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LABORATÓRIO: ______________________________________________________________ POP - 003/01- B
PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO
ALFA-AMILASE
PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO – Bioquímica
Índice
Página Revisão
ÁCIDO ÚRICO - Método Enzimático Colorimétrico - UOD-PAP............................................ 03 00
ALBUMINA - Método Colorimétrico Verde de Bromocresol................................................... 07 00
ALFA-AMILASE - Método Cinético Gal G2 – CNP................................................................ 11 00
BILIRRUBINA DIRETA E TOTAL - Método Colorimétrico Malloy-Evelyn – DMSO………. 16 00
CÁLCIO ASX -Método ARSENAZO III ................................................................................. 20 00
CÁLCIO - Método Colorimétrico (o-CRESOLFTALEÍNA)...................................................... 24 00
CLORO - Método Colorimétrico (Mercúrio – Tiocianato) ...................................................... 28 00
COLESTEROL - Método Enzimático Colorimétrico .............................................................. 32 00
HDL COLESTEROL DIRETO - Método Enzimático Colorimétrico Direto – Sem
precipitação............................................................................................................................. 36 00
HDL COLESTEROL - Método Precipitante – Ácido Fosfotúngstico...................................... 41 00
CREATININA - Método Cinético Colorimétrico...................................................................... 45 00
CREATINO QUINASE (CK-NAC) -Método Cinético – UV..................................................... 50 00
CREATINO QUINASE – MB (CK-MB) - Método Cinético – UV............................................. 54 00
FERRO Ferrozine - Método Colorimétrico............................................................................. 58 00
FERRO CRX - Método Cromazurol B .................................................................................... 62 00
FOSFATASE ALCALINA - Método Cinético Colorimétrico (DGKC – DEA).......................... 66 00
FÓSFORO – UV - Método Molibdato .................................................................................... 70 00
FRUTOSAMINA – Método Cinético Colorimétrico................................................................. 74 00
γ - GLUTAMILTRANSFERASE (GAMA - GT) - Método Cinético Colorimétrico.................... 77 00
GLICOSE - Método Enzimático Colorimétrico ....................................................................... 81 00
MAGNÉSIO MONO - Método colorimétrico - MAGON SULFONADO................................... 85 00
PROTEÍNA TOTAL - Método Colorimétrico .......................................................................... 90 00
PROTEÍNA URINÁRIA - Método Vermelho de Pirgalol......................................................... 94 00
TGO / AST - Método Cinético – UV........................................................................................ 98 00
TGP / ALT - Método Cinético – UV........................................................................................ 102 00
TRIGLICÉRIDES - Método Enzimático Colorimétrico............................................................ 106 00
URÉIA ENZIMÁTICA - Método Enzimático Colorimétrico ..................................................... 110 00
URÉIA UV - Método Cinético Enzimático – UV ..................................................................... 114 00
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PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO – Bioquímica
ÁCIDO ÚRICO
1. INDICAÇÃO MÉDICA
Esta dosagem é utilizada principalmente na avaliação de enfermidades renais, doenças metabólicas genéticas e patologias
como leucemias, linfomas, etc.
Sangue: o ácido úrico é o produto final do metabolismo das purinas, estando elevado em várias situações clínicas além da
gota. Somente 10% dos pacientes com hiperuricemia têm gota. Níveis elevados também são encontrados na insuficiência
renal, etilismo, cetoacidose diabética, psoríase, pré-eclâmpsia, dieta rica em purinas, neoplasias, pós-quimioterapia e
radioterapia, uso de paracetamol, ampicilina, aspirina (doses baixas), didanosina, diuréticos, beta-bloqueadores, dentre
outras drogas. Diminuição dos níveis é encontrada na dieta pobre em purinas, defeitos dos túbulos renais, porfiria, uso de
tetraciclina, alopurinol, aspirina, corticóides, indometacina, metotrexato, metildopa, verapamil, intoxicação por metais
pesados e no aumento do “clearance” renal.
Urina: cerca de 70% do ácido úrico é eliminado pelos rins. Esta dosagem é útil em pacientes com cálculos urinários para
identificação daqueles com excreção urinária de urato aumentada. Álcool causa diminuição do urato urinário. Anti-
inflamatórios, vitamina C, diuréticos e warfarim podem interferir no resultado.
Líquido sinovial: pode ser útil no diagnóstico diferencial de artropatias.
3. PRINCÍPIO DO MÉTODO
No presente método, o ácido úrico da amostra sofre a ação da uricase, na presença de oxigênio, produzindo alantoína e
peróxido de hidrogênio, este em presença de um reagente fenólico (TOOS) e da 4-aminoantipirina, sofre a ação da
peroxidase produzindo um complexo violáceo (quinonimina), com máximo de absorção em 500 nm.
uricase
Ácido Úrico + O2 + 2H2O Alantoína + CO2 + H2O2
peroxidase
2H2O2 + 4-aminoantipirina + TOOS Quinonimina + 3H2O
4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
Preparo do paciente
O paciente deve estar em jejum de, pelo menos, 08 horas.
Amostras
Soro, urina e líquido sinovial. Não usar plasma, pois obtem-se resultados falsamente diminuídos.
Soro: obtido da maneira usual. Separar dentro das próximas 2 horas da coleta. Soros ictéricos ou com hemólise
produzem valores falsamente elevados. O fluoreto inibe a Uricase.
Urina: de 24 horas, separar 10 mL, acertar o pH entre 7,0 e 9,0 com hidróxido de sódio a 5% e aquecer 10 minutos a 56°C
para dissolver os cristais de urato e ácido úrico, evitando resultados falsamente diminuídos. Diluir a urina 1:20 com água
destilada ou deionizada e fazer a determinação. Multiplicar o resultado por 20.
Líquido sinovial: a coleta não deve ser feita antes de decorridos 07 dias da última punção, ou antes de 30 dias após a
administração de medicamento intra-articular.
5. COMPONENTES DO KIT
Reagente: Tampão Fosfato pH, 7.0 – 50 mmol, Uricase 450 U/L, Peroxidase 2500 U/L, 4-aminoantipirina 0,3 mmol/L;
TOOS 0,34 mmol/L e conservantes.
Padrão: Solução de Ácido Úrico (valor da concentração do padrão vide etiqueta do frasco)
6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO
Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo.
Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.
8. CONTROLE DE QUALIDADE
Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.
Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.
9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES
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PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO – Bioquímica
Preparação do reativo:
Reativo pronto pra uso
Procedimento manual
1. Os reagentes devem estar à temperatura ambiente.
2. Pipetar em tubos de ensaio:
3. Agitar bem e incubar os tubos durante 15 minutos à temperatura ambiente (16-25 °C) ou durante 10 minutos a 37°C.
4. Ler a absorbância (A) do Padrão e da Amostra frente ao Branco a 500 nm (490-510nm). A cor é estável durante 30
minutos.
5. Para espectrofotômetros que requeiram volumes de leitura superiores aos indicados, usar 50 μl de amostra ou padrão e
2,0 mL de reagente.
y Os volumes de amostra e de reagentes podem ser modificados proporcionalmente, sem prejuízos para o desempenho
do teste. Os cálculos permanecem inalterados. Em caso de redução dos volumes é fundamental que se observe o
volume mínimo necessário para a leitura fotométrica. Volume de amostra menores que 10 μL (10 microlitros = 0,01 mL)
são críticos em aplicações manuais e devem ser usados com cautela, pois aumentam a imprecisão da medição.
Dosagem na urina:
• Homogeneizar a urina, medir o volume e separar uma amostra de cerca de 20 mL. Ajustar o pH para a faixa entre 7 e 9
com NaOH 5% e aquecer a amostra durante 10 minutos a 56ºC. Este procedimento dissolve cristais de ácido úrico
presentes, evitando resultados falsamente diminuídos.
• Diluir a urina assim tratada 1:10 (0,1 mL de urina + 0,9 mL de água destilada ou deionizada), procedendo à dosagem
como descrito acima para o soro.
• Multiplicar o resultado obtido por 10.
Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).
Cuidados especiais
y Como ocorre com toda reação enzimática, a rigorosa observação do tempo e da temperatura de incubação é de
grande importância para a qualidade dos resultados obtidos.
y Para soro lipêmico e/ou com bilirrubina superior a 10 mg/dL, misturar 1,0 mL de NaCl 0,9% e 0,02 mL de soro. Ler em
520 nm ou filtro verde, acertando o zero com água. Diminuir a absorbância assim obtida, da absorbância do teste e
calcular a concentração.
y Se houver suspeita da presença de ácido ascórbico, deixar o soro em repouso durante 90 minutos antes de iniciar a
dosagem, para que resultados falsamente diminuídos não sejam obtidos.
11. CÁLCULOS
Devido à ótima reprodutibilidade, que pode ser obtida com a metodologia, pode-se utilizar o método do fator:
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PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO – Bioquímica
Valores de referência
Para amostras de Soro e Plasma:
y Homens: 2,5 a 7,0 mg/dL = 148 a 416 mmol/L
y Mulheres: 1,5 a 6,0 mg/dL = 89 a 356 mmol/L
Para amostras de Urina:
y 250 a 750 mg/24horas.
Para amostras de Líquido sinovial:
y Valores próximos ao do soro colhido na mesma ocasião.
Esses valores são unicamente orientativos. Recomenda-se que cada laboratório estabeleça seu próprio intervalo de
referência.
y Linearidade
Reação linear até 20 mg/dL (1190 mmol/L)
Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos
valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.
y Interferências
O ácido ascórbico > 0,3 mmol/L, a hemoglobina > 1g/L e bilirrubina > 15 mg/dL interferem.
A lipemia pode afetar os resultados.
Falsos Valores elevados: acetozolamida, clorotiazida, furosemida, metildopa, fenotiazida, salicilatos, etc.
