6.1. INTRODUCCIÓN
Como la mayor parte de los seres vivos, las bacterias son capaces de modificar el ambiente
que las rodea, captando sustancias necesarias para su multiplicación y liberando al medio
productos de desecho, enzimas, exotoxinas, etc. Las interacciones que cada tipo bacteriano
establece con el entorno son propias y características. Esta especificidad depende del
genotipo de la bacteria y se expresa en un determinado equipo enzimático. La caracterización
de dichas enzimas es una útil herramienta para la identificación y clasificación bacteriana.
Un ser vivo se define principalmente por desarrollar una serie de actividades biológicas,
durante su ciclo vital. Ésta actividad biológica consiste en un variedad de reacciones físico-
químicas que transcurren en el marco de las células y denominamos como bioquímica.
El conjunto de reacciones que puede realizar un ser vivo se llama metabolismo y engloba
tanto las reacciones de degradación (catabolismo) como de síntesis (anabolismo).
Las reacciones parten de una base denominada nutriente o sustrato, a partir de la cual se
obtiene la energía y las moléculas necesarias para formar sus propios compuestos.
Las bacterias forman un grupo muy heterogéneo, ya que la diversidad de especies existentes,
pueden realizar todo tipo de metabolismo. Algunas especies poseen dos tipos de
metabolismo diferente que utilizan facultativamente, dependiendo de la abundancia nutritiva
del medio.
Requerimientos químicos
Los organismos que realizan la fotosíntesis y las bacterias que obtienen la energía a partir de
la oxidación de compuestos inorgánicos (quimiolitótrofas) usan típicamente la forma mas
oxidada del Carbono, el C02, como única o principal fuente de Carbono celular.
6 - PRUEBAS BIOQUÍMICAS 70
Algunas bacterias son capaces de utilizar sustancias muy sencillas como ácido acético,
alcohol, citrato sódico, etc. En otras ocasiones, la mayor parte de los casos, la fuente de
carbono corresponde a azúcares en forma de mono o disacáridos, como glucosa, lactosa,
maltosa, etc., e incluso hay microorganismos que pueden utilizar azúcares más complejos
para obtener energía, como es el caso del almidón.
Por último, existen especies, como por ejemplo Pseudomonas, que pueden utilizar como
fuente de energía un gran número de componentes hidrocarbonados diferentes.
En general, conocer el tipo de azúcar utilizado por cada bacteria es muy útil para su
identificación bioquímica y consiguiente clasificación taxonómica.
Los requerimientos de nitrógeno y azufre pueden satisfacerse también con frecuencia, con
nutrientes orgánicos que contengan estos dos elementos en combinación orgánica reducida
(aminoácidos o productos más complejos de la degradación de las proteínas, como las
peptonas). Existen muchos tipos de peptonas y son excelentes fuentes de nitrógeno. Entre las
más frecuentes y conocidas se encuentran los extractos de levadura que son extractos
hidrosolubles preparados a partir de un lisado de levadura que se utiliza en muchos medios de
cultivo.
Una vez que la glucosa se ha degradado a ácido pirúvico, este ácido puede seguir oxidándose
por la vía de la respiración o la fermentación.
FERMENTACIÓN Este proceso se inicia a partir del ácido pirúvico, tiene como
características fundamentales:
1. No requiere oxígeno (aunque a veces puede ocurrir en su presencia)
2. No necesita cadenas transportadoras de electrones (ciclo de Krebs)
3. Utiliza moléculas orgánicas como aceptor final de electrones
4. Libera energía a partir de azúcares u otras moléculas orgánicas como aminoácidos,
ácidos orgánicos, etc.
5. Tiene un rendimiento menor que la respiración
Las levaduras actúan sobre el mosto, degradando la glucosa por vía respiratoria. Cuando en
los lagares, por efecto de la acumulación del CO2 encima del mosto, el aire no entra en
contacto con la levadura, se inicia entonces la fermentación de la glucosa con la
correspondiente formación de alcohol.
