Anda di halaman 1dari 14

PENGAMATAN MORFOLOGI BAKTERI DENGAN PENGECATAN GRAM

BAB I

Tujuan Praktikum

1.1 Tujuan Praktikum

Adapun tujuan dari praktikum yang dilakukan adalah:

Untuk membedakan bakteri yang bersifat Gram positif dan Gram negative

BAB II

TEORI

Christian Gram (1884) menemukan prosedur pengecatan Gram. Pengecatan ini merupakan salah satu
prosedur yang amat penting dan paling banyak digunakan untuk klasifikasi bakteri. Dengan menggunakan
metode ini, bakteri dapat dipisahkan secara umum menjadi dua kelompok besar, yaitu:

1. Organism yang dapat menahan kompleks pewarna primer gentian violet sampai pada akhir prosedur (sel-sel
tampak biru gelap atau ungu), disebut Gram positif;

2. Organism yang kehilangan kompleks warna ungu Kristal pada waktu pembilasan dengan alcohol (sehingga
bila diperiksa ternyata kosong) namun demikian terwarnai oleh pewarna tandingan, fuchsin/safranin (sel-sel
tampak merah muda), disebut Gram negative.

Diketahui bahwa komposisi dinding sel bakteri Gram positif berbeda dari bakteri Gram negative. Dinding sel
yang lebih tebal pada bakteri Gram positif menyusut oleh perlakuan alcohol karena terjadinya dehidrasi,
menyebabkan pori-pori dinding sel menutup sehingga mencegah larutnya kompleks gentian violet pada
langkah pemucatan. Di lain pihak, sel-sel Gram negative mempunyai kandungan lipid yang lebih tinggi pada
dinding selnya dan lipid pada umumnya larut dalam alcohol dan aseton. Larutnya lipid oleh pemucat yang
digunakan dalam pewarnaan Gram diduga memperbesar pori-pori dinding sel sehingga proses pemucatan
pada sel-sel Gram negative berlangsung lebih cepat.

Contoh-contoh bakteri Gram positif antara lain Bacillus subtilis, Streptococcus lactis, dan Staphylococcus
aureus, sedangkan bakteri Gram negative antara lain Corynebacterium diptheri, E. coli, dan Salmonella
typhosa.

Gambar perbedaan bakteri Gram positif dan Negatif

Beberapa ciri bakteri gram positif dan negative

Ciri Gram Positif Gram Negatif

Struktur Dinding Sel Tebal (15 – 80nm) Tipis (10 – 15nm)

Berlapis tunggal (mono) Berlapis tiga (multi)


Komposisi dinding sel Kandungan lipid rendah Kandungan lipid tinggi

Peptidoglikan ada sebagai lapisanPeptidoglikan ada di dalam lapisan


tunggal; komponen utamakaku sebelah dalam; jumlahnya
merupakan >50% berat kering padasedikit, merupakan sekitar 10% berat
beberapa sel bakteri kering

Asam tekoat Tidak ada asam tekoat


Kerentanan terhadap penisilin Lebih rentan Kurang rentan

Pertumbuhan dihambat oleh zat- Pertumbuhan dihambat denganPertumbuhan tidak begitu dihambat
zat warna dasar, misalnya ungu nyata
kristal

Persyaratan nutrisi Relative rumit pada banyak spesies Relative sederhana

Resistensi terhadap gangguan fisik Lebih resisten Kurang resisten

Dinding sel bakteri gram negative mengandung peptidoglikan jauh lebih sedikit, dan peptidoglikan ini
mempunyai ikatan silang yang jauh kurang ektensif dibandingkan dengan yang dijumpai pada dinding bakteri
gram positif. Karenanya, maka pori-pori pada peptidoglikan bakteri gram negative tetap cukup besar sekalipun
setelah perlakuan etanol sehingga memungkinkan ekstraksi kompleks UK-Y (Ungu Kristal Yodium). UK-Y
terperangkap di dalam dinding, yang tampaknya mengurangi diameter pori-pori pada peptidoglikan dinding
sel.

Bila sel-sel gram positif diberi perlakuan dengan enzim lisozim untuk menyingkirkan dinding sel setelah
pewarnaan dengan kompleks UK-Y, maka struktur yang dihasilkannya itu akan terwarnai oleh kompleks UK-Y.
namun, mereka tidak mudah dipucatkan oleh etanol. Semua ini merupakan bukti bahwa dinding sel pada
bakteri gram positif merupakan situs tempat zat warna ungu Kristal tertahan.