Falsos Valores baixos: vitamina C (ácido ascórbico), acetohexamida, alopurinol, azatiopina, probemicida, mercaptopurina,
coumarim, estrógenos, sulfinpirazona, etc.
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PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO – Bioquímica
ALBUMINA
Método Colorimétrico
Verde de Bromocresol
1. INDICAÇÃO MÉDICA
Esta dosagem é utilizada na avaliação do estado nutricional, de enfermidades hepáticas avançadas, enfermidades renais e
casos de desidratação grave.
A albumina é uma proteína globular produzida pelo fígado que é o principal componente protéico de um soro humano
normal. Tem diversas funções importantes:
y Transporte de moléculas hidrofóbicas como a bilirrubina e os ácidos graxos. Isto é possível devido a zona
hidrofóbica que existe em sua estrutura. Esta característica é utilizada para dosar a albumina.
y Nutrição;
y Manutenção da pressão osmótica sangüínea;
y Variações nos níveis séricos de albumina não são específicos já que podem ser devido a um grande número de
alterações, no entanto é útil para monitorar o estado do paciente.
Havendo lesão hepática ou renal teremos distúrbios que podem ser resumidos em:
y Hipoalbuminemia: que ocorre nas doenças hepáticas crônicas, na síndrome nefrótica e casos de desnutrição grave.
Essa redução está relacionada a diminuição da síntese hepática ou perda excessiva renal, levando a uma diminuição
da pressão coloidosmótica do plasma provocando um aumento de reabsorção de sódio e água e conseqüentemente
causando edema, icterícia e anemia dilucional.
y Hiperalbuminemia: é observada em casos de desidratação grave e queimaduras externas, onde teremos a perda
excessiva de água causando uma hemoconcentração.
Em algumas situações clínicas, o conhecimento dos níveis de albumina é suficiente e até pode oferecer algumas vantagens
em relação à proteína.
3. PRINCÍPIO DO MÉTODO
A albumina presente na amostra reage com o verde de bromocresol em meio ácido, formando um complexo colorido que é
quantificado espectrofotometricamente.
4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
Preparo do paciente:
O paciente deve estar em jejum de, pelo menos, 08 horas. Realizar a coleta pela manhã
Amostras:
Soro, líquido pleural ou líquido ascítico.
Soro: obtido da maneira usual.
Líquido pleural ou líquido ascítico: O material não é colhido no laboratório. O exame é feito somente com material
enviado até 06 horas depois da coleta.
5. COMPONENTES DO KIT
Reagente: Tampão Succinato 0,88 mmol – pH 4,2 , verde de bromocresol 0,17 mmol/L, azida sódica 9mmol.
Padrão: Solução de Albumina (valor da concentração do padrão vide etiqueta do frasco)
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PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO – Bioquímica
6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO
Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo
Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.
8. CONTROLE DE QUALIDADE
Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.
Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.
9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES
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PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO – Bioquímica
y Usar pipetas de vidro e ponteiras descartáveis separadas para cada amostra, controle (se utilizado) e reagente. Não
trocar as tampas dos frascos de reagentes. Isso evitará contaminação cruzada, o que poderia causar resultados
errôneos.
y O reagente contém azida sódica que é tóxica, portanto, tomar cuidado para evitar a ingestão e no caso de contato com
os olhos, lavar imediatamente com grande quantidade de água e procurar auxílio médico. No descarte do reagente,
usar bastante água, pois a azida pode formar compostos explosivos com tubulações de cobre e chumbo.
Preparação do reativo:
Reativo pronto pra uso
Procedimento manual
1. Pipetar em tubos de ensaio:
Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).
Cuidados especiais
y Para manusear e descartar reagentes e material biológico, aplicar as normas de segurança estabelecidas. Fazer
referência ao Manual ou POP de Segurança.
11. CÁLCULOS
Devido a grande reprodutibilidade, que pode ser obtida com a metodologia, pode-se utilizar o método do fator:
Valores de referência
Os valores são normais entre 3,5 e 4,8 g/dL.
Estes valores são unicamente orientativos. Recomendamos que cada laboratório estabeleça seus próprios intervalos de
referência.
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PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO – Bioquímica
y Linearidade
Reação linear até 6 g/dL
Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos
valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.
y Interferências
A bilirrubina > 25 mg/dL e a hemoglobina > 1 g/L interferem no método.
Falsos Valores elevados: o uso de torniquete por mais de 3 minutos provoca um aumento no valor.
Falsos Valores baixos: plasmas obtidos com heparina, lítio e oxalato de potássio combinando com fluoreto de sódio,
fornecem resultados falsamente diminuídos.
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PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO – Bioquímica
ALFA-AMILASE
Método Cinético
Gal G2 - CNP
1. INDICAÇÃO MÉDICA
Esta dosagem é utilizada na avaliação de enfermidades pancreáticas agudas ou crônicas e no diagnóstico da parotidite
(caxumba).
A α – amilase é uma hidrolase que degrada complexos de carboidratos, sendo, predominantemente, de origem pancreática
e da glândula salivar. São conhecidas duas isoenzimas: a pancreática e a salivar, na proporção de 40:60 em soro de
indivíduos sadios. As dosagens da amilase sérica e urinária são amplamente utilizadas no diagnóstico de doenças do
pâncreas, bem como na investigação da função pancreática. Na maioria dos pacientes com pancreatite aguda, seus níveis
séricos elevam-se duas a 12 horas após o início do episódio, atingindo pico em 24 horas e retornando ao normal entre 48 a
72 horas. A magnitude da elevação sérica não é diretamente relacionada com a gravidade do envolvimento pancreático,
mas indica, com grande probabilidade, um diagnóstico de pancreatite aguda. Aumentos da amilase sérica não são
necessariamente devidos à pancreatite. Tumores de pulmão e de ovário podem produzir hiperamilasemia em torno de 50
vezes do intervalo de referência. Em torno de 25% da amilase sérica é normalmente eliminada na urina. Na insuficiência
renal está aumentada em proporção à extensão do comprometimento renal. Amilase sérica normal pode ser encontrada
(em torno de 20%) em pacientes com pacreatite aguda. Em episódios agudos de pancreatite crônica, níveis de amilase
podem estar ligeiramente aumentados, porém, freqüentemente, permanecem em níveis normais.
A amilase pode ligar-se a proteínas (ex.: imunoglobulinas), formando complexos de alto peso molecular denominados
macroamilases. Isso é caracterizado por amilase sérica elevada e urinária normal e pode ocorrer em indivíduos sadios.
Níveis aumentados
Parotidite
Pancreatite aguda
Macroamilasemia
Gravidez ectópica
Oclusão mesentérica
Queimaduras graves
Lesão de glândula salivar
Doença intra-abdominal (peritonite, apendicite aguda etc.)
Intoxicação alcoólica
Insuficiência renal grave
Obstrução das vias biliares
Obstrução intestinal
Obstrução do canal pancreático
Câncer de pâncreas
Cetoacidose diabética
Neoplasias (pulmão ou ovário)
Níveis diminuídos
Insuficiência pancreática
Fibrose cística avançada
Hepatopatias graves
AMILASE URINÁRIA
Uma quantidade significativa de amilase sérica é excretada na urina e, portanto, elevações séricas serão refletidas na
mesma. A amilase urinária parece atingir níveis mais elevados, persistindo por períodos mais longos, quando comparada
com a sérica. A macroamilasemia se caracteriza por elevação dos níveis séricos de amilase com valores urinários normais.
A relação entre o clearance de amilase/creatinina auxilia no diagnóstico diferencial da macroamilasemia (clearance muito
baixo). A relação normal é de 1% a 4%. Encontra-se aumentada na pancreatite aguda, diminuída na macroamilasemia e
normal ou pouco diminuída na hiperamilasemia salivar.
3. PRINCÍPIO DO MÉTODO
4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
Preparo do paciente
O paciente deve estar em jejum de, pelo menos, 08 horas. Realizar a coleta pela manhã.
Amostras
Pode ser usado soro, urina, líquido pleural ou líquido ascítico.
Soro: obtido da maneira usual.
Urina: de 2 a 24 horas, sem conservantes. Colhido de maneira usual. Quando se determina a amilase na amostra de urina,
deve-se também determinar a creatinina na mesma amostra. O resultado deverá ser reportado com Relação
amilase/Creatinina (U/g), com o objetivo de compensar as variações de atividade da amilase em amostras obtidas de cada
micção.
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PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO – Bioquímica
Líquido pleural ou líquido ascítico: O material não é colhido no laboratório. O exame é feito somente com material
enviado até 06 horas depois da coleta.
5. COMPONENTES DO KIT
Reagente Substrato: Tampão biológico pH 6,00 – 50 mmol/L; Cloreto de sódio – 70 mmol/L; Cloreto de cálcio – 6 mmol/L;
Gal G2 – CNP 2,22 mmol/L
Cuidados especiais:
- Pipetar o substrato com a boca, soprar no substrato, usar material contaminado com saliva e suor e conversar
junto ao frasco destampado são ações que podem contaminar o reagente com quantidades microscópicas de
saliva ou suor, capazes de deteriorar irreversivelmente o substrato.
- Segundo estudos de estabilidade a absorbância do substrato, medida contra a água, apresenta um acréscimo de
0,003 por mês. Elevações repentinas da absorbância do substrato indicam contaminação com saliva ou suor,
capazes de deteriorar irremediavelmente o substrato.
- Não utilizar o reagente quando sua absorbância, medida contra a água em 405 nm, for igual ou maior que 0,005
ou quando mostrar-se turvo ou com sinais de contaminação.
6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO
Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo.
Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.
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PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO – Bioquímica
8. CONTROLE DE QUALIDADE
Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.
Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.
9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES
Preparação do reativo:
Reativo pronto pra uso
OBS: Leituras de absorbância do reativo superiores a 0,600 A com o aparelho zerado em 405 nm com água deionizada
indicam deterioração do reativo.