Hay que remarcar, respecto al papel que desempeña el oxígeno en la respiración, que el
proceso respiratorio, al igual que la fermentación, es un proceso de oxidación, pero en el que
esta oxidación sucede no por ganancia de oxígeno, sino pérdida de hidrógeno. El oxígeno es,
simplemente, el aceptor final de hidrógeno en la respiración, como lo son otros compuestos
orgánicos en la fermentación.
Metabolismo: Los conceptos “heterotrofo” y “autotrofo” pensados para denominar los tipos
de nutrición de animales y plantas, no son suficiente para caracterizar la variedad de tipos
nutricionales que se dan en los microorganismos. Los tipos nutricionales en este reino, se
clasifican según sea:
a. Fuente de energía
Fototrofas (Foto) obtienen la energía directamente de la luz.
Quimiotrofas (Quimio) obtienen la energía por reacciones red-ox
degradando sustancias independientemente de que realizen respiración
o fermentación.
2. Bacterias rojas y verdes. No pueden utilizar el H2O como dador de hidrógenos, sino
que necesitan un dador de [H] fuertemente reducido (H2S, H2, materia orgánica).
Como consecuencia estas bacterias no liberan oxígeno durante la fotosíntesis
(fotosíntesis anoxigénica). Se las considera como reliquias de los primeros tiempos de
la fotosíntesis. Son bacterias unicelulares acuáticas , de color rojo, naranja o verde, en
función del contenido que posean de pigmentos fotosintéticos: bacterioclorofilas y
carotenoides.
6 - PRUEBAS BIOQUÍMICAS 74
Radiación solar en la zona del espectro azul, verde-azul (450-500 nm) que
corresponde a la zona de absorción de los carotenoides.
H2S (descomposición sulfatos y proteínas)
CO2 y materia orgánica.
Bacterias de suelos y aguas con capacidad de utilizar compuestos o iones inorgánicos como
dadores de hidrógenos y CO2 como fuente de carbono.
La obtención de energía tiene lugar, por lo general, a través de la respiración con O2 y sólo
escasos m.o. pueden utilizar NO3-, NO2-, N2O como aceptor de electrones (R.anaerobia).
Fijación del nitrógeno molecular: Solo algunos procariotas son capaces de captar y fijar el
nitrógeno atmosférico (N2). En parte en formas de vida libre, en parte en simbiosis con
plantas superiores, pueden pasar al N2 inerte a una combinación orgánica, incorporándolo
directamente (Rhizobium) o a través de las sustancias celulares a la proteína del suelo.
Tipos de fermentaciones anaeróbicas puesto que la vida surgió en una atmósfera carente de
oxígeno, la fermentación anaeróbica constituye el mecanismo biológico mas primitivo
destinado a obtener energía de los alimentos.
1
la enzima -galactosidasa permite a estos m.o. hidrolizar la lactosa en glucosa-galactosa
6 - PRUEBAS BIOQUÍMICAS 76
Fermentación acética
El término fermentación se suele utilizar en un sentido más amplio, al aplicarlo también, para
referirse a una serie de procesos en los que sí interviene oxígeno, aunque el producto final es
un compuesto orgánico y por tanto no hay degradación completa de la materia orgánica
(fermentaciones oxidativas).
1. ENZIMAS EXTRACELULARES:
Estas moléculas deben ser primero hidrolizadas por enzimas extracelulares específicas,
en sus respectivas unidades de construcción. Estas moléculas de bajo peso molecular
podrán ser entonces transportadas al interior de las células y utilizadas en el
metabolismo celular.
6 - PRUEBAS BIOQUÍMICAS 77
2. HIDRATOS DE CARBONO
3. PRÓTIDOS.
2
ONPG - Las bacterias que poseen -galactosidasa pero no galactosidopermeasa dan (-)
en la prueba de la lactosa. La ONPG (ortonitrofenolgalactosido) atraviesa fácilmente la
pared bacteriana y es desdoblada por la -galactosidasa en galactosa más un radical de
color amarillo. Se utiliza esta prueba bioquímica para la identificación de las bacterias
fermentadoras tardías de la lactosa (entre 2-15 días en fermentar la lactosa).