BAB III

Alat & Bahan

3.1 Alat dan Bahan

1. Biakan murni Azotobacter chroococcum dan Bacillus subtilis

2. Zat warna karbol gentian violet, fuchsin/safranin

3. Larutan lugol (I + K + air), alcohol 95%, minyak imersi

4. Gelas objek, Ose, Lampu spiritus, kertas saring

5. Mikroskop

BAB IV

Cara Kerja

4.1 Cara Kerja

1. Buat film seperti pada praktikum I

2. Tambahkan karbol gentian violet selama 3 menit


3. Cuci dengan air dengan mengalirkan air dari botol semprot

4. Tambahkan larutan lugol selama 1 menit

5. Tambahkan 2 – 3 tetes alcohol biarkan 30 detik sampai tidak ada zat warna yang larut

6. Cuci dengan air, tambahkan fuchsin/safranin selama 1 – 2 menit

7. Cuci dengan air, keringkan dengan kertas saring

8. Amati di bawah mikroskop dengan perbesaran lensa objek 100x

9. Catat dan gambar morfologi dan warna sel. Bakteri gram positif akan berwarna ungu, sedangkan gram
negative akan berwarna merah.

BAB V

Hasil Pengamatan

Pengecatan gram

Spesies bakteri: Azotobacter chroococcum

Bentuk: kokus

Zat warna yang digunakan: (1) carbol gentian violet, (2) fuchsin

Jenis gram: bakteri gram negative

Hasil warna setelah dilihat dengan mikorskop: merah

Bakteri hasil praktikum Bakteri dari website

Spesies bakteri: Baccilus subtilis

Bentuk bakteri: basilus

Zat warna yang digunakan: (1) carbol gentian violet, (2) fuchsin

Jenis gram: bakteri gram positif

Hasil warna setelah dilihat dengan mikorskop: ungu

Bakteri praktikum Bakteri dari website

Dari hasil pengamatan di atas bakteri Azotobacter chroococcum memiliki bentuk kokus setelah diamati dengan
mikroskop. Jika diambil dari website, bakteri Azotobacter chroococcum juga memiliki bentuk kokus, sehingga
dapat diambil kesimpulan bahwa bakteri Azotobacter chroococcum memiliki bentuk kokus.

Sedangkan dari hasil pengamatan bakteri Baccilus subtilis memiliki bentuk batang/basilus setelah diamati
dengan mikroskop. Dibandingkan dengan yang diambil dari website, dapat dilihat bahwa bakteri Baccilus
subtilis juga berbentuk batang/basilus sehingga dapat diambil kesimpulan bahwa bakteri Baccilus subtilis
memiliki bentuk batang.
Dalam praktikum ini dapat juga kita ketahui jenis gram pada bakteri tersebut, apakah gram negative atau gram
positif. Pada bakteri Azotobacter chroococcum, jenis gram-nya adalah gram negative. Hal ini disebabkan warna
pada bakteri tersebut adalah merah. Padahal, jika kita dilihat pada cara kerja, pewarnaan yang pertama kali
adalah penggunaan zat warna carbol gentian violet. Hal ini terjadi karena kehilangan warna carbol gentian
violet ketika dicuci dengan dengan alcohol, dan sewaktu diberi pewarna kedua dengan zat warna fuchsin,
tampak berwarna merah. Dapat diambil kesimpulan bakteri Azotobacter chroococcum termasuk bakteri gram
negative karena bakteri tersebut tidak mampu mempertahankan warna ungu ketika dicuci dengan alcohol. Hal
ini disebabkan oleh dinding sel bakteri tersebut yang lebih sedikit mengandung peptidoglikan dan dinding
selnya lebih tipis, tetapi bakteri gram negative mengandung lipid, lemak atau substansi seperti lemak dalam
persentase lebih tinggi. Perlakuan dengan alcohol terhadap bakteri gram negative menyebabkan
terekstraksinya lipid sehingga memperbesar daya rembes atau permeabilitas dinding sel sel bakteri, sehingga
zat warna ungu tidak dapat ditahan dan kahirrnya keluar dan tercuci alcohol.

Hal yang berbeda terjadi pada bakteri Bacillus subtilis Pada bakteri Bacillus subtilis, jenis gram-nya adalah gram
positif. Hal ini disebabkan warna pada bakteri tersebut adalah ungu. Hal ini terjadi karena warna ungu dapat
ditahan saat pencucian dengan alkohol, dan sewaktu diberi pewarna kedua dengan zat warna fuchsin, bakteri
tetap berwarna ungu. Dapat diambil kesimpulan bakteri Bacillus chroococcum termasuk bakteri gram positif
karena bakteri tersebut mampu mempertahankan warna ungu ketika dicuci dengan alcohol. Hal ini disebabkan
oleh dinding sel bakteri tersebut yang lebih banyak mengandung peptidoglikan dan dinding selnya lebih tebal,
tetapi bakteri gram positif mengandung lipid, lemak atau substansi seperti lemak dalam persentase lebih
rendah. Karena kandungan lipidnya lebih rendah, dinding sel bakteri gram positif menjadi terdehidrasi selama
perlakuan dengan alcohol. Akibatnya ukuran pori-pori mengecil, permeabilitas berkurang, dan zat warna
carbol gentian violet tidak dapat diekstraksi. Karena itu, pada pemberian zat warna yang kedua, yaitu fuchsin,
zat warna tidak dapat memasuki dinding sel bakteri, sehingga bakteri tetap berwarna ungu.