Procedimento manual
1. Pré-aquecer o Reagente durante alguns minutos, a temperatura desejada.
2. Pipetar em uma cubeta:
4. Anotar a absorbância após 1 minuto e efetuar novas leituras após mais 1, 2 e 3 minutos (A1, A2 e A3 respectivamente).
Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).
11. CÁLCULOS
Para linearidade:
ΔA / min x 7537 a 37oC
Amilase Urinária/Hora
Amilase (U/l) x volume urinário (ml)
Amilase urinária (U/h) =
1000 x tempo de coleta (h)
Relação Amilase/Creatinina
Determinar a atividade da amilase e a concentração da creatinina no soro e em uma amostra de urina e aplicar os
resultados na seguinte fórmula:
Valores de referência:
Para os Líquidos Pleural / Ascítico os valore são iguais aos do soro.Valores maiores que 3 vezes o limite superior de
referência indicam aumento considerável da atividade da amilase sérica. Incluir o procedimento a ser adotado diante de
um resultado crítico.
37ºC
Soro/Plasma < 86 U/L
Urina < 470 U/L
Esses valores são unicamente orientativos. Recomenda-se que cada laboratório estabeleça seu próprio intervalo de
referência.
y Linearidade
A reação é linear entre 10 e 1038 (0,150 a 405nm)U/L. Para valores acima de 1038 U/L, diluir a amostra com solução
salina 0,9% e repetir a dosagem. Multiplicar o valor obtido pelo fator de diluição.Caso sejam encontrados valores
superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos valores de linearidade. Indicar
o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.
y Interferências:
Temperatura de incubação: A determinação deve efetuar-se a 37ºC.
Os anticoagulantes fluoreto, oxalato, citrato e EDTA interferem.
Amostras com hemólises produzem resultados falsamente diminuídos.
Valores de bilirrubina até 20 mg/dL e hiperlipemia (triglicerides até 1500 mg/dL) não interferem.
Falsos Valores elevados: Meperidina, codeína, morfina, álcool, diuréticos, salicilatos, tetraciclina, amostra contaminada.
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Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
y Winn-Deen, E.S., DAVID, H.Sigler E., amd Chavez R., Clin Chem., 34,10,(1988), 2005.
y Rauscher, E., et al, Clin Chem., 31,1:14 (1985)
y I.D.P., Wootton and H. Freeman, Microanalysis Medical Biochemistry (1982).
y CNPG3 Technology: Genzyme Manual, 1-35, Cambridge, 1996;
y Henry JB. Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, Philadelphia: W.B. Saunders
Company, 1996; 525-527.
y Jacobs DS, Kasten Jr BL. Laboratory Test Handbook, Hudson: Lexi-Comp Inc., 1996; 79-80, 91.
y Kaufman RA, Tietz NW. Clin Chem 1980; 26: 846-853.
y Pesce AJ, Kaplan LA. Methods in Clinical Chemistry, St. Louis: The C.V. Mosby Co., 1987; 817-830.
y Rosenblum JL. Clin Chem 1992; 38:920.
y Westgard JO, Barry PL, Hunt MR. Clin Chem 1981; 27: 493-501.
y Alfa-Amilase – Bula do Kit – BioTécnica Ind e Com. Ltda – Revisão Maio/2005.
y Inmetro – Boas Práticas de laboratório Clínico e Listas de Verificação para Avaliação, Qualitymark ed., Rio de Janeiro,
1997.
y Manual de exames – Laboratório Fleury – 1999 – 11-12.
y Manual de exames – Laboratório H. Pardini – 2002 – 58-59
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Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
A bilirrubina é formada principalmente pela degradação da molécula heme e é transportada até o fígado, veiculada pela
albumina. Nesta fase a bilirrubina é insolúvel em água e é conhecida como Bilirrubina Não Conjugada ou Bilirrubina
Indireta.
No fígado, a bilirrubina se liga ao ácido glicurônico para formar a Bilirrubina Conjugada, mediante a atuação da enzima uridil
difosfato glucoroniltransferase, transformando-se assim em Bilirrubina Direta ou Bilirrubina Conjugada. A Bilirrubina
Conjugada ou Bilirrubina Direta é excretada pelas vias biliares até o intestino, onde é metabolisada pela flora bacteriana
residente, à um grupo de produtos complexo, conhecidos como estercobilinogenio.
Esta eliminação se dá de maneira praticamente completa.
A Bilirrubina Total é a soma das duas bilirrubinas (Direta + Indireta). Esta Bilirrubina apresenta níveis séricos elevados na
presença de obstrução das vias biliares, doenças hemolíticas e na insuficiência hepática.
O monitoramento da Bilirrubina do neonato, em particular do prematuro é de suma importância, pois uma elevação
acentuada da Bilirrubina Indireta, superando a barreira hemato-encefálica podendo causar danos cerebrais irreversíveis.
3. PRINCÍPIO DO MÉTODO
Quase todas as técnicas de quantificação da Bilirrubina se baseiam na reação de Malloy-Evelyn, que quantifica
colorimetricamente a formação de azobilirrubina, de coloração vermelha, quando a bilirrubina reage sob determinadas
condições com o ácido sulfanílico diazotado.
A Bilirrubina conjugada, muito polar, reage em meio aquoso com o reativo de diazotação, Bilirrubina Direta, a coloração
aparece após o contato do soro e o reativo. A Bilirrubina livre, pouco polar, não dá uma reação direta e é preciso adicionar
um terceiro reativo para que seja produzida a reação de diazotação com o aparecimento da cor; por este motivo se chama
Bilirrubina Indireta.
4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
Preparo do paciente
O paciente deve estar em jejum de, pelo menos, 04 horas. No caso de recém-nascidos, antes da próxima mamada.
Amostras
Soro: obtido da maneira usual.
5. COMPONENTES DO KIT
Reagente 1 – Bilirrubina Direta: Ácido sulfanílico 35 mmol/L, ácido clorídrico 180 mmol/L.
Reagente 2– Bilirrubina Total: Ácido sulfanílico 40 mmol/L, ácido clorídrico 60 mmol/L, Dimetilsulfóxido 10 mmol/L
Reagente 3 – Nitrito: Nitrito de sódio 33 mmol/L,azida sódica 16 mmol/L.
y Conservar entre 2 – 8 º C
6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO
Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo.
Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.
8. CONTROLE DE QUALIDADE
Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.
Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.
9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES
17
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
y Usar pipetas de vidro e ponteiras descartáveis separadas para cada amostra, controle (se utilizado) e reagente. Não
trocar as tampas dos frascos de reagentes. Isso evitará contaminação cruzada, o que poderia causar resultados
errôneos.
Procedimento manual
1. Pipetar em tubos de ensaio: (Nota 1)
2. Agitar bem e deixar reagir durante 5 minutos a temperatura ambiente. Ler as absorbâncias.
Nota:
1) Para pediatria pode-se variar os volumes proporcionalmente:
R – 1 / R - 2 = 1000 μL
R–3 = 30 μL
Amostra = 20 μL
Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).
Cuidados especiais
y Conservar a amostra e o reativo protegidos da luz.
11. CÁLCULOS
CÁLCULOS
Cálculos:
Bilirrubina Total = AT – ABT x Concentração da Padrão
AP – ABP
Bilirrubina Direta = AD – ABD x Concentração da Padrão
AP – ABP
Onde: AT = Absorbância amostra Bilirrubina Total
ABT = Absorbância branco da amostra de Bilirrubina Total
AD = Absorbância amostra Bilirrubina Direta
ABD = Absorbância branco da amostra de Bilirrubina Direta
AP = Absorbância do Padrão
ABD = Absorbância do Branco de Padrão
Com fator:
Bilirrubina Total (mg/dL) = AT – ABT x 25,0
Bilirrubina Direta (mg/dL) = AD – ABD x 15,0
UNIDADES SI:
mg/dL bilirrubina x 17,1 = μmol/L bilirrubina
Para amostras pediátricas, com volume de amostra reduzido para 20 μL, os valores de fator se modificam para:
BD = 36,5 e BT = 60,8.
18
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
Valores de referência
Bilirrubina Total: até 1,2 mg/dL (20,5 μmol/L)
Bilirrubina Direta: até 0,4 mg/dL (6,8 μmol/L).
Bilirrubina Total (Recém-nascidos) – mg/dL
Idade Cordão < 24 horas < 48 horas 3 a 5 dias 7 dias
Pré-maturo 2,9 8,0 12,0 15,0 15,0
Termo 2,5 6,0 10,0 12,0 10,0
Esses valores são unicamente orientativos. Recomenda-se que cada laboratório estabeleça seu próprio intervalo de
referência.
y Interferências
A leitura da amostra de branco evita a interferência da lipemia, hemólise ou turbidez dos soros liofilizados.
Falsos Valores baixos: Soros fortemente hemolisados podem fornecer valores falsamente diminuídos
y Hijmans Van der Bergh AA, Muller P., Biochem. 77, 90 (1916).
y Malloy, H.T. and Evelyn, KA, J.Biol.. Chem. 119, 481 (1937).
y Westgard JO, Barry PL, Hunt MR. Clin Chem 1981; 27: 493-501
y Sims FH, Horn C. Am J Clin Path 1958; 28: 412.
y Matimek, RG Clin. Chim. Acta, 13, 161 (1966).
y Walters MI, Gerarde RW, Microchem 15, 231 (1970).
y Bilirrubina Direta e Total – Bula do Kit – BioTécnica Ind e Com. Ltda – Revisão Maio/2005.
y Inmetro – Boas Práticas de laboratório Clínico e Listas de Verificação para Avaliação, Qualitymark ed., Rio de Janeiro,
1997.
y Manual de exames – Laboratório Fleury – 1999 – 69.
y Manual de exames – Laboratório H. Pardini – 2002 – 62
19
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
CÁLCIO ASX
Método ARSENAZO III
1. INDICAÇÃO MÉDICA
Para determinação dos níveis de Cálcio sérico. Este íon atua como mediador na contração muscular, transmissão nervosa
e mediação da coagulação sanguínea. O hormônio paratireoideano e a Vitamina D aumentam a absorção do cálcio do trato
gastrointestinal, liberando-o para os ossos em caso de déficit desse íon.