3
GLU, ARA capacidad de metabolizar los monosacáridos glucosa y arabinosa
4
TDA- Se detecta la presencia de la enzima TDA (triptofano desaminasa)
La enzima produce la desaminación del sustrato (triptófano)
Identificación: la adición de FeCl3 da verde obscuro si esta presente TDA
5
LDC - En la degradación proteica intervienen numerosos hongos y bacterias (Bacillus
cereus, Mycoides, Pseudomonas, Proteus vulgaris...). Las bacterias que poseen la
enzima lisina descarboxilasa pueden catabolizar anaeróbicamente aminoácidos
(lisina) según la siguiente reacción de descarboxilación:
Lisina H2N - (CH2)4-CHNH2-COOH ------->H2N-(CH2)4-CH2-NH2 (cadaverina) + CO2
6 - PRUEBAS BIOQUÍMICAS 78
1. LÍPIDOS La lipasa actúa sobre los lípidos dando ácidos grasos . Las sales de estos
ácidos grasos se emplean como única fuente de carbono (agar citrato10) . La
producción de sustancias alcalinas provocan el viraje del azul de bromotimol
(amarillo pH<6 y azul pH>7,6)
6
ODC - Degradación anaeróbica de aminoácidos. La enzima ornitina descarboxilasa
permite degradar:
Ornitina ------(descarboxilación)---------->H2N-(CH2)4-NH2 (putrescina) + CO2
7
IND - La degradación total del aminoácido triptófano por la enzima triptofanasa
A. PRESENCIA DE OXIDASA
Fundamento
Esta prueba permite diferenciar el grupo Enterobacteriacea (que carece de citocromo c) del
género Pseudomonas (que posee citocromo c).
Reactivos
Tetrametil-p-fenilen diamida en solución de alcohol isoamílico al 1,1 %.
El reactivo, una vez preparado, no tiene color o es ligeramente rosado. A causa de la
capacidad de autooxidación que tiene, se debe guardar a 4 ºC y preservarlo de la luz.
Procedimiento
1. Sembrar en estría escocesa, para obtener colonias aisladas, dos placas de agar sangre
o TSA (no utilizar medios glucosados) con inóculos de Escherichia coli y
Pseudomonas aeruginosa.
2. Incubar a 37 ºC durante 48 h.
3. Tomar una colonia y extenderla encima de un papel de filtro Whatman nº 1 (utilizar
asa de platino, pipeta de plástico, torunda algodón impregnada, palillo de madera).
4. Dejar caer una gota de reactivo sobre la colonia a determinar.
5. Las bacterias productoras de oxidasa, oxidan rápidamente el reactivo y la colonia se
vuelve de color violeta (durante los primeros 30-60 seg)
6 - PRUEBAS BIOQUÍMICAS 80
B. PRUEBA DE LA CATALASA
Fundamento. En los ambientes acuosos, que contienen oxígeno disuelto, como el citoplasma
de las células, aparecen formas tóxicas derivadas del oxígeno. Las bacterias que viven en
ambientes aerobios necesitan un equipo enzimático capaz de neutralizar estas formas tóxicas.
Entre estas enzimas se encuentra la catalasa, que convierte el peróxido de hidrógeno en agua
y oxígeno molecular.Fig. 6.1. Son ejemplos de catalasa positivo Escherichia coli y catalasa
negativo Enterococcus faecalis.
Procedimiento
1. Tomar una colonia con un palillo de madera y depositarla en el centro de un porta.
2. Añadir una gota de peróxido de hidrógeno (3%).
3. Si la reacción es positiva, se produce inmediatamente un apreciable burbujeo de O2.
Procedimiento
1. Sembrar en 2 tubos con 5 ml. caldo de triptona (BTW) sendos inóculos de
Enterobacter y Escherichia coli.