Dari hasil pengamatan, dapat kita lihat pola penataan pada bakteri. Pada bakteri Azotobacter chroococcum,
pola penataan dari hasil praktikum adalah diplokokus, karena bakteri-bakteri tersebut berpasangan, hal ini
sama dengan gambar yang diambil dari website, pola penataannya juga diplokokus. Dapat kita dilihat pada
gambar dibawah bagaimana pola penataan diplokokus (gambar 1). Sedangkan pada bakteri Baccilus subtilis
pola penataannya adalah rantai, karena bakteri tersebut berpasangan dan membentuk rantai. Sedangkan pada
gambar yang diambil dari website, pola penataannya lebih mirip dengan pagar. Dapat dilihat pada gambar di
bawah (gambar 2 dan 3) bagaimana pola penataan rantai dengan pagar pada bakteri berbentuk batang.

Gambar 1 Gambar 2 Gambar 3

BAB VI

Kesimpulan

Bakteri Azotobacter chroococcum pada hasil praktikum termasuk bakteri gram negatif, sedangkan bakteri
Bacillus subtilid termasuk bakteri gram positif. Bakteri Azotobacter chroococcum pada hasil praktikum memiliki
bentuk kokus, sedangkan bakteri Bacillus subtilid memiliki bentuk batang. Bkteri Azotobacter chroococcum
pada hasil praktikum memiliki pola penataan diplokokus, sedangkan bakteri Bacillus subtilid memiliki pola
penataan rantai.
PENGAMATAN MORFOLOGI BAKTERI DENGAN PENGECATAN TUNGGAL

BAB I

Tujuan Praktikum

1.1 Tujuan Praktikum

Adapun tujuan dari praktikum yang dilakukan adalah:

Untuk melihat morfologi (bentuk susunan) bakteri dengan menggunakan satu macam zat warna

BAB II

TEORI

2.1 Morfologi Kasar Bakteri

Sel bakteri amat beragam panjangnya; sel beberapa spesies dapat berukuran 100 kali lebih panjang daripada
sel spesies yang lain.

2.1.1 Ukuran

Satuan ukuran bakteri ialah micrometer yang setara dengan 1/1000mm. bakteri yang paling umum dipelajari di
dalam praktikum mikrobiologi dasar berukuran kira-kira 0,5 – 1 x 2 – 5 µm. sebagai contoh, bakteri stafilokokus
dan streptokokus yang berbentuk bola mempunyai diameter yang berkisar dari 0,75 sampai 1,25 µm. bentuk
batang yang berukuran rata-rata seperti bakteri tifoid dan disentri mempunyai lebar 0,5 – 1 µm dan panjang 2
– 3 µm. Sel beberapa spesies bakteri amat panjang; panjangnya dapat melebihi 100 µm dan diameternya
berkisar daro 0,1 – 0,2 µm. sekelompok bakteri yang dikenal sebagai mikoplasma, ukurannya khas amat kecil –
demikian kecilnya sehingga hamper-hampir tak tampak di bawah mikroskop cahaya. Mereka juga pleomorfik;
yaitu morfologinya amat beragam. Ukurannya berkisar dari 0,1 – 0,3 µm.

Walaupun bakteri amat kecil ukurannya, namun dapat diukur dengan relative mudah serta tepat. Untuk tujuan
ini, mikroskop dilengkapi dengan mikroskop ocular, suatu piringan yang diukir dengan garis-garis berjarak
sama. Jarak antara garis-garis tersebut ditentukan sebelumnya dengan berpedomankan micrometer pentas,
suatu alat yang berfungsi sebagai mistar pada kerja mikroskopis. Pemeriksaan bakteri melalui mikroskop yang
dilengkapi mikroskop ocular akan menampakkan garis-garis yang sudah diketahui ukurannya di atas
mikroorganisme yang diperiksa sedemikian rupa sehingga panjang dan lebar sel dapat ditentukan dengan
mudah.

2.1.2 Bentuk

Sel-sel individu bakteri dapat berbetnuk seperti elips, bola, batang, atau spiral. Masing-masing cirri ini penting
dalam mencirikan morfologi suatu spesies.

Sel bakteri yang berbentuk seperti bola atau elips dinamakan kokus. Kokus mucul dalam beberapa penataan
yang khas tergantung pada spesiesnya. Sel berbentuk silindris atau batang dinamakan basilus. Ada banyak
perbedaan dalam ukuran panjang dan lebar di antara berbagai spesies basilus. Ujung beberapa basilus tampak
persegi, yang lain bundar, dan yang lain lagi meruncing atau lancip seperti ujung cerutu. Kadang-kadang basilus
tetap saling melekat satu sama lainnya, ujung dengan ujung, sehingga memberikan penampilan rantai.