Sangue: o cálcio total encontra-se ligado às proteínas (47%) e livre (43%). Hipercalcemia é encontrada no
hiperparatireoidismo, algumas neoplasias com ou sem metástases ósseas, mieloma, desidratação, hipervitaminose D,
síndrome de imobilidade, hipertireoidismo, hepatopatias, insuficiência renal, sarcoidose, linfoma, uso de diuréticos e
estrógenos. Níveis baixos de cálcio total são encontrados na osteomalácia, pancreatite, hipomagnesemia, hipervolemia, má
absorção, deficiência da vitamina D, diminuições de albumina e em situações que cursam com fósforo elevado
(insuficiência renal, hipoparatireoidismo). Níveis críticos de cálcio total são aqueles inferiores a 6 mg/dL e superiores a 14
mg/dL. Na interpretação dos valores normais deve-se levar em conta níveis de albumina. A hemólise pode elevar os
resultados.
Urina: é útil na investigação dos efeitos da vitamina D e PTH sobre a reabsorção óssea. Também utilizado na avaliação de
nefrolitíase. Exame deve ser realizado após 4 dias de dieta. Sua determinação é preferida na urina de 24 h; urina recente
pode ser utilizada realizando a razão cálcio: creatinina. Hipercalciúria é encontrada nas hipercalcemias, hiperabsorção
intestinal de cálcio, distúrbios da reabsorção tubular de cálcio, corticoterapia, osteoporose, acromegalia, hipertireoidismo,
feocromocitoma, Cushing. Hipocalciúria pode ser secundária à hipocalcemia, insuficiência renal, osteomálacia, raquitismo,
alcalose, uso de diuréticos e estrógenos.
Cálcio Iônico: O cálcio iônico é a fração biologicamente ativa do cálcio sérico total, representando 43% desse. Sua
concentração é mais baixa à noite e maior pela manhã. A dosagem do cálcio iônico independe da albumina, entretanto
varia com o pH (aumenta na acidose; diminui na alcalose).
3. PRINCÍPIO DO MÉTODO
A pH levemente ácido o cálcio forma com o arsenazo (III) um complexo azul, cuja intensidade é medida a 650 nm. A
intensidade de cor é proporcional a quantidade de cálcio presente na amostra. Não é observada nenhuma interferência do
magnésio no pH mencionado.
4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
Preparo do paciente
O paciente deve estar em jejum de, pelo menos, 08 horas.
A determinação na urina requer uma dieta prévia de pelo menos 3 dias livres de cálcio (eliminar leite e derivados).
Amostras
Podem ser utilizados soro, plasma ou urina
Soro não hemolisado, plasma (heparina). Evitar amostra de plasma contendo EDTA, citrato ou oxalato. A amostra deve
ser obtida por via venosa, porém sem deixar o torniquete por muito tempo, para evitar que alterações no nível de albumina
– ao redor do torniquete forme um gradiente de concentração de cálcio. O uso do torniquete pode aumentar o nível de
cálcio em 0,5 mg/dL (0,10 mol/L)
Não utilizar soro proveniente de pacientes em Terapia com EDTA – hiperparatireoidismo. Neste caso, é recomendável o
uso da técnica espectrofotométrica de Absorção Atômica.O soro deve ser separado do coágulo o mais rápido possível,
Urina: Coletar todo volume da micção de 24 horas, homogeneizar bem todo o volume de 24 horas, separar 5,0 mL e
adicionar 1 gota de HCl concentrado. Esta é a amostra teste.
5. COMPONENTES DO KIT
Reagente: Arsenazo III 0.18 mmol/L, Tampão MÊS 1.6 mmol/L, pH 6,8, conservantes
Padrão: Solução de Cálcio (valor da concentração do padrão vide etiqueta do frasco)
6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO
Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo.
Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.
8. CONTROLE DE QUALIDADE
Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.
Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.
9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES
Preparação do reativo:
Reativo pronto pra uso
Procedimento manual
1. Pipetar em tubos de ensaio:
Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).
Cuidados especiais
y O uso de detergente iônico para limpar o material é outra fonte de contaminação com cálcio.
y O material utilizado na preparação do reativo deverá estar completamente isento de íons cálcio. Sugerimos a
lavagem com ácido nítrico 6N ou com detergente não iônico. Depois lavar várias vezes com água deionizada..
11. CÁLCULOS
FC = concentração do padrão
FC = Fator de Calibração
Absorbância padrão
Cálcio Sérico:
Cálculo da concentração de Cálcio: (Multiplicar a absorbância pelo fator de calibração)
Concentração Cálcio (mg/dL) = Abs. Teste x FC
Cálcio Urinário
Ca Urina (mg/dL) = Abs. Teste x FC
Valores de referência
Soro e plasma:
Crianças: 10,0 –11,6 mg/dL = 2,5 - 2,9 mmol/L
Adultos: 8,8 – 10,8 mg/dL = 2,2 – 2,7 mmol/L
Urina: 100-300 mg/24 horas = 25 – 87,5 mmol/24 horas
Esses valores são unicamente orientativos. Recomenda-se que cada laboratório estabeleça seu próprio intervalo de
referência.
y Linearidade
Reação linear até 20mg/dL = 5 mmol/L.
Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos
valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.
y Interferências
A hemoglobina (1,5 g/L), a bilirrubina (20 mg/dL), o magnésio (10 mg/dL) e os fosfatos (20 mg/dL) não interferem.
Triglicérides acima de 900 mg/dL produzem resultados falsamente diminuídos.
Falsos Valores elevados: estrógenos, sais de cálcio, vitamina D, antiácidos, dieta rica em cálcio.
Falsos Valores baixos: cortisona, gentamicina, meticilina, uso excessivo de laxante, heparina, dieta pobre em cálcio,
cloreto de s´dio intravenoso.
y Zak B., Epstein E., Babinski E.S., Review of Calcium Methodologies - Annals of Clinical and laboratory Science 5,
195 – 212 (1975).
y Guyton, Fisiologia humana e Mecanismos das doenças 1993, 5 ª edição
y Westgard JO, Barry PL, Hunt MR, Groth T. Clin Chem 1981; 27: 493-501.
y Jacobs DS, Kasten Jr BL. Laboratory Test Handbook, Hudson: Lexi-Comp Inc., 1996; 96-98.
y Cálcio – Arsenazo III – Bula do Kit – Biotecnica Ind e Com. Ltda – Revisão Maio/2005.
y Inmetro – Boas Práticas de laboratório Clínico e Listas de Verificação para Avaliação, Qualitymark ed., Rio de Janeiro,
1997.
y Manual de exames – Laboratório Fleury – 1999 – 11-12.
y Manual de exames – Laboratório H. Pardini – 2002 – 58-59
23
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
CÁLCIO
Método Colorimétrico
(o-CRESOLFTALEÍNA)
1. INDICAÇÃO MÉDICA
Para determinação dos níveis de Cálcio sérico. Este íon atua como mediador na contração muscular, transmissão nervosa
e mediação da coagulação sanguínea. O hormônio paratireoideano e a Vitamina D aumentam a absorção do cálcio do trato
gastrointestinal, liberando-o para os ossos em caso de déficit desse íon.
Sangue: o cálcio total encontra-se ligado às proteínas (47%) e livre (43%). Hipercalcemia é encontrada no
hiperparatireoidismo, algumas neoplasias com ou sem metástases ósseas, mieloma, desidratação, hipervitaminose D,
síndrome de imobilidade, hipertireoidismo, hepatopatias, insuficiência renal, sarcoidose, linfoma, uso de diuréticos e
estrógenos. Níveis baixos de cálcio total são encontrados na osteomalácia, pancreatite, hipomagnesemia, hipervolemia,
má absorção, deficiência vitamina D, diminuições da albumina, e em situações que cursam com fósforo elevado
(insuficiência renal, hipoparatireoidismo). Níveis críticos de cálcio total são aqueles inferiores a 6 mg/dL e superiores a 14
mg/dL. Na interpretação dos valores normais deve-se levar em conta níveis de albumina. Hemólise pode elevar seus
resultados.
Urina: é útil na investigação dos efeitos da vitamina D e PTH sobre a reabsorção óssea. Também utilizado na avaliação
de nefrolitíase. O exame deve ser realizado após 4 dias de dieta. Sua determinação é preferida na urina de 24 h. Urina
recente pode ser utilizada realizando a razão cálcio / creatinina. Hipercalciúria é encontrada nas hipercalcemias,
hiperabsorção intestinal de cálcio, distúrbios da reabsorção tubular de cálcio, corticoterapia, osteoporose, acromegalia,
hipertireoidismo, feocromocitoma, Cushing. Hipocalciúria pode ser secundária à hipocalcemia, insuficiência renal,
osteomalácia, raquitismo, alcalose, uso de diuréticos e estrógenos.
Cálcio iônico: O cálcio iônico é a fração biologicamente ativa do cálcio sérico total, representando 43% desse. Sua
concentração é mais baixa à noite e maior pela manhã. A dosagem do cálcio iônico independe da albumina, entretanto
varia com o pH (aumenta na acidose; diminui na alcalose).
3. PRINCÍPIO DO MÉTODO
O composto o-cresolftaleína (CFC) reage com Cálcio presente na amostra em meio alcalino originando um complexo
colorido que se pode quantificar espectrofotometricamente.
4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
Preparo do paciente
O paciente deve estar em jejum de, pelo menos, 08 horas.