2. Incubar 24 h. a 37 ºC
3. Añadir a 1 ml. de los tubos incubados 5 gotas de reactivo de Kovacks, dejándolo caer
por la pared interior del tubo.
Lectura de resultados. En caso dudoso incubar hasta un máximo de 5 días.
6 - PRUEBAS BIOQUÍMICAS 81
Fig. 6.1
Fundamento. Las bacterias que en anaerobiosis fermentan los azúcares pueden realizar esto
por distintas rutas. Las enterobacterias son anaerobios facultativos que utilizarán la glucosa
en dos fases: primero la metabolizarán aerobiamente, consumiendo rápidamente el oxígeno
del medio, para, en segundo lugar, continuar metabolizándola por vía anaerobia
(fermentación). Esta fermentación puede ser de dos tipos:
a. Fermentación ácido-mixta. Los productos finales son ácidos orgánicos (fórmico,
acético, láctico y succínico) y etanol. Fermentación característica de los géneros
Escherichia, Salmonella, Shigella, Proteus, Yersinia.
b. Fermentación butilén-glicólica. Los productos finales son compuestos neutros como
el butanodiol y el etanol, produciéndose acetoína como intermediario. Fermentación
característica de los géneros Enterobacter, Serratia y la mayoría de especies Erwinia.
Prueba de Voges-Proskauer
Glucosa --> Ác. pirúvico -->Acetoína --->Diacetilo ---->Complejo rojo + KOH (aire)+ naftol
Procedimiento:
1. Sembrar en 2 tubos con 5 ml. de de caldo RMVP, sendos inóculos de Enterobacter
aerogenes y de Escherichia coli.
2. Incubar 48 h a 37 ºC
3. Añadir a 1 ml. de los tubos incubados 10 gotas de -naftol al 5 % y 10 gotas de KOH
al 40 % (por este orden)
4. Agitar para mezclar y colocar los tubos en posición de máxima inclinación durante
10-15 min. (facilita la difusión del O2 atmosférico).
5. Observar a las 2, 12 y 24 horas.
6. Observar el color resultante: Interpretación: Aparición del color rosa eosina: (+).
En caso de duda incubar 48 h. más.
Los productos finales neutros (butanodiol y en menor cantidad etanol) predominan sobre los
ácidos; como consecuencia, la cantidad total de ácido que se forma por mol de Glucosa
fermentada es considerablemente más pequeña en una fermentación butanodiólica que en una
fermentación ácido-mixta.
Productos de la fermentación de glucosa por bacterias entéricas
PRODUCTOS, MOLES POR CADA 100 MOLES DE GLUCOSA
FERMENTADA
FERMENTACIONES ÁCIDO- FERMENTACIONES
MIXTAS BUTANODIÓLICAS
Esch Aeromonas Vibrio Enterobacter Serratia
erich punctata cholerae aerogenes marcescens
ia
coli
Etanol 50 64 51 70 46
2,3 butanodiol - - - 66 64
Äcido acético 36 62 39 0,5 4
Ácido láctico 79 43 53 3 10
Ácido succínico 11 22 28 - 8
Ácido fórmico 2,5 105 73 17 48
H2 75 - - 35 -
CO2 88 - - 172 116
Total ácidoformado 129 232 193 20 70
6 - PRUEBAS BIOQUÍMICAS 84
Fermentación de la lactosa
d − Glu cos a (fermentación)
+
Lactosa C12H22O11 ------(hidrólisis por enzima lactasa)-------> d − Galactosa
La capacidad de fermentar la Lactosa (disacárido formado por dos monosacáridos, unidos por
el enlaces -1,4, entre la glucosa y la galactosa), depende de la presencia de la enzima -
galactosidasa. La utilización efectiva de la Lactosa, también requiere la presencia de la
Galactósido permeasa que favorece la entrada de la lactosa en el interior de la célula.
