Inovasi pemrograman ulang sel somatik untuk diinduksi sel induk pluripoten memberikan pendekatan

baru mungkin untuk mengobati β-thalassemia dan penyakit genetik lainnya seperti anemia sel sabit.
Induced pluripotent batang (iPS) sel dapat dibuat dari sel somatik pasien 'dan mutasi pada gen β-globin
dikoreksi oleh gen penargetan, dan sel-sel dibedakan menjadi sel hematopoietik harus dikembalikan
kepada pasien. Dalam studi ini, kita memprogram fibroblas kulit seorang pasien dengan talasemia
homozigot β0 ke iPS sel, dan menunjukkan bahwa sel iPS dapat dibedakan menjadi sel-sel
hematopoietik yang sintesis hemoglobin. Prenatal diagnosis dan aborsi selektif sudah efektif dalam
mengurangi jumlah kelahiran β-thalassemia di beberapa negara yang telah memberlakukan carrier
skrining dan konseling genetik. Untuk memanfaatkan sel-sel dari cairan ketuban atau Chorionic villus
sampling yang digunakan untuk diagnosis pralahir, kami juga menunjukkan bahwa sel-sel ini dapat
memprogram ke iPS sel. Hal ini meningkatkan kemungkinan memberikan opsi baru berikut diagnosis
pralahir janin dipengaruhi oleh penyakit parah. Saat ini, orang tua akan memilih untuk mengakhiri
kehamilan atau melanjutkan dan mengurus anak yang sakit setelah lahir. Sel-sel untuk diagnosis pralahir
dapat dikonversi menjadi iPS sel untuk pengobatan pada periode perinatal. Pengobatan awal memiliki
keuntungan dari sel-sel yang membutuhkan jauh lebih sedikit dibandingkan pengobatan dewasa, dan
juga dapat mencegah kerusakan organ dalam penyakit-penyakit di mana kerusakan dapat dimulai di
dalam rahim atau pada usia dini.

    * Amniosentesis
    * Villus sampling chorionic
    * Diferensiasi hematopoietik
    * Hemoglobin

Worldwide, Thalassemia merupakan salah satu penyakit genetik yang paling umum. Ini mempengaruhi
orang-orang yang berasal dari daerah Mediterania melalui Timur Tengah ke anak benua India dan Asia
Tenggara (1). Para sindrom talasemia secara luas diklasifikasikan menjadi 2 kelompok: α-talasemia, di
mana sintesis rantai globin α-rusak, dan β-thalassemia, yang dihasilkan dari sintesis β-globin rusak. α-
talasemia ini paling sering disebabkan oleh delesi gen yang mempengaruhi satu atau kedua lokus globin
α-diduplikasi. Bentuk parah α-thalassemia, umum di Asia Tenggara, disebabkan oleh penghapusan gen
α-globin digandakan, dan mayoritas homozigot janin mati di trimester ketiga kehamilan atau kelahiran.
Pada β-thalassemia, cacat molekul umum adalah hasil dari mutasi titik atau penghapusan kecil yang
mempengaruhi transkripsi, splicing, atau menerjemahkan mRNA. Bayi yang baru lahir dengan talasemia
β homozigot-sehat, tetapi sebagai hemoglobin akan beralih dari janin untuk hemoglobin dewasa setelah
lahir, kurangnya hasil β-globin pada anemia progresif. Meskipun tingkat anemia dapat bervariasi,
tergantung pada derajat kekurangan β-globin dan jumlah hemoglobin sintesis janin, banyak pasien
dengan β-thalassemia mengalami anemia berat dan memerlukan transfusi darah seumur hidup. Karena
transfusi darah yang diberikan oleh kaya zat besi, pasien memerlukan terapi khelasi besi sepanjang
hidup. Oleh karena itu, β-Thalassemia menimbulkan risiko kesehatan yang parah dan beban ekonomi
untuk keluarga beresiko.

Obat untuk β-thalassemia dapat dicapai dengan transplantasi sumsum tulang atau tali darah jika donor
histocompatible tersedia (2, 3). Namun, karena keluarga pasien 'biasanya kecil, donor tidak umum
ditemukan. Selanjutnya, penyakit graft versus host variabel keparahan umumnya mengikuti.
Pencegahan kelahiran baru dengan talasemia homozigot-β telah dicapai dengan diagnosis pralahir. Di
negara-negara seperti Italia, Yunani, dan Siprus, skrining pembawa, konseling genetik, diagnosis pralahir,
dan aborsi selektif dari janin homozigot secara efektif menurunkan jumlah kelahiran dengan homozigot-
talasemia β.

Pendekatan eksperimental untuk pengobatan terapi gen β-thalassemia dan anemia sel sabit.
Menggunakan vektor lentiviral mengekspresikan gen β-globin untuk transduce sel hematopoietik ex
vivo, beberapa kelompok peneliti telah berhasil merawat mouse model β-thalassemia atau anemia sel
sabit (4-6). Sebuah percobaan manusia dikatakan melanjutkan di Eropa (7).

The (8-10) reprogramming sel somatik ke dalam sel-sel induk induced pluripoten (iPS) membuka
pendekatan baru mengobati β-thalassemia. sel iPS telah dibuat dari berbagai jaringan, termasuk
fibroblas kulit, hepatosit, perut, testis, dan sel-sel saraf (11-14). Selain itu, sel iPS juga telah dibuat dari
sel somatik pasien dengan sejumlah penyakit termasuk kekurangan deaminase adenosin, penyakit
Gaucher, dystrophies otot, penyakit Parkinson, penyakit Huntington, diabetes mellitus tipe 1,
amyotrophic lateral sclerosis, dan Down dan Lesch -Nyhan sindrom (15-17). Sel-sel ini iPS menyediakan
sarana belajar patofisiologi serta pendekatan untuk pengujian agen terapi untuk penyakit. Sebagai β-
Thalassemia adalah penyakit genetik yang sangat umum, kita meneliti pemrograman ulang sel somatik
dari pasien dengan β-thalassemia ke iPS sel. β-thalassemia, seperti anemia sel sabit, tampaknya menjadi
calon yang baik untuk terapi sel iPS. Mutasi gen β-globin dari kebanyakan pasien diketahui, dan pada
anemia sel sabit, mereka dapat diperbaiki dengan teknik penargetan gen (18, 19), dan sel-sel iPS
dibedakan menjadi sel-sel hematopoietik yang, pada gilirannya, dapat kembali ke pasien untuk
pengobatan. Memang, anemia sel sabit disembuhkan dengan cara ini dalam model tikus (20).

Kesempatan lain untuk terapi sel iPS terletak pada periode perinatal. Ketika diagnosis pralahir penyakit
genetik yang terkait dengan penyakit parah dibuat, orang tua memilih untuk mengakhiri kehamilan atau
untuk melanjutkan dan merawat anak dengan penyakit seumur hidup. Dalam kebanyakan kasus, orang
tua akan memilih pengakhiran. Sel-sel dari cairan ketuban (AF) atau sampel chorionic villus (CVS) yang
digunakan untuk diagnosis pada akhirnya dibuang. Jika sel-sel ini dapat diprogram ke dalam sel iPS,
mereka dapat digunakan untuk pengobatan awal janin terkena selama periode perinatal.

Dalam studi ini, kita diselidiki (i) generasi iPS sel dari fibroblas kulit dari pasien dengan talasemia
homozigot-β dan (ii) metode membedakan sel iPS menjadi sel-sel hematopoietik yang mensintesis
hemoglobin. Selain itu, kami juga mempelajari kelayakan pemrograman ulang AF dan sel CVS menjadi
sel-sel iPS yang dapat digunakan untuk pengobatan awal talasemia, anemia sel sabit, dan penyakit
genetik lainnya.

RESULT

Pemrograman Ulang β-Thalasemia fibroblast.

Kultur fibroblas dari biopsi kulit berasal dari pasien dengan β0-talasemia yang homozigot untuk bp
41/42 kodon 4-(CTTT) penghapusan. mutasi ini menyebabkan frameshift dan tidak ada rantai globin β-
dibuat. Sel dari CVS dan amniocentesis diperoleh anonim dari laboratorium klinis di University of
California San Francisco.

Dua jenis infeksi diciptakan dalam generasi iPS sel dari fibroblast kulit dengan vektor retroviral. Dalam
satu, fibroblast kulit terinfeksi dengan vektor retroviral yang berisi gen faktor 4 transkripsi (Oct4, Sox2,
Klf4, dan cMyc), dan yang lainnya dengan 3 gen menghilangkan cMyc. Dengan penambahan asam
valproik dalam medium kultur, sekitar 450 dan 50 koloni padat mirip dengan koloni sel ES manusia mulai
bermunculan pada 2 sampai 3 minggu (21) setelah infeksi 1 × 105 sel dengan 4 dan 3 gen faktor, masing-
masing . Empat puluh dari 4-koloni faktor diinduksi (4sy series) dan 30 dari 3-koloni faktor diinduksi (3sy
seri) yang dipanen pada 30 sampai 35 hari setelah infeksi. Tiga puluh lima dari 4 koloni faktor yang
terinfeksi dan 28 dari 3 koloni faktor yang terinfeksi bisa diperluas dan menunjukkan morfologi yang
sama seperti batang embrionik manusia (ES) sel. Mereka menyatakan spidol pluripotency, seperti
Nanog, SSEA3, SSEA4, Tra-1-60, dan Tra-1-81, serta fosfatase alkali, mirip dengan sel-sel ES manusia
(Gbr. 1). Analisis Western blot koloni ini menunjukkan tingkat yang sama Nanog ekspresi dibandingkan
dengan sel-sel ES manusia (data tidak ditampilkan). Sel-sel ini dapat dipertahankan dalam keadaan
dibeda-bedakan pada pelat Matrigel-dilapisi dalam medium ES fibroblas embrio tikus-AC sel manusia.
Beberapa koloni telah dibudidayakan selama lebih dari 4 sampai 7 bulan di laboratorium kami.
Gambar. 1.

koloni sel iPS memprogram dengan 3 faktor (3sy) atau 4 faktor (4sy) dari fibroblast kulit pasien dengan
talasemia homozigot-β (β-thal) dibandingkan dengan koloni hESC (HES). Mereka patri untuk fosfatase
alkali (AP, Inset) dan spidol sel ES Nanog, SSEA3, SSEA4, Tra-1-60, dan Tra-1-81.
Untuk mengkonfirmasi bahwa garis iPS dihasilkan sel berasal dari fibroblas kulit pasien talasemia β-
teman, analisis sekuensing DNA genom dilakukan dalam 5 baris sel individu iPS. Homozigot kodon 41/42
4-bp (CTTT) delesi telah diverifikasi di semua 5, identik dengan urutan fibroblas kulit (Gbr. 2A). Kariotipe
dari 5 baris iPS individu setelah 5 bagian normal, dan 1 dikultur selama 15 ayat-ayat tambahan juga
ditemukan untuk mempertahankan kariotipe normal (Gambar 2B).
Gambar. 2.

Analisis Sequence (A) dan kariotipe (B) iPS sel memprogram dari fibroblas dari pasien dengan β-
thalassemia.
Untuk menguji pluripotency dari iPS sel yang dihasilkan in vivo, kita disuntikkan 106 iPS sel
intramuskular ke kaki belakang mencit imunodefisiensi (NOD-SCID). Tujuh minggu setelah injeksi,
pembentukan tumor diamati. Analisis histologi tumor mengungkapkan bahwa mereka mengandung
jaringan perwakilan dari semua 3 lapisan kuman termasuk epitel pernapasan dan usus seperti ciliary
(yaitu, endoderm), tulang dan otot (misalnya, mesoderm), dan saraf dan kelenjar sebasea (yaitu,
ektoderm; Gb 3)..
Gambar. 3.

Photomicrographs H & E noda teratoma terbentuk pada tikus NOD-SCID setelah penyuntikan sel iPS dari
pasien dengan menunjukkan pasien β-thalassemia (A) jaringan heterogen di bawah kekuasaan rendah
(perbesaran × 4), (B) epitel pernafasan, (C) tulang , dan (D) jaringan saraf (perbesaran × 20).
Kami menyelidiki kemampuan sel iPS untuk membedakan ke dalam sel hematopoietic. sel tunggal dibuat
dari salah satu koloni iPS β-thalassemia dengan Accutase enzim. Setelah pencucian, sel-sel resuspended
dalam medium diferensiasi pertama, yang adalah medium basal, SFM ditambah dengan protein tulang
manusia rekombinan morphogenetic 4, manusia VEGF (hVEGF), stem sel faktor manusia (hSCF), Flt3
manusia, IL3 manusia, manusia IGF-II, dan TPO (22). badan embryoid (EBS) yang dibuat oleh plating sel-
sel di piring 96 V-bawah-baik dan disentrifugasi menurut metode Ng et al. (23, 24). Awalnya, kami
mengoptimalkan pembentukan EB oleh plating 5.000, 10.000, dan 20.000 sel dalam sumur. EBS
dibentuk dalam sumur, dimana jumlah sel lebih besar dari 10.000. Setelah inkubasi pada suhu 37 ° C dan
CO2 5% selama 10 sampai 14 d, EBS kemudian tunggal ditempatkan di piring kultur jaringan gelatinized
dan diijinkan untuk dibedakan lebih lanjut ke garis keturunan hematopoietic pada medium diferensiasi
sekunder, yang MHL-dilengkapi dengan hVEGF, hSCF , Flt3 manusia, IL6 manusia dan eritropoietin
manusia. Beberapa sel fibroblast-seperti tumbuh dan menyebar keluar dari kanan EBS pergi dan bulat
beberapa, sel tidak patuh muncul di beberapa sumur setelah 4 sampai 5 inkubasi d dan
"hemoglobinized" koloni yang nyata dengan inkubasi lebih lama. Setelah 2 minggu, sel-sel ini tidak patuh
telah dihapus, berputar di atas slide, dan diwarnai dengan antibodi hemoglobin F. Sel-sel dari sumur
yang mengandung koloni hemoglobinized menunjukkan positif pewarnaan dengan antibodi terhadap F
hemoglobin (Gbr. 4).