A determinação na urina requer uma dieta prévia de pelo menos 3 dias livres de cálcio (eliminar leite e derivados).
Amostras
Podem ser utilizados soro, plasma ou urina
Soro não hemolisado, plasma (heparina). Evitar amostra de plasma contendo EDTA, citrato ou oxalato. A amostra deve
ser obtida por via venosa, porém sem deixar o torniquete por muito tempo, para evitar que alterações no nível de albumina
– ao redor do torniquete forme um gradiente de concentração de cálcio. O uso do torniquete pode aumentar o nível de
cálcio em 0,5 mg/dL (0,10 mol/L)
Não utilizar soro proveniente de pacientes em Terapia com EDTA – hiperparatireoidismo. Neste caso, é recomendável o
uso da técnica espectrofotométrica de Absorção Atômica.O soro deve ser separado do coágulo o mais rápido possível,
Urina: Coletar todo volume da micção de 24 horas, homogeneizar bem todo o volume de 24 horas, separar 5,0 mL e
adicionar 1 gota de HCl concentrado. Esta é a amostra teste.
5. COMPONENTES DO KIT
6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO
Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo.
Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.
8. CONTROLE DE QUALIDADE
Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.
Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.
9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES
y Em caso de contato com os olhos ou pele, lavar abundantemente com água corrente.
y Em caso de ingestão procurar atendimento médico.
y Fazer referência ao Manual ou POP de segurança.
y Não misturar ou trocar diferentes lotes de reativos.
y Não utilizar o reativo quando este mostrar-se turvo ou com sinais de contaminação.
y A água utilizada na limpeza do material deve ser recente e isenta de agentes contaminantes. A limpeza da vidraria
deve ser feita com detergente neutro. O enxágüe deve ser exaustivo, sendo o último, com água destilada ou
deionizada.. Fazer referência ao manual ou POP de Controle de Qualidade de Água ou Água Reagente
y A limpeza e secagem adequadas do material são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção
de resultados corretos..Fazer referência ao Manual ou POP de limpeza e validação da qualidade da limpeza dos
materiais.
y Usar pipetas de vidro e ponteiras descartáveis separadas para cada amostra, controle (se utilizado) e reagente. Não
trocar as tampas dos frascos de reagentes. Isso evitará contaminação cruzada, o que poderia causar resultados
errôneos.
Procedimento manual
1. Pipetar em tubos de ensaio:
Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).
Cuidados especiais
y O material utilizado na preparação do reativo de trabalho deverá estar completamente isento de íons cálcio.
Sugerimos a lavagem com ácido nítrico 6N ou com detergente não iônico. Depois lavar várias vezes com água
deonizada.
y O uso de detergente iônico para limpar o material é outra fonte de contaminação com cálcio.
y A técnica se caracteriza por Absorbâncias dos brancos muito baixas, leituras acima de 0,200 de Absorbância indicam
contaminação grosseira por cálcio e os reativos devem ser desprezados. Um novo reativo de trabalho deve ser
preparado.
11. CÁLCULOS
FC = concentração do padrão
Absorbância padrão FC = Fator de Calibração
Cálcio Sérico:
Cálcio Urinário
Ca Urina (mg/dL) = Abs. Teste x FC
6 x Ca – (0,19 x P) + A
Cal ioniz.= 3
(0,19 x P) + A + 6
Valores de referência
Cálcio no Soro: 8,5 - 10,5 mg/dL = 2,12 - 2,63 mmol/L
Cálcio iônico: 4,0 - 5,4 mg/dL = 1,0 – 1,35 mmol/L
Urina: 60 - 200 mg/24 horas = 1,5 - 5,03 mmol/24 horas
y Linearidade
Reação linear até 20 mg/dL (5,0 mmol/L)
Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos
valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.
y Interferências
A hemoglobina (1,5 g/L), a bilirrubina (20 mg/dL), o magnésio (10 mg/dL) e os fosfatos (20 mg/dL) não interferem.
Triglicérides acima de 900 mg/dL produzem resultados falsamente elevados por interferência fotométrica.
Falsos Valores elevados: estrógenos, sais de cálcio, vitamina D, antiácidos, dieta rica em cálcio.
Falsos Valores baixos: cortisona, gentamicina, meticilina, uso excessivo de laxante, heparina, dieta pobre em cálcio,
cloreto de s´dio intravenoso.
27
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
CLORO
Método Colorimétrico
(Mercúrio – Tiocianato)
1. INDICAÇÃO MÉDICA
Esta dosagem é utilizada na dosagem de íons cloretos no sangue. A determinação dos cloretos em amostras de sangue e
urina faz parte da avaliação dos distúrbios hidro-eletrolíticos e ácido-básicos. A dosagem do cloreto no suor é útil no
diagnóstico da fibrose cística.
Cloro Sérico
É o principal ânion extracelular. Juntamente com o sódio, representa a maioria dos constituintes osmoticamente ativos do
plasma. Desta forma, está envolvido na manutenção da pressão osmótica e balanço hidroeletrolítico. A maior parte do cloro
ingerido é absorvida e o excesso excretado na urina.
Cloro Urinário
Normalmente a excreção urinária de cloro se aproxima da ingestão. São observados níveis fisiologicamente aumentados na
diurese pós-menstrual e diminuídos na retenção hídrica pré-menstrual.
Cloro, Líquor
Acompanha as alterações (diminuição ou elevação) dos níveis séricos. Diminuindo na meningite tuberculosa e outras
meningites bacterianas.
3. PRINCÍPIO DO MÉTODO
O íon cloreto reage com o íon mercúrico liberando uma quantidade equivalente de íon tiocianato que em presença de ferro
trivalente forma um complexo colorido violeta. A intensidade da coloração do complexo é proporcional a concentração do
íon cloreto presente na amostra.
28
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
Preparo do paciente
O paciente deve estar em jejum de, pelo menos, 08 horas.
Amostras
Usar soro ou plasma (EDTA, oxalato, citrato, heparina), urina (colhida com intervalo de 24 horas), suor e líquor.
Soro ou plasma: obtido da maneira usual. Para evitar a passagem do cloreto para as hemácias, o plasma ou soro, devem
ser separados até 1 hora após a coleta.
O analito é estável por 7 (sete) dias entre 15 – 30oC e vários meses a 10oC negativos.
Urina ou líquor: Para dosagem no líquor ou na urina, utilizar amostras centrifugadas. Urina de 24 horas. Diluir a urina 1:2.
Multiplicar o resultado obtido por 2.
5. COMPONENTES DO KIT
Reagente: Tiocianato de mercúrio 12.9 mM, nitrato de ferro (III) 170 mM, ácido nítrico 50 mM.
Padrão: Solução de íons Cloreto (valor da concentração do padrão vide etiqueta do frasco).
6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO
Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo.
Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.
8. CONTROLE DE QUALIDADE
Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.
29
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.
9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES
Preparação do reativo:
Reativo pronto pra uso
Procedimento manual
1. Pipetar em tubos de ensaio:
Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).
Cuidados especiais
y Cuidados especiais com a água utilizada! Fazer referência ao manual ou POP de Controle de Qualidade de Água ou
Água Reagente.
11. CÁLCULOS
Onde:
Abs. Amostra Æ Absorbância da Amostra
Abs. Padrão Æ Absorbância do Padrão
Devido à ótima reprodutibilidade, que pode ser obtida com a metodologia, pode-se utilizar o método do fator:
Valores de referência
Para amostras de Soro e Plasma:
98 – 110 mEq/L = 49 – 55 mmol/L
Para amostras de Urina:
170 – 250 mEq/24h = 85 – 125 mmol/L
Suor até 40 mEq/L.
Líquor: 118 a 132 mEq/L
Esses valores são unicamente orientativos. Recomenda-se que cada laboratório estabeleça seu próprio intervalo de
referência
y Linearidade
Reação linear até 200 mEq/L (100 mmol/L)
Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos
valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.
y Interferências
Para amostras Lipêmica, ictéricas e hemolizadas, fazer o branco da amostra com água destilada.
31
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
COLESTEROL
Método Enzimático Colorimétrico
1. INDICAÇÃO MÉDICA
Esta dosagem é utilizada na avaliação dos riscos de aterosclerose e monitoramento de pacientes diabéticos, obesos e com
hipotiroidismo.
O colesterol é um componente estrutural importante da membrana celular e precursor para biossíntese de ácidos biliares e
hormônio esteróides. O colesterol total compreende todo colesterol encontrado em várias lipoproteínas, sendo cerca de
60% a 70% transportados pela LDL- lipoproteína, 20% a 35% pela HDL-lipoproteina e 5% a 12% pela VLDL-lipoproteina.
O colesterol é o principal lipídio associado à doença vascular aterosclerótica.
Uma dosagem de colesterol elevada é uma boa indicação dos riscos de aterosclerose, a qual é uma degeneração de
artérias de grande e médio calibre através da deposição de lipoproteínas, dentre elas o colesterol, com conseqüente
inflamação e fibrose de suas paredes. A aterosclerose desencadeia várias disfunções em vários órgãos principalmente no
coração, cérebro e rins.
AUMENTO: icterícia obstrutiva, D. de Von Gierke, hepatite por vírus, cirrose porta, S. nefrótica, pancreatite crônica, após
pancreatectomia, diabetes mellitus, hipotireoidismo, hipercolesterolemia familiar(deficiência de receptores LDL),
hipercolesterolemia poligênica, hiperlipidemia familiar combinada, disbetalipoproteinemia familiar, aterosclerose, gota,
anorexia nervosa, hepatoma, S. de Cushing, porfiria intermitente aguda, gravidez. Drogas: corticosteróides.