Las bacterias que producen -galactosidasa pero les falta permeasa no pueden incorporar
Lactosa a una velocidad suficiente para producir una fermentación rápida y vigorosa, y
generalmente, se clasifican como NO fermentadores de lactosa. La fermentación de Lactosa
es especialmente característica de Escherichia y Enterobacter, y ausente de Shigella,
Salmonella y Proteus.
FERMENTACIÓN ÁCIDO-MIXTA
A. Producen CO2+H2 (poseen hidrogenoliasa fórmica):
Escherichia
Proteus
Salmonella (la mayoría de especies)
Photobacterium (algunas de las especies)
F. AGAR MC CONKEY. Es un medio selectivo por contener sales biliares y cristal violeta
que inhiben el crecimiento de bacterias no entéricas. Es también un medio diferencial,
porque contiene lactosa y un indicador de pH. Las bacterias capaces de fermentar este azúcar
producirán un cambio en el pH del medio por la liberación de productos ácidos. Como
consecuencia sus colonias aparecerán de color violeta, contrastando con la coloración
amarillenta de las colonias de bacterias no fermentadoras de lactosa.
Escherichia coli AG A -
Enterobacter aerogenes AG A -
Enterobacter cloacae AG A -
Citrobacter freundii AG A +
CLAVE INTERPRETACIÓN
Color y aspecto Fondo Superficie inclinada
Fermentación de GLUCOSA y Fermentación de
A Amarillo formación de ÁCIDO LACTOSA y/o
SACAROSA con
producción de ÁCIDO
G Aparición de burbujas o Formación de GAS a partir de
grietas GLUCOSA
K Rojo intenso No fermentación de GLUCOSA y No fermentación de
formación de ALCALI LACTOSA ni
SACAROSA. Formación
de ALCALI.
No hay cambio del color No fermentación de GLUCOSA No fermentación de
R original (Rojo anaranjado). LACTOSA ni SACAROSA
+ Enengrecimiento Formación de SH2
SH2
- Sin ennegrecimiento No formación de SH2
K. AGAR MANITOL SAL. Éste es un medio selectivo y diferencial muy utilizado para el
aislamiento e identificación de Staphylococcus aureus. La alta concentración de sal (NaCl al
7,5 %) le proporciona su carácter selectivo, ya que sólo este tipo de microorganismos
osmotolerantes y los microorganismos osmófilos pueden multiplicarse en él. Además, en su
composición el único azúcar presente es el manitol, que únicamente son capaces de fermentar
las cepas patógenas de este género bacteriano, diferenciándolas así de las que no lo son. La
producción de ácidos proveniente de la fermentación del manitol es detectada por un viraje
del indicador de pH presente en el medio (rojo fenol) a amarillo. Staphylococcus aureus,
fermentador del manitol, crecerá en el medio dando lugar a colonias grandes rodeadas de un
halo amarillo, mientras que Staphylococcus hepidermidis, que no fermenta el manitol, dará
lugar a colonias pequeñas rodeadas de un halo púrpura (a veces permite el desarrollo de
Enterococcus faecalis, pero con un crecimiento muy pobre).
L. PRUEBA DE LA COAGULASA.
Procedimiento
1. En tubos de 5 ml colocar 0,5 ml de plasma de conejo-EDTA rehidratado.
2. Añadir con asa Kolle 1 colonia bacteriana.
3. Homogeneizar con asa Kolle.
4. Incubar 4 h a 37 ºC. Lecturas a la 1/2 , 4 y 24 h.
5. Comprobar si presenta coagulación por hemólisis del plasma de conejo
6 - PRUEBAS BIOQUÍMICAS 90
Escherichia coli crece bien sobre medios de cultivo que contengan glucosa, o lactosa y
peptona. Para establecer ya desde un principio condiciones selectivas para que puedan crecer
pocas bacterias, se utiliza la lactosa. La utilización de lactosa supone la capacidad de escindir
la lactosa con formación de gas, mediante la -galactosidasa, enzima utilizado por coliformes
y bacterias lácticas.