Bakteri berbentuk spiral terutama dijumpai sebagai individu-individu sel yang tidak saling melekat. Tercakup di
dalam kelompok morfologis ini adalah spiroketa, beberapa diantaranya menyebabkan penyakit yang
berbahaya bagi manusia. Individu-individu sel dari spesies yang berbeda-beda menunjukkan perbedaan-
perbedaan yang mencolok dalam hal panjang, jumlah, dan amplitudo spiralnya serta kekakuan dinding selnya.
Sebagai contoh, beberapa spirilum berukuran pendek, spiralnya berpilin ketat; yang lain sangat panjang dan
menunjukkan sederetan pelintiran dan lengkungan. Spiral yang pendek dan tidak lengkap disebut sebagai
bakteri koma, atau vibrio.

2.2.3 Penataan

Spesies-spesies tertentu bakteri menunjukkan adanya pola penataan sel, seperti berpasangan, gerombol,
rantai atau filament.

Pola penataan bakteri berbentuk spiral

Pola Penataan Sel Bakteri Berbentuk Kokus

Pola Penataan Sel Bakteri Berbentuk Batang

Bakteri bersifat transparan dan berukuran sangat kecil sehingga tidak dapat dilihat dengan mata telanjang.
Untuk mengetahui struktur, morfologi, dan sifat kimia bakteri, harus dilakukan pengecatan sel bakteri. Zat
warna yang biasa dijadikan untuk mengecat bakteri adalah methylene blue, basic fuchsin, dan crystal violet.
Zat warna ini menghasilkan ion warna (chromophore) yang bermuatan positif, sehingga bakteri yang
bermuatan negative menarik chromophore kationik.

Terdapat dua jenis zat warna yaitu zat warna asam dan basa. Zat warna basa, contohnya methylene blue
(methylene+ chloride) sedangkan zat warna asam yang mempunyai chromophore anionic seperti eosin(sodium+
eosinate). Zat warna ini tidak dapat dipakai untuk mengecat bakteri. Waktu pengecatan bakteri antara 30 detik
– 2 menit, tergantung pada afinitas zat warna.

Beberapa pengecatan yang kita kenal ialah pengecatan tunggal atau sederhana dan pengecatan majemuk.
Pengecatan tunggal ialah pengecatan yang menggunakan satu macam zat warna saja, misalnya fuchsin, crystal
violet, atau methylene blue, sedangkan pengecatan majemuk ialah pengecatan yang menggunakan lebih dari
satu macam zat warna. Dalam pengecatan majemuk kita kenal pengecatan Gram, Ziehl-Nielsen, Klein, Burn
Gins, dan lain-lain. Pengecatan tunggal hanya bertujuan untuk melihat bentuk sel sedangkan pengecatan
majemuk dapat membedakan karakteristik suatu morfologi.

Sebelum melakukan pengecatan bakteri, dibuat terlebih dahulu film di atas gelas objek dari suspense bakteri.
Tujuan pembuatan film adalah mematikan sel bakteri dengan cepat tanpa merusak morfologinya dan
melekatkan sel bakteri ke permukaan objek.

BAB III

Alat & Bahan

3.1 Alat dan Bahan

1. Biakan bakteri Azotobacter chroococcum & Bacillus subtilis

2. Zat warna carbol fuchsin/carbol gentian violet/methylene blue


3. Gelas objek, Ose, Lampu spiritus, Botol Semprot

4. Kertas saring

5. Minyak imersi

6. Mikroskop

BAB IV

Cara Kerja

4.1 Cara Kerja

Pelaksanaan praktikum ini meliputi dua langkah, yaitu pembuatan film dan pengecatan.

A. Pembuatan Film

Pembuatan film berperan penting dalam pengamatan morfologi. Bakteri yang terlalu bertumpuk atau terlalu
tipis di atas gelas objek akan menghasilkan gambaran yang kurang jelas di bawah mikroskop.

Cara membuat film:

1. Bersihkan gelas objek dengan kapas beralkohol untuk menghasilkan lemak dan mikroba yang
menempel, lalu keringkan di udara.

2. Buat lingkaran kecil di bagian bawah gelas objek untuk membatasi film dengan pensil gelas.

3. Ambil satu ose suspense bakteri secara aseptic, yaitu dengan membakar ose di atas lampu spiritus
sampai memijar, kemudian dinginkan sebentar, lalu tempelkan pada bagian dalam dan tabung biakan
sebelum mengambil suspense bakteri.

4. Buat film setipis mugnkin di atas gelas objek di dalam batasan lingkaran tadi.

5. Lakukan fiksasi dengan cara melakukan film langsung di atas api secara cepat dua sampai tiga kali.
Maksudnya ialah untuk membunuh bakteri secara cepat sehingga tidak mengalami perubahan bentuk. Di
samping itu fiksasi dapat melekatkan bakteri pada gelas objek.