3. PRINCÍPIO DO MÉTODO
Os ésteres de colesterol existentes na amostra são hidrolisados pela enzima colesterol esterase produzindo o colesterol
livre. A enzima colesterol oxidase, em presença de oxigênio, catalisa a oxidação do colesterol livre, produzindo peróxido de
hidrogênio. A enzima peroxidase catalisa a oxidação do reagente fenólico (fenol) pelo peróxido de hidrogênio formado, em
presença de 4-aminoantipirina, produzindo um composto róseo-avermelhado (quinonimina), que apresenta máximo de
absorção em 500 nm.
col. Esterase
Colesterol esterificado + H2O ------------------>Colesterol + Ac. graxo
col. oxidase
Colesterol +1/2 O2 ----------------> Colestenona + H2O2
peroxidase
2 H2O2 + 4-Aminoantipirina + Fenol -------------> Quinonaimina +4H2O
4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
Preparo do paciente:
O paciente deve estar com peso e dieta estáveis por três semanas e em jejum de 12 a 14 horas (O jejum não é
imprescindível para a dosagem de colesterol total, mas o é para a determinação dos triglicérides e frações do colesterol). A
abstinência alcoólica é desejável nas 72 horas que antecedem o teste. Evitar garroteamento por período superior a 2
minutos e colher em posição sentada com o paciente em repouso por 5 minutos.
Amostras:
Soro ou plasma, líquido ascítico ou líquido pleural.
Soro: obtido da maneira usual. Separar dentro das próximas 2 horas da coleta. Soro ou plasma heparinizado, outros
anticoagulantes podem interferir no resultado final. Não usar amostras visivelmente hemolisadas.
Líquido ascítico ou líquido pleural: O material não é colhido no laboratório. O exame é feito somente com material
enviado até 06 horas depois da coleta
5. COMPONENTES DO KIT
Reagente: Tampão fosfato 182,42 mmol/L– pH 7,2; 4-Clorofenol 20 mmol/L; 4-Aminoantipirina 0,6 mmol/L; Colesterol
esterase (CHE) > 750 U/L; Colesterol oxidase > 200 U/L; Peroxidase > 2000 KU/L, Colato de Sodio 8 mM.
Padrão: Solução de Colesterol (valor da concentração do padrão vide etiqueta do frasco)
6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO
Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo.
Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.
8. CONTROLE DE QUALIDADE
Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.
Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.
9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES
33
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
Preparação do reativo:
Reativo pronto pra uso
Procedimento manual
1. Deixar o Reagente durante alguns minutos á temperatura ambiente ou em um banho de água.
2. Pipetar em tubos de ensaio:
3. Agitar bem e incubar os tubos durante 15 minutos à temperatura ambiente ou durante 10 minutos a 37ºC.
4. Ler a absorbância (AP) do Padrão e a (AA) da Amostra frente ao Branco á 500 nm.
A cor é estável durante 30 minutos.
Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).
11. CÁLCULOS
Devido à ótima reprodutibilidade, que pode ser obtida com a metodologia, pode-se utilizar o método do fator:
Valores de referência
34
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
y Linearidade
Reação linear até 800 mg/dL
Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos
valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.
y Interferências
- Ácido Ascórbico: mesmo em baixas concentrações (abaixo de 2 mg/dL) o ácido ascórbico induz a resultados falsamente
diminuídos.
- Hemoglobina e Triglicérides elevados (amostra com turvação evidente): Hemoglobina acima de 150mg/dL (hemólise
significativa) e hiperlipemia acentuada induzem a resultados falsamente aumentados.
Bilirrubina: Bilirrubina até 15 mg/dL não interfere no resultado do teste.
Falsos valores elevados: Esteróides, anticoncepcional oral, bromatos, fenotiazina, sulfonamidas, fenitoína, aspirina e
epinefrina.
Falsos valores diminuídos: neomicina, tetraciclina, heparina, agentes hipoglicemiantes, kanamicina, colchicina.
35
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
Vários estudos sugerem existir uma forte correlação inversa entre os níveis de C-HDL e o risco de aterosclerose. Isso deve-
se ao fato da HDL-lipoproteína estar envolvida no chamado transporte reverso do colesterol para ser metabolizado no
fígado (sítio de maior excreção do colesterol).
Valores de C–HDL são dependentes de sexo e idade, tendendo a decrescer temporariamente após infarto agudo do
miocárdio.
Em doenças da tireóide, seus valores não devem ser usados como estimativa de risco de aterosclerose, visto que o
hipotireoidismo aumenta e o hipertireoidismo diminui seus níveis.
Valores de HDL – colesterol são aproximadamente 1/5 do colesterol total.
3. PRINCÍPIO DO MÉTODO
O anticorpo antiβ-lipoproteína humana presente no Reagente A se liga as lipoproteínas (LDL, VLDL e Quilomicrons)
deixando a lipoproteína HDL livre.
Quando é adicionado o Reagente B, somente o Colesterol HDL reage com a cadeia enzimática (CHE-CO). O peróxido de
hidrogênio produzido pela reação enzimática produz um complexo de cor azul sob condensação oxidativa com F-DAOS e
4-AAP, em presença de peroxidase. A concentração do HDL presente na amostra é proporcional a absorbância, medida à
600 nm.
4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
Preparo do paciente
O paciente deve estar com peso e dieta estáveis por três semanas e em jejum de 12 a 14 horas (O jejum não é
imprescindível para a dosagem de colesterol total, mas o é para a determinação dos triglicérides e frações do colesterol). A
abstinência alcoólica é desejável nas 72 horas que antecedem o teste. Evitar garroteamento por período superior a 2
minutos e colher em posição sentada com o paciente em repouso por 5 minutos.
Amostras
Soro não hemolisado, plasma (heparina ou EDTA)
5. COMPONENTES DO KIT
Reativo A: 4-aminoantipirina 0,9 mM, POD > 2400 U/L, Ascorbato oxidase > 2700 U/L; Anticorpos antiβ-lipoproteína
humana 2,0 U/L.
Reativo B: Colesterol esterase > 4000 U/L, Colesterol oxidase > 2000 U/L; F-DAOS 0,8 mM; Tampão MES 30 mM, pH 7,0.
Calibrador: Soro liofilizado (Valor da concentração vide etiqueta do frasco).
6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO
Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo.
Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.
8. CONTROLE DE QUALIDADE
Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.
Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.
9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES
37
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
Procedimento manual
Técnica Micro:
Técnica Macro:
38
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).
11. CÁLCULOS
A1p = ΔA padrão
A2-A1 = ΔA amostra
[P]= Concentração do Padrão
Exemplo: A2 = 0,280
A1= 0,142
A2p= 0,167
A1p= 0,056
[P] = 35 mg/dL
ΔA amostra= 0,280-0,142=0,138
ΔA padrão= 0,167-0,056=0,111
Fator = 35 = 315,3
0,111
Valores de referência
Estes valores são unicamente orientativos, sendo recomendável que cada laboratório estabeleça seus próprios intervalos
de referência. Pelas últimas Diretrizes Brasileiras sobre Dislipidemias e Prevenção da Aterosclerose, os valores de
referência para HDL Colesterol podem ser consultados por faixa etária, como mostrado na tabela abaixo:
y Linearidade
Reação linear até 180 mg/dL
Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos
valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.
y Interferências
Ácido Ascórbico (até 50 mg/dL), Hemoglobina (até 500 mg/dL), Bilirrubina (até 40 mg/dL) e lipídios (até 5 g/dL) não
interferem.
39
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
y Gordon T et al.: High density lipoprotein as a protective factor against coronary heart disease. The Framingham Study,
Am J. Med., 62,707 (1977).
y Sachiko Izawa et al.: A new direct method for measuring HDL – Cholesterol which does not produce any biased values.
J.Med. And Pharm.Sci., 1385-1388, 37 (1997)
y HDL Colesterol –Direto – Bula do Kit – BioTécnica Ind e Com. Ltda – Revisão Maio/2005.
y Inmetro – Boas Práticas de laboratório Clínico e Listas de Verificação para Avaliação, Qualitymark ed., Rio de Janeiro,
1997.
y Manual de exames – Laboratório Fleury – 1999 – 241.
y Manual de exames – Laboratório H. Pardini – 2002 – 67-68
40
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
HDL COLESTEROL
Método Precipitante – Ácido Fosfotúngstico
1. INDICAÇÃO MÉDICA
Esta dosagem é utilizada na avaliação dos riscos de doenças coronarianas e renais causadas por aterosclerose.
Vários estudos sugerem existir uma forte correlação inversa entre os níveis de C-HDL e o risco de aterosclerose. Isso se
deve ao fato da HDL-lipoproteína estar envolvida no chamado transporte reverso do colesterol para ser metabolizado no
fígado (sítio de maior excreção do colesterol).
Valores de C–HDL são dependentes de sexo e idade, tendendo a decrescer temporariamente após infarto agudo do
miocárdio.
Em doenças da tireóide, seus valores não devem ser usados como estimativa de risco de aterosclerose, visto que o
hipotireoidismo aumenta e o hipertireoidismo diminui seus níveis.
Valores de HDL – colesterol são aproximadamente 1/5 do colesterol total.
3. PRINCÍPIO DO MÉTODO
Os quilomicrons e as lipoproteínas de baixíssima densidade (VLDL) e de baixa densidade (LDL) presentes na amostra,
precipitam em presença de fosfotungstato e íons magnésio. O sobrenadante da centrifugação contém as lipoproteínas de
elevada densidade (HDL), cujo colesterol quantifica-se espectrofotometricamente mediante as reações acopladas descritas
abaixo.
col. esterase
Colesterol esterificado + H2O -------------> Colesterol + Ac. graxo
col. oxidase
Colesterol + ½ O2 + H2O --------------> Colestenona + H2O2
peroxidase
2H2O2 + 4-Aminoantipirina +DCFS ------------->Quinonaimina+4H2O
4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
Preparo do paciente
O paciente deve estar com peso e dieta estáveis por três semanas e em jejum de 12 a 14 horas (O jejum não é
imprescindível para a dosagem de colesterol total, mas o é para a determinação dos triglicérides e frações do colesterol). A
abstinência alcoólica é desejável nas 72 horas que antecedem o teste. Evitar garroteamento por período superior a 2
minutos e colher em posição sentada com o paciente em repouso por 5 minutos.