Como algunas bacterias del ácido láctico son capaces de desdoblar la lactosa formando gas,
por lo que podrían falsear los resultados, son necesarios otros procedimientos para la
diferenciación. Si se siembran en placa organismos de un cultivo de este tipo sobre agar
eosina-azul de metileno Levine (lactosa-peptona-eosina-azul de metileno) las colonias de
E.coli se diferencian porque sus colonias son planas de 2-3 mm de diámetro de color violeta
oscuro y centro negro con un brillo metálico característico de color verdoso con luz reflejada.
. Los organismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras.
Para una diferenciación más exacta de las dos especies se ha acostumbrado a seguir un
método rutinario denominado "IMVIC".
Procedimiento:
Procedimiento
1. Realizar en una placa de agar TSA una siembra escocesa de la muestra de partida
(cultivo mixto de un bacilo Gram negativo (E.coli) y un coco Gram positivo
S.epidermidis).
2. Incubar a 37 º C durante 48 h.
3. Realizar una Tinción Gram de cada tipo de colonia aislada.
4. A partir de cada tipo de colonia, realizar un agotamiento por estrías en placas de agar
sangre y de agar Mc.Conkey. Incubar a 37 º C durante 24 h..
5. Comprobar el aspecto de las colonias. Verificar que en la placa de agar sangre se
multiplican ambas bacterias y en la placa de agar Mc.Conkey sólo crecerá el bacilo
Gram negativo. Observar en la placa de agar sangre si se ha producido hemólisis y de
qué tipo es, y en la placa de agar Mc.Conkey si ha sido fermentada la lactosa.
6. A partir de las colonias de los cocos Gram positivos se realiza la prueba de la
catalasa, que permite diferenciar entre Staphylococcus y Streptococcus. Para ello
tomar con palillo de madera una colonia Gram+ del agar sangre y colocarla sobre un
portaobjetos limpio. Añadir una gota de reactivo de la catalasa (peróxido de
hidrógeno) . Si la prueba es positiva (aparición de burbujas), sembrar en el medio agar
manitol sal . Incubar a 37 ºC durante 24 h.
7. A partir de las colonias de los bacilos Gram negativos se realiza la prueba de la
citocromo c oxidasa. Para ello, colocar un trocito de papel de filtro sobre un
portaobjetos limpio. Con un palillo de madera tomar una colonia Gram - del agar
sangre y extenderla en el papel de filtro. Añadir encima una gota del reactivo oxidasa
Observar si aparace coloración azul. Confirmar que el bacilo Gram negativo es una
enterobacteria (citocromo c oxidasa negativa).
8. A partir de una colonia del bacilo Gram negativo sembrar los siguientes medios
diferenciales: agar citrato de Simmons, agar fenilalanina, caldo de triptona con NaCl
al 0,5 %, dos caldos de RMVP y agar de Kliger (KIA). Todos estos medios se
siembran tal como se explicó en el capítulo 4 , excepto el agar de Kliger, que se
siembre con una aguja de inoculación como muestra la fig. 6.4.
9. Incubar todos los medios a 37 ºC durante 24 h.
10. Añadir los distintos reactivos (4 gotas/tubo) a sus correspondientes cultivos. Las
pruebas del citrato, manitol y KIA no requieren la adición de ningún reactivo.
Anotar los cambios de color en las distintas pruebas. Con la ayuda de la tabla nº 6-1,
y 6-2 identificar las bacterias analizadas.
6 - PRUEBAS BIOQUÍMICAS 92
Tabla 6.1
6 - PRUEBAS BIOQUÍMICAS 93
SISTEMA API.