Langkah-langkah pembuatan film di atas senantiasa dilakukan sebelum kita melakukan pengecatan.

B. Pengecatan:

1. Tambahkan salah satu zat warna di atas film dengan waktu yang sesuai, yaitu untuk carbol fuchsin 15 –
20” (detik), carbol geantin violet 30 – 45”, dan methylene blue 3- 5‘ (menit).

2. Buang zat warna tersebut lalu cuci dengan mengalirkan air menggunakan botol semprot untuk
menghilangkan zat warna yang tidak terpakai,

3. Keringkan dengan kertas saring dengan cara ditempelkan perlahan ke atas film yang telah diwarnai.
Jangan menggosok film tadi dengan kertas saring.

4. Tambahkan satu tetes minyak imersi


5. Amati di bawah mikroskop dengan perbesaran kuat (lensa objektif 100x)

6. Catat dan gambar morfologi bakteri.

BAB V

Hasil Pengamatan

Pengecatan tunggal

Spesies bakteri: Azotobacter chroococcum

Zat warna yang digunakan untuk pengecatan tunggal pada bakteri ini adalah fuchsin

Bakteri yang dilihat dengan mikroskop berwarna merah

Bentuk bakteri: kokus

Bakteri hasil praktikum Bakteri dari website

Spesies bakteri: Baccilus subtilis

Zat warna yang digunakan untuk pengecatan tunggal pada bakteri ini adalah carbol gentian violet

Bakteri yang dilihat dengan mikroskop berwarna ungu

Bentuk bakteri: basilus

Bakteri praktikum Bakteri dari website

Dari hasil pengamatan di atas bakteri Azotobacter chroococcum memiliki bentuk kokus setelah diamati dengan
mikroskop. Jika diambil dari website, bakteri Azotobacter chroococcum juga memiliki bentuk kokus, sehingga
dapat diambil kesimpulan bahwa bakteri Azotobacter chroococcum memiliki bentuk kokus.

Sedangkan dari hasil pengamatan bakteri Baccilus subtilis memiliki bentuk batang/basilus setelah diamati
dengan mikroskop. Dibandingkan dengan yang diambil dari website, dapat dilihat bahwa bakteri Baccilus
subtilis juga berbentuk batang/basilus sehingga dapat diambil kesimpulan bahwa bakteri Baccilus subtilis
memiliki bentuk batang.

Yang menjadi perbedaan di antara hasil pengamatan di praktikum dengan gambwr yang diambil dari website
adalah warna bakteri. Hal ini dikarenakan penggunaan zat warna yang digunakan. Pada praktikum, bakteri
Azotobacter chroococcum diberi pewarnaan dengan zat warna fuchsin sehingga pada saat diamati dengan
mikroskop, warna bakteri tersebut adalah merah, karena zat warna fuchsin memberikan pengaruh warna
merah pada proses pengecatan bakteri. Sedangkan dari gambar yang diambil dari website, warna bakteri
adalah ungu, kemungkinan zat warna yang digunakan adalah carbol gentian violet.

Hal yang sama terjadi pada warna bakteri Baccilus subtilis hasil pengamatan di praktikum dan gambar yang
diambil dari website. Warna bakteri hasil pengamatan di praktikum adalah ungu karena zat warna yang
digunakan untuk pengecatan bakteri tersebut adalah carbol gentian violet. Seperti yang kita ketahui, zat warna
carbol gentian violet akan memberikan pengaruh warna ungu pada proses pengecatan. Sedangkan warna
bakteri pada gambar dari website adalah merah. Hal ini disebabkan penggunaan zat warna berbeda. Pada
gambar website, zat warna pada bakteri yang digunakan fuchsin yang memberikan pengaruh warna merah
pada proses pengecatan, sehingga bakteri tersebut berwarna merah.
Dari hasil pengamatan, dapat kita lihat pola penataan pada bakteri. Pada bakteri Azotobacter chroococcum,
pola penataan dari hasil praktikum adalah diplokokus, karena bakteri-bakteri tersebut berpasangan, hal ini
sama dengan gambar yang diambil dari website, pola penataannya juga diplokokus. Dapat kita dilihat pada
gambar dibawah bagaimana pola penataan diplokokus (gambar 1). Sedangkan pada bakteri Baccilus subtilis
pola penataannya adalah rantai, karena bakteri tersebut berpasangan dan membentuk rantai. Sedangkan pada
gambar yang diambil dari website, pola penataannya lebih mirip dengan pagar. Dapat dilihat pada gambar di
bawah (gambar 2 dan 3) bagaimana pola penataan rantai dengan pagar pada bakteri berbentuk batang.