Amostras
Soro não hemolisado, plasma (heparina ou EDTA).
5. COMPONENTES DO KIT
6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO
Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo.
Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.
8. CONTROLE DE QUALIDADE
Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.
Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.
9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES
Preparação do reativo:
Reativo pronto pra uso
Procedimento manual
Precipitação
1. Pipetar em tubo de centrífuga
Amostra 250 μL
Reagente precipitante 250 μL
7. Agitar bem e incubar nos tubos durante 30 minutos à temperatura ambiente ou durante 10 minutos a 37ºC
8. Ler a absorbância (A) do Padrão e da Amostra frente ao Branco à 500 nm.
A cor é estável durante pelo menos 30 minutos.
Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).
Cuidados especiais
y Manter sempre a relação Amostra/Preciptante igual a 1:1.
y Após a centrifugação, remover o sobrenadante límpido dentro de 15 minutos, para evitar resultados falsamente
elevados.
y Amostras lipêmicas e ocasionalmente amostras não lipêmicas podem apresentar o sobrenadante turvo. Neste caso
diluir a amostra 1:2 com NaCI 150 mmol/l e repetir a precipitação. Multiplicar o resultado final por 2. Caso o sobrenadante
permaneça ainda turvo a amostra não pode ser utilizada para determinar o colesterol HDL.
11. CÁLCULOS
43
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
Valores de referência
Estes valores são unicamente orientativos, sendo recomendável que cada laboratório estabeleça seus próprios intervalos
de referência. Pelas últimas Diretrizes Brasileiras sobre Dislipidemias e Prevenção da Aterosclerose, os valores de
referência para HDL Colesterol podem ser consultados por faixa etária, como mostrado na tabela abaixo:
y Linearidade
Reação linear até 150 mg/dL.
Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos
valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.
y Interferências
Àcido ascórbico >0,3 mmol/L, a hemoglobina >3 g/L e a bilirrubina >0,25 mmol/L interferem.
44
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
CREATININA
Método Cinético Colorimétrico
1. INDICAÇÃO MÉDICA
CREATININA SÉRICA
Trata-se de um produto metabólico formado pela descarboxilação da creatina-fosfato no músculo, tendo, portanto, uma
relação direta com a massa muscular.Homens e atletas produzem maiores quantidades de creatinina que crianças, idosos
e mulheres em geral. O decréscimo da massa muscular no idoso deve ser considerado na interpretação dos resultados. A
creatinina não é afetada normalmente pela dieta, porém, se quantidades excessivas de carnes forem consumidas, os
níveis séricos poderão sofrer aumento por um período de 48 horas. Com a redução do fluxo sanguineo renal, a creatinina
eleva-se mais lentamente que a uréia. A concentração de creatinina somente torna-se anormal quando aproximadamente
metade ou mais de néfrons tenham sido comprometidos.
Níveis Aumentados Níveis Diminuídos
Diminuição do fluxo sanguíneo renal: Baixa estatura
insuficiência cardíaca congestiva,
choque, desidratação
Insuficiência renal por decréscimo da Desnutrição
filtração glomerular
Obstrução do trato urinário Diminuição da massa muscular
Intoxicação por metanol Doença hepática severa
Terapia com metildopa, trimetoprim, Gravidez
hidantoína, cefalosporinas e ácido
ascórbico
CREATININA URINÁRIA
É filtrada livremente pelos glomérulos somente sendo reabsorvida em certas condições clínicas, como: diabetes melittus,
insuficiência cardíaca congestiva etc. A secreção tubular da creatinina pode ser inibida por drogas como: cimetidina,
trimetoprim e probenecide.
Exercícios severos e ingestão de altas quantidades de carne podem causar aumentos significativos na excreção de
creatinina, enquanto a diminuição da massa muscular nos idosos provoca diminuição.
A determinação da creatinina urinária em mg/kg de peso é um parâmetro indicativo do volume correto da urina colhida no
período de 24 horas.
Níveis Aumentados Níveis Diminuídos
Adenoma hipofisário Distrofia muscular
Diabetes mellitos Doença muscular
inflamatória
Doenças infecciosas Doenças com diminuição
da massa muscular
Encefalite Doença renal avançada
Hipotireoidismo Hipertireoidismo
Anemia
Leucemia
Paralisia
3. PRINCÍPIO DO MÉTODO
A creatinina presente na amostra reage com o picrato em meio alcalino originando um complexo de cor vermelho-
amarelada. Mede-se a velocidade de formação desse complexo utilizando uma cinética de 2 pontos durante os períodos
iniciais da reação, a reação do picrato com outros cromogênios presentes na amostra é lenta, ocorrendo nos períodos finais
da reação, o que não interfere na dosagem da creatinina.
4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
Preparo do paciente
O paciente deve estar em jejum de, pelo menos, 08 horas.
Amostras:
Soro, plasma ou urina.
45
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
Urina: amostra de urina de 24 horas deve ser conservada em geladeira durante o período de coleta e até o momento da
dosagem. Estável 4 dias a 2-8oC. Diluir a urina fresca 1/100 com água destilada. Multiplicar o resultado obtido por 100.
5. COMPONENTES DO KIT
6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO
Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo.
Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.
8. CONTROLE DE QUALIDADE
Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.
Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.
9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES
Procedimento manual
1. Pré-aquecer o Reagente de Trabalho e a amostra ou padrão a 37ºC durante alguns minutos.
2. Ajustar o espectrofotômetro em zero frente a água destilada.
3. Pipetar em uma cubeta pré-aquecida a 37ºC:
Dosagem em urina:
1. Medir o volume urinário de 24 horas.
2. Centrifugar uma alíquota de 10 mL, por 10 minutos a 3000 rpm.
3. Fazer uma diluição do sobrenadante na proporção de 1:50 com água destilada ou deionizada.
4. Proceder a dosagem conforme o procedimento descrito acima, para o soro.
5. Multiplicar o resultado obtido por 50.
Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).
Cuidados especiais
y Para manusear e descartar reagentes e material biológico, aplicar as normas de segurança estabelecidas. Fazer
referência ao Manual ou POP de Segurança.
y As amostras muito leitosas, o procedimento corretivo com desproteinização não é eficiente e, nestes casos, não é
possível dosar a creatinina com exatidão.
47
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
11. CÁLCULOS
Exemplo:
A1 – p = 0,222 Fc = 2 = 2 = 10,7
A2 - p = 0,409 0,409-0,222 0,187
A1 - A = 0,137
A2 _ A = 0,222 Creatinina (mg/dl)=(0,222 – 0,137) x 10,7= 0,91 mg/dl
Cálculo na Urina
Fc = Valor Padrão .
(A2 – A1) Padrão
Creatinina Urina (mg/24 horas) = Creatinina mg/dL x Volume urinário 24hs (mL)
100
Creatinina em mg/kg peso/24 horas:
Depuração (mL/minuto) = U x VM
S
Onde:
U = creatinina na urina (mg/dL)
S = creatinina no soro (mg/dL)
VM = volume minuto (Vol. Urinário de 24 h, em mL, dividido por 1440 minutos)
Atenção: A depuração deverá ser corrigida para a superfície corporal do paciente.
Onde:
2
SC = superfície corporal em m
P = peso em Kg
A = altura em cm
Determinação do Clearence:
2
Clearence (mL/min/1,73 m ) = Depuração(mL/min) x 1,73
Superfície corporal
Exemplo:
Creatinina na urina (mg/dl) = 120
Creatinina no soro (mg/dl) = 0,91
Volume de 24 horas = 1800 mL
Volume/minuto = 1800/1440 = 1,25
Peso = 70 kg
Altura = 170 cm
Superfície corporal = 1,81 m2
Depuração (mL/min) = 120 x 1,25 = 164,83 mL/min.
0,91
Depuração (mL/min/1,73 m2) = 164,83 x 1,73 = 157,5 mL/min
1,81
48
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
Valores de referência
Soro ou Plasma
• Homens: 0,6 - 1,2 mg/dL = 53 - 97 μmol/L
• Mulheres: 0,5 - 1,0 mg/dL = 44-80 μmol/L
y Linearidade
Reação linear até 12 mg/dL = 1768 μmol/L.
Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos
valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.
y Interferências
A hemoglobina (0,1 g/L), a bilirrubina (10 mg/dL), a proteína e compostos cetônicos não interferem. A determinação pode
ser afetada por concentrações elevadas de substâncias redutoras.
Falsos Valores elevados: A creatinina urinária aumenta com dietas hiperprotéicas, cefalosporinas, ácido ascórbico e
levodopa.
Falsos Valores baixos: Urinas muito acidificadas podem apresentar forte interferência negativa.
49
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
Esta dosagem é utilizada nos casos de infarto do miocárdio e miopatias (distrofia muscular progressiva, dermatomiosites,
trauma muscular etc).
A Creatino Quinase (CK) também denominada ATP-Creatino-N-fosfotransferase, existe sob a forma de um dímero, e é uma
importante enzima reguladora da produção e utilização de fosfatos de alta energia nos tecidos contráteis. A CK total é
encontrada em concentrações muito altas na musculatura esquelética e cardíaca. Quantidades apreciáveis são
encontradas no cérebro, estando presente também no intestino e nos pulmões. A CK não é encontrada no fígado.
A CK total possui alta sensibilidade clínica para o diagnóstico do IAM (>90%), porém os resultados não são específicos
para lesão miocárdica. Várias condições não relacionadas ao miocárdio provocam elevação da CK total.