En un soporte de plástico están alineados los microtubos que contienen los medios
deshidratados (liofilizados). La siembra se realiza con una pipeta a partir de una suspensión
bacteriana procedente de un cultivo puro. Algunos microtubos se cubren con parafina para
crear anaerobiosis. Procurar no producir burbujas, mezclar líquido de microtubos distintos,
ni llenar los microtubos demasiado, salvo indicación.
Pruebas complementarias:
Procedimiento:
Tabla 6.2
TEST SUBSTRATO REACCION O RESULTADOS
ENZIMAS NEGATIVO POSITIVO
ONPG Ortonitrofenol- ß-galactosidasa incoloro amarillo (1)
galactosido
GLU Glucosa fermentación / oxidación (4) azul/ azul verdoso amarillo o gris
CIT citrato sódico utilización del citrato verde palido/ amarillo azul-verde/ azul (3)
OXI (7) En microtubo: citocromo oxidasa incoloro / violeta claro violeta oscuro (2
ONPG o H2S min)
NO2 (8) En microtubo: reducción de nitratos a NO2 amarillo (2-3 min) violeta
GLU reducción a gas N2 (+Zn) rojo amarillo
(1) Un amarillo muy pálido debe considerarse como positivo.
(2) La producción de H2S puede variar de un depósito negro denso a una línea negra muy fina alrededor del
fondo del tubo. Examinar cuidadosamente el fondo del tubo antes de considerar la reacción negativa. Un viraje a
marrón del medio es una reacción negativa a menos que haya un depósito negro. Esto sucede con organismos
TDA positivos.
(6) IND - añadir 1 gota de reactivo de Kovacs. La reacción se leerá a los dos minutos después de añadir el
reactivo de Kovacs. Después de varios minutos, el HCl liberado por el reactivo de Kovacs puede reaccionar con
el material plástico de la cúpula resultando un cambio de amarillo (negativo) a rojo pardusco (se continúa
considerando negativo).
(7) Añadir en el microtubo H2S o ONPG 1 gota de tetrametil-p-fenilendiamina al 1 %. Esperar 20 min antes de
considerar la reacción negativa.
(8) NO2 - añadir en el microtubo GLU 2 gotas de ácido sulfanílico al 0,8 % y 2 gotas de
N,N dimetil-alfa-naftilamina al 0,5 %. Antes de añadir los reactivos, observar si el tubo GLU (positivo o
negativo) presenta burbujas. Estas burbujas son indicio de la reducción de nitratos a N2. Después de haber
añadido los reactivos de reducción de nitratos, confirmar un posible test negativo añadiendo polvo de zinc. Un
color rojo después de 10 min confirma la reacción negativa, un color amarillo indica la reducción de los nitratos
a un estado de nitrógeno.
6 - PRUEBAS BIOQUÍMICAS 96
Codificación del germen. Sumando los 3 valores obtenidos en cada triada se obtiene un
número. Con la secuencia de 4 números encontrados, se busca en las tablas a que bacteria
corresponde. Tabla 6.3.
ONPG GLU ARA LDC ODC CIT H2S URE TDA IND OX NO2
+ + + - - + + - - - - +
| | | | | | | | | | | |
1 2 4 0 0 4 1 0 0 0 0 4
\ | / \ | / \ | / \ | /
\ | / \ | / \ | / \ | /
7 4 1 4
6 - PRUEBAS BIOQUÍMICAS 97
POSITIVO a ONPG: descartamos como candidatas a las bacterias que nunca dan
positivo (0 % de pruebas), Edward tarda y P.vulgaris.
NEGATIVO a NO2: descartamos las que siempre dan positivo (100 % de pruebas),
E.coli, Shigella sp., Edward tarda, Salmonella sp., K. neumoniae, etc.
Este descarte de bacterias permite reducir el número de candidatas. Suponiendo que después
de aplicar este criterio selectivo se centraran las posibilidades en las bacterias siguientes:
K.oxytoca, P. rettgeri y Y. enterocolitica.
0,0002940
P.rettgeri = 0,2542495 % 100 = 0, 11 %
0,2535607
Y.enterocolítica = 0,2542495 % 100 = 99, 72 %
O G A L O C H2S U T I O N
N L R D D I R D N X O
P
G
U A C C T E A D I 2
E. coli 95 100 83 77 70 0 3 1 0 94 0 10
0
Shigella sp. 26 99 50 0 0 0 0 0 0 38 0 10
0
Edward. tarda 0 100 1 100 100 0 94 0 0 100 0 10
0
Salmonella sp. 3 100 94 96 95 74 85 0 0 3 0 10
0
C. freundii 93 100 96 0 32 62 65 3 0 6 0 98
K. pneumoniae 99 99 99 74 0 95 0 63 0 0 0 10
0
K. oxytoca 99 99 96 86 1 84 0 60 0 100 0 10
0
E. cloacae 99 100 99 1 96 94 0 1 0 0 0 10
0
H. alvei 71 99 90 100 97 13 0 4 0 0 0 10
0
S. liquefac. 98 100 98 87 99 85 0 5 0 0 0 10
0
S. marcescens 94 100 19 98 95 97 0 28 0 1 0 95
S. odorífera 95 100 95 97 43 87 0 0 0 99 0 99
P. mirabilis 1 96 1 1 98 57 83 99 98 2 0 93
P. vulgaris 0 97 1 0 0 31 83 98 99 94 0 10
0
Prov. rettgeri 1 99 1 0 0 70 0 98 99 90 0 98
Y. enterocolítica 81 99 69 0 90 0 0 93 0 66 0 98
Formación de acetoína
Fermentación glucosa
VP (F. butanodiólica)
Fermentación lactosa
RM (F. ácido mixta)
Formación de indol
Formación de gas
Agar Mc Conkey
A. Fenilalanina
Agar Citrato
Proteólisis
Agar KIA
H2S
Considerando que los medios satisfacían todos los requerimientos químicos de los
metabolismos de los diversos microorganismos.
De acuerdo con el esquema que refleja los diversos tipos de crecimiento que ha habido en
cada tubo, explica que tipo de microorganismo ha crecido y que metabolismo ha
utilizado.
fotolitotrofo Champiñón
fotoórganotrofo Lechuga
Quimiolitotrofo Escherichia coli
Quimioórganotrofo Bacterias nitrificantes
6 - PRUEBAS BIOQUÍMICAS 102
10. ¿Qué información del metabolismo de una bacteria nos permite conocer la siembra por
picadura en un agar KIA, respecto a:
a. Tipo de sustrato que ha fermentado
b. Exigencia de O2
c. Tipos de enzimas que posee la bacteria
11. ¿Qué procesos bioquímicos se pueden observar en un hemocultivo tipo Agar sangre?
23. Las enterobacterias son anaerobias facultativas. Pueden obtener energía por respiración y
por fermentación.
25. En una fermentación, los nitratos pueden actuar como aceptores finales de electrones.
26. En la respiración anaeróbica el amonio no puede actuar como aceptor final de electrones.
29. Todas las bacterias aerobias o anaerobios facultativos darán positivo con la catalasa.
31. Una bacteria que de negativo a las pruebas de oxidasa y catalasa será anaerobia estricta.
32. De acuerdo con los perfiles bioquímicos correspondientes (tabla 6.4 ), justifica el
comportamiento previsto en el agar KIA (superficie/fondo/gas/H2S) , de las bacterias:
E.coli, Salmonella sp., Proteus vulgaris
6 - PRUEBAS BIOQUÍMICAS 104
33. Consulta los resultados que se obtienen en el agar TSI (pag. 87-88) con Pseudomona
aeruginosa. Describe los procesos bioquímicos que se habrán producido
34. Consultando la tabla pag. 83, justifica la procedencia del nombre de la bacteria
"enterobacter aerogenes".
ONPG GLU ARA LDC ODC CIT H2S URE TDA IND OX N02
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