Gambar 1 Gambar 2 Gambar 3

BAB VI

KESIMPULAN

Bakteri Azotobacter memiliki bentuk bulat, sedangkan bakteri Bacilluc subtilis memiliki bentuk batang. Pola
penataan pada bakteri berbeda-beda, pada bentuk kokus pola penataan ada lima, yaitu diplokokus,
streptokokus, tetrakokus, stafilokokus, dan sarsina. Sedangkan pada bakteri berbentuk batang, pola penataan
ada tiga, yaitu berbentuk rantai, pagar, dan roset.
Pengecatan Gram Pada Bakteri

Kebanyakan sel bakteri tidak berwarna, sehingga jika dilarutkan dalam air dan diperlihatkan di bawah
mikroskop tidak memperlihatkan warna kontras dengan medium disekelilingnya. Beberapa zat yang digunakan
untuk mengamati struktur bagian dalam sel. Dalam pewarnaan mikroba, dapat digunakan satu jenis warna,
cara ini disebut pewarnaan sederhana. Zat-zat warna yang biasa digunakan untuk pewarnaan bekteri dapat
dibedakan atas beberapa golongan yaitu: pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial, pewarnaan strukturan
dan pewarnaan untuk menguji adanya komponentertentu di dalam sel (Anonim, 2007)

Karakteristik taksonomi penting bakteri adalah reaksi mereka terhadap pewarnaan gram. Pewarnaan gram
menjadi penting karena reaksi gram berhubungan dengan sifat morfologi lain dalam bentuk hubungan
filogenik. Organisme yang berpotensi gram positif mungkin hanya dapat dilihat dengan pewarnaan gram pada
kondisi lingkungan yang sesuai dan pada biakan muda. Prosedur pewarnaan gram dimulai dengan pemberian
pewarna basa, kristal violet. Larutann iodine kemudian ditambahkan; semua bakteri akan diwarnai biru pada
fase ini. Sel kemudian diberi alkohol. Sel gram positif akantetap mengikat senyawa kristal violet-iodine, tetap
berwarna biru; sel gram negatif warnanya hilang oleh alkohol. Sebagai langkah terakhir, counterstain (misalnya
Safranin pewarna merah) ditambahkan, sehingga sel gram negatif yang tidak berwarna, akan mengambil
warna kontras; sedangkan sel gram positif terlihat dalam warna biru (Jawetz, etc. 2001).
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri
menjadi dua kelompok besar, gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel
mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–
1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri
Klebsiella pneumoniae.

Bakteri gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode
pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan
alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal
(counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna
merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan
perbedaan struktur dinding sel mereka. Banyak spesies bakteri gram-negatif yang bersifat patogen, yang
berarti mereka berbahaya bagi organisme inang. Sifat patogen ini umumnya berkaitan dengan komponen
tertentu pada dinding sel gram-negatif, terutama lapisan lipopolisakarida (dikenal juga dengan LPS atau
endotoksin).

*BAB I*

*PENDAHULUAN*

1.1 Latar Belakang

Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), kokus, dan spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat
maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal,
diplobasil, dan tripobasil. Sedangkan pada kokus dibagi monokokus (satu buah bakteri berbentuk kotak),
diplococcus, sampai staphylococcus (bentuknya mirip buah anggur. Khusus pada spirul hanya dibagi 2 yaitu
setengah melengkung dan tidak melengkung. Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram.
Teknik pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram negatif ditandai
dengan pewarnaan ungu sedangkan yang positif berwarna merah (Textbook, 2008). Hal ini bertujuan untuk
memberikan warna pada bakteri pada akhirnya dapat diidentifikasi dengan mudah. Selain itu, ada endospore
yang bisa diwarnai. Endospora adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena kurang nutrisi,
yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai kondisi menjadi baik (Ncbi, 2008).
Teknik pewarnaan gram haruslah sesuai prosedur karena dapat mengakibatkan kesalahan identifikasi data
apakah gram positif atau gram negatif sehingga diperlukan adanya praktikum ini dilakukan agar mengetahui
jalannya mekanisme pewarnaan gram.

1.2 Perumusan Masalah

Rumusan masalah adalah faktor-faktor apa sajakah yang berpengaruh terhadap keberlangsungan pewarnaan
pada bakteri dan endospora, bagaimanakah karakteristik dari ketiga spesimen, serta bagaimana teknik
pengecatan

1.3 Tujuan
Tujuan praktikum adalah mempelajari proses pewarnaan struktur sel bakteri, mempelajari bentuk-bentuk dan
struktur sel bakteri dan memahami pentingnya setiap langkah dalam prosedur pewarnaan dan memahami
reaksi kimia di dalam prosedur tersebut

*BAB II*

*TINJAUAN PUSTAKA*

Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian gram pada tahun 1884. Dengan metode ini,
bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri gram positif dan gram negatif yang didasarkan dari
reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi
dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai
dinding sel seperti Mycoplasma sp. (Tryana, S.T, 2008).