A CK é um dímero, isto é, compõe-se de duas cadeias diferentes, chamadas M (muscle) e B (brain). Estas duas cadeias
podem combinar-se de três formas, formando as chamadas isoenzimas da CK: CK-MM, CK-MB, e CK-BB. A CK-MM é
encontrada em grande quantidade principalmente na musculatura estriada. A CK-BB é a isoenzima encontrada no
cérebro, sendo predominante também no cólon, íleo, estômago e bexiga. A CK-MB está presente no miocárdio, onde
representa cerca de 20% da CK contra 80% de CK-MM. A CK-MB é encontrada também no músculo estriado esquelético
em pequena proporção (entre 1% e 4%, sendo o restante CK-MM).
3. PRINCÍPIO DO MÉTODO
A creatino quinase (CK) catalisa a fosforização do ADP pelo fosfato de creatino, obtendo-se creatino e ATP. A
concentração catalítica é determinada, empregando-se as reações acopladas da hexoquinase e glicose-6-fosfato
desidrogenase, a partir da velocidade de formação do NADPH, medido à 340 nm.
CK
Fosfato de creatino + ADP ------------> Creatino + ATP
HK
ATP + Glicose ------------> ADP + Glicose-6-fosfato
G6P-DH
Glicose-6-fosfato + NADP+------------->Gluconato-6-fosfato + NADPH + H+
4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
Preparo do paciente
Evitar exercícios físicos antes da colheita do material.
Amostras
Usar soro ou plasma colhido em EDTA. Não utilizar amostras hemolizadas.
50
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
5. COMPONENTES DO KIT
Reagente A: Imidazol 100 mmol/L, pH 6,7, EDTA 2 mmol/L, acetato de magnésio 10 mmol/L, D-glicose 20 mmol/L.
Reagente B: Fosfato de creatina 30 mmol/L, N-acetil-cisteína 20 mmol, ADP 2 mmol, AMP 5 mmol, di (adenosina-5)
pentafosfato 10 μmol/L, NADP 2 mmol/L, hexoquinase > 3000 U/L, glicose – 6 - fosfato desidrogenase > 2500 U/L, EDTA 2
mmol/L.
6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO
o
Conservar o KIT a 2-8 C.
Evitar exposição à luz intensa.
Os reativos são estáveis até a data de validade indicada no rótulo, sempre que conservados bem fechados e se evitada a
contaminação durante o uso.
Não utilizar reativos que estejam com as datas de validade expiradas.
Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo.
Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.
8. CONTROLE DE QUALIDADE
Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.
Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.
9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES
51
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
y O reagente, uma vez usado, contém soro, plasma ou urina, eventualmente infectado, e deve ser tratado como material
potencialmente infeccioso. Descartar as sobras das reações de acordo com as Boas Práticas de Laboratório, em lugar
apropriado para material potencialmente infectante.
y Os reagentes não contêm substâncias perigosas nas quantidades reportadas.
y Em caso de vazamento acidental, lavar o local com água corrente.
y Não é necessário nenhum tipo de proteção respiratória, mas recomenda-se o uso de óculos de segurança e de luvas
descartáveis durante o manuseio das substâncias.
y Em caso de contato com os olhos ou pele, lavar abundantemente com água corrente.
y Em caso de ingestão procurar atendimento médico.
y Fazer referência ao Manual ou POP de segurança.
y Evitar contaminações com íons metálicos.
y Não misturar diferentes lotes de reagentes. Evitar contaminação microbiana do reagente e não utilizar reagentes que
tenham sinais de contaminação ou precipitação.
y Não dispensar o reagente em tubulação contendo ferro galvanizado.
y Não contaminar a vidraria ou o reagente com saliva ou suor, devido aos seus altos conteúdos de α-amilase. Não soprar
a pipeta utilizada. Não conversar nas proximidades do frasco destampado, pois o reagente pode se contaminar
irreversivelmente. O aparecimento de cor amarelada no reagente é sinal de contaminação por α-amilase.
y A água utilizada na limpeza do material deve ser recente e isenta de agentes contaminantes. A limpeza da vidraria
deve ser feita com detergente neutro. O enxágüe deve ser exaustivo, sendo o último, com água destilada ou
deionizada. Fazer referência ao manual ou POP de Controle de Qualidade de Água ou Água Reagente
y A limpeza e secagem adequadas do material são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção
de resultados corretos.Fazer referência ao Manual ou POP de limpeza e validação da qualidade da limpeza dos
materiais.
y Usar pipetas de vidro e ponteiras descartáveis separadas para cada amostra, controle (se utilizado) e reagente. Não
trocar as tampas dos frascos de reagentes. Isso evitará contaminação cruzada, o que poderia causar resultados
errôneos.
Procedimento manual
1. Pré-aquecer o Reativo de Trabalho a temperatura desejada durante alguns minutos.
2. Pipetar:
Amostra 20 μL
Reativo de trabalho 1,0 mL
3. Misturar e transferir de imediato a uma cubeta. Inserir nas porta-cubetas termostatizado. Acionar o cronômetro.
4. Aos 3 minutos, anotar a absorbância inicial (A0) e efetuar novas leituras após 1, 2 e 3.minutos (A1, A2 e A3,
respectivamente)
5. Comprovar que as diferenças entre absorbâncias sejam sensivelmente iguais. Calcular o incremento médio de
absorbância por minuto (ΔA/min).
Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).
Cuidados especiais
Para manusear e descartar reagentes e material biológico, aplicar as normas estabelecidas de segurança.
11. CÁLCULOS
Usando as leituras das absorbâncias encontradas, calcular a média da variação de absorbância por minuto (ΔA/min).
Calcular a média das absorbâncias por minuto:
52
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
Valores de referência
37ºC
Mulheres < 170 U/L
Homens < 195 U/L
Estes valores são unicamente orientativos; é recomendável que cada laboratório estabeleça seu próprio intervalo de
referência.
y Linearidade:
A reação é linear até ΔA/min = 0,250 à 340nm (2023 U/L). Para valores superiores repetir a reação com amostra diluída
em solução fisiológica, multiplicando o resultado final pelo fator de diluição.
Temperatura de incubação: A determinação também pode efetuar-se a 30º C (método IFCC).
Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos
valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.
y Interferências:
Concentrações de hemoglobina acima de 200 mg/dL interferem no teste. A hemólise interfere.
Falsos Valores elevados: Injeções intramusculares, traumas, cirurgias, intoxicação por barbitúricos, anfotericína B,
ampicilina, carbenicilina, clofibrato, clorpromazine.
53
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
Esta dosagem é utilizada principalmente na avaliação da extensão da lesão causada nos casos de infarto do miocárdio e
em paciente com doenças ou traumas na musculatura esquelética.
A CK é um dímero composto por duas subunidades: B (cérebro) e M (músculo) no qual encontra-se 3 isoenzimas distintas:
CK-BB, CK-MB e CK-MM.
A CK-MB encontra-se basicamente no músculo estriado e miocárdio. Assim qualquer dano ou lesão nestes tecidos provoca
uma elevação dos níveis de CK-MB em soro, o que se utiliza quase que unicamente para diagnóstico do infarto do
miocárdio. No infarto agudo do miocárdio é importante a proporção do CK-MB em, relação ao CK total, não havendo
quantidade de CK-MB absoluta.
A isoenzima CK-MB têm sido considerada o marcador bioquímico de referência para o diagnóstico de lesão miocárdica e,
por isso, têm sido a base para comparação com outros marcadores. Apesar da CK-MB ser, em termos de diagnóstico,
específica para lesão do miocárdio, o músculo esquelético possui maior atividade de CK total por grama de tecido, e pode
ter até 4% de CK-MB. Isto pode diminuir a especificidade especialmente em paciente com lesões concomitantes na
musculatura esquelética e cardíaca.
A elevação e a queda características da CK-MB, em uma dosagem seriada são quase patognomônicas para o diagnóstico
de infarto do miocárdio. A elevação inicial dos níveis de CK-MB ocorre entre 4 e 6 horas após o início dos sintomas
atingindo o seu pico após 24 horas e retornando ao normal entre 48 e 72 horas. Para um diagnóstico com alta sensibilidade
e especificidade, recomenda-se a dosagem seriada ao longo de um período de 8 a 12 horas.
3. PRINCÍPIO DO MÉTODO
4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
Preparo do paciente
Evitar exercícios físicos antes da coleta do material.
Amostras:
Usar soro ou plasma colhido em EDTA ou heparina. Não utilizar amostras hemolizadas
5. COMPONENTES DO KIT
54
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
Reagente A: Tampão Imidazol 100 mmol/L, pH 6,7, Acetato de Magnésio 10 mmol/L, D-glicose 20 mmol/L,
Reagente B: Creatino-fosfato 30 mmol/L, ADP 2 mmol, AMP 5 mmol, di (adenosina-5) pentafosfato 10 μmol/L, NADP 2
mmol/L, hexoquinase 2500 U/L, glicose – 6 - fosfato desidrogenase 2000 U/L, Anticorpo anti-CK-MM policlonal >2000U/L..
Controle: Soro controle de CK-MB. Verifique valores na etiqueta do frasco. NÃO UTILIZAR COMO CALIBRADOR.
6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO
Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo.
Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.
8. CONTROLE DE QUALIDADE
Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.
Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.
9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES
Procedimento manual
6. Pré-aquecer o Reativo de Trabalho a temperatura desejada durante alguns minutos.
7. Pipetar:
Amostra 20 μL
Reativo de trabalho 1,0 mL
8. Misturar e transferir de imediato a uma cubeta. Inserir nas porta-cubetas termostatizadas. Acionar o cronômetro.
9. Aos 5 minutos, anotar a absorbância inicial (A10) e aos 10 minutos anotar novamente(A15).
10. Calcular a diferença das absorbâncias A10 - A5 (ΔA).
Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).
11. CÁLCULOS
Valores de referