame et on vérifie qu’il n’y ait pas de
bulles. Dans le cas contraire, on écrase un peu la lamelle pour faire échapper
l’air qui se trouve en dessous.
Enfin, on place le tout en étuve pendant 24 heures.