Struktur bakteri terbagi menjadi dua yaitu:

1. Struktur dasar (dimiliki oleh hampir semua jenis bakteri) Meliputi: dinding sel, membran plasma, sitoplasma,
ribosom, DNA, dan granula penyimpanan

2. Struktur tambahan (dimiliki oleh jenis bakteri tertentu) Meliputi kapsul, flagelum, pilus, fimbria, klorosom,
Vakuola gas dan endospora

Gambar Bakteri Gram Positip dan Bakteri Gram Negatif (Edukasi, 2008).

Staphylococcus adalah bakteri Gram-positif yang berbentuk bola. Bakteri ini ada yang berkoloni dan berbentu
seperti buah buah anggur. Pada tahun 1884, Rosenbach menjelaskan ada dua jenis warna staphylococci yaitu:
Staphylococcus Aureus yang berwarna kuning dan Staphylococcus albus yang berwarna putih. Beberapa
karakterististik yang dimiliki Staphylococcus Aureus diantaranya hemolytic pada darah agar, catalase-oxidase-
positif dan negatif, dapat tumbuh pada suhu berkisar 15 sampai 45 derajat dan lingkungan NaCl pada
konsentrasi tinggi hingga 15 persen dan menghasilkan enzim coagulase. Selain itu,biasanya S. Aureus
merupakan patogen seperti bisul, styes dan furunculosis beberapa infeksi (radang paru-paru, radang kelenjar
dada, radang urat darah, meningitis, saluran kencing osteomyelitis dan endocarditis serta menyebabkan
keracunan makanan yaitu dengan melepakan enterotoxins menjadi makanan sehingga menjadi toksik dengan
melepasan superantigens ke dalam aliran darah (Kenneath, 2008).

Bacillus subtilis merupakan bakteri gram-positif yang berbentuk batang,dan secara alami sering ditemukan di
tanah dan vegetasi. Bacillus subtilis tumbuh di berbagai mesophilic suhu berkisar 25-35 derajat Celsius. Bacillus
subtilis juga telah berevolusi sehingga dapat hidup walaupun di bawah kondisi keras dan lebih cepat
mendapatkan perlindungan terhadap stres situasi seperti kondisi pH rendah (asam), bersifat alkali, osmosa,
atau oxidative kondisi, dan panas atau etanol Bakteri ini hanya memilikin satu molekul DNA yang berisi
seperangkat set kromosom. DNAnya berukuran BP 4214814 (4,2 Mbp) (TIGR CMR). 4,100 kode gen protein.
Beberapa keunggulan dari bakteri ini adalah mampu mensekresikan antibiotik dalam jumlah besar ke luar dari
sel (Scetzer, 2006).

Menurut Kenneath tahun (2008), Escherichia coli termasuk dalam famili Enterobacteraceae yang termasuk
gram negatif dan berbentuk batang yang fermentatif. E. coli hidup dalam jumlah besar di dalam usus manusia,
yaitu membantu sistem pencernaan manusia dan melindunginya dari bakteri patogen. Akan tetapi pada strain
baru dari E.coli merupakan patogen berbahaya yang menyebabkan penyakit diare dan sindrom diare lanjutan
serta hemolitik uremic (hus). Peranan yang mengguntungkan adalah dapat dijadikan percobaan limbah di air,
indikator pada level pencemaran air serta mendeteksi patogen pada feses manusia yang disebabkan oleh
Salmonella typhi. (Mikrolibrary, 2008). Endospore adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres
karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai kondisi menjadi
baik (Ncbi, 2008).

Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat
menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram negatif ditandai dengan pewarnaan ungu sedangkan yang
positif berwarna merah (Textbook, 2008).

BAB III

*METODE PENELITIAN*

3.1 Waktu dan Tempat

Praktikum “Pewarnaan Sel (Bakteri dan Jamur) dan Pewarnaan dan Endospora” dilaksanakan pada hari Rabu
24 September 2008 pukul 13.00-16.00 WIB di Laboratorium Mikrobiologi, Jurusan Biologi, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya, Malang.

*3.2 Cara Kerja*

*3.2.1 Pewarnaan Bakteri*

Gelas objek dan gelas penutup dibersihkan dengan alkohol 70% kemudian ditetesi dengan aquades steril.
Kemudian dibuat apusan dari biakan miring dan disuspensikan sampel sampai homogen, lalu difiksasi di atas
api bunsen. Apusan bakteri yang telah jadi ditetesi gram A selama 1 menit, dicuci denan air mengalir, dan
dikeringanginkan. Kemudian ditetesi gram B selama 1 menit, dicuci dengan air mengalir, dan dikeringanginkan.
Kemudian ditetesi gram D selama 30 detik, dicuci dengan air mengalir, dan dikeringanginkan. Lalu diamati
dengan mikroskop dengan perbesaran 1000 x, kemudian dicatat bentuk dan warna sel bakteri

*3.2.2 Pewarnaan Endospora*

Gelas objek dan gelas penutup dibersihkan dengan alkohol 70% kemudian ditetesi dengan aquades steril.
Kemudian dibuat apusan dari biakan miring dan disuspensikan sampel sampai homogen, lalu difiksasi di atas
api bunsen. Apusan bakteri digenangi dengan pewarna malakit hijau lalu dipanaskan preparat di atas penangas
air mendidih sampai muncul uap air (10 menit) dan dijaga jangan sampai pewarna kering. Kemudian dicuci
dengan air mengalir, dikeringanginkan, diwarnai dengan safranin (1-2 menit) lalu dicuci dengan air mengalir
dan dikeringanginkan lagi. Kemudian diamati ada tidaknya spora dalam sel (bentuk, letak, ukuran terhadap sel
vegetatif) menggunakan mikroskop dengan perbesaran.

BAB IV

*HASIL DAN PEMBAHASAN*

Pewarnaan Bakteri dan Endospora dilakukan dengan menggunakan 8 isolat bakteri untuk 8 kelompok yang
bertujuan untuk mengidentifikasi bentuk kedelapa bakteri tersebut dan termasuk dalam bakteri gram positif
atau negatif dan letak endosporanya. Proses perwarnaan dilakukan dengan membersihkan gelas objek dan
gelas penutup dengan alkohol 70% untuk sterilisasi agar tidak kontaminasi. Kemudian ditetesi aquades steril
untuk meletakkan bakteri dan dibuat preparat apusan dari biakan miring agar mudah diamati dan difiksasi.
Sampel disuspensikan sampai homogen agar bakteri dapat menyebar di gelas objek dan tidak menumpuk.
Kemudian difiksasi di atas api bunsen yang bertujuan untuk membunuh bakteri secara cepat dengan tidak
merubah bentuk dan struktur bakteri,melekatkan bakteri di atas objek gelas dan meningkatkan sifat salinitas
pewarna (Tortora, 2002). Proses pewarnaan bakteri dengan cara apusan bakteri yang telah dibuat kemudian
ditetesi dengan gram A selama 1 menit, gram B selama 1 menit, gram C selama 1 menit, dan gram D selama 30
detik. Setelah perlakuan pewarnaan, preparat selalu dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan, kecuali
setelah pewarnaan gram B preparat dicuci dengan gram C kemudian dikeringanginkan. Hal ini dilakukan
karena gram C mengandung alkohol yang bertujuan untuk melunturkan cat sebelumnya. Gram A mengandung
kristal violet yang berwarna ungu merupakan cat primer yang akan mewarnai bakteri, pewarnaan dilakukan 1
menit agar cat ini dapat melekat sempurna pada dinding bakteri. Gram B mengandung garam iodin merupakan
cat mordan yang berfungsi melekatkan atau memfiksasi cat primer yang diserap bakteri, dilakukan selama 1
menit agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi lebih kuat. Gram C mengandung alkohol sehingga tidak
berwarna dan berfungsi untuk melunturkan cat sebelumnya, dilakukan selama 1 menit agar cat dapat luntur
secara sempurna dan tidak ada yang tersisa. Gram D mengandung safranin sehingga bewarna merah yang
merupakan cat sekunder atau kontras berfungsi untuk memberikan warna bakteri non target, dilakukan
selama 30 detik agar bakteri yang catnya telah luntur dapat terwarnai (Heritage, 2000). Pencucian dengan air
mengalir dimaksudkan agar cat dapat hilang secara sempurna dan tidak tersisa, dikeringanginkan bertujuan
agar warna melekat pada bakteri dan segera kering sehingga bila diwarnai lagi warna sebelumnya tidak
tercampur dengan warna yang baru. Kemudian dilihat di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000 x agar
dapat mengamati bentuk dan warna sel bakteri. Bakteri gram positif akan berwarna ungu, sedangkan bakteri
gram negatif akan berwarna merah.

Proses pewarnaan endospora dilakukan setelah fiksasi dan setelah dibuat apusan preparat. Kemudian preparat
digenangi malakit hijau yang berfungsi sebagai pewarna primer yang digunakan untuk melumuri fiksasi panas
dan dipanaskan sampai menggepul. Preparat dipanaskan di atas penangas air mendidih sampai timbul uap air
(10 menit) bertujuan membantu warna menembus dinding endospora dan dijaga jangan sampai pewarna
kering. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan bertujuan menghilangkan malakit hijau dari
seluruh bagian sel endospora. Pewarnaaan dengan safrani (1-2 menit) bertujuan sebagai counterstain yang
digunakan untuk melumuri bagian warna dari sel yang lain daripada endospora (Prescot, 2002). Kemudian
dicuci dengan air mengalir agar warna safranin luntur dan dikeringanginkan agar warna cepat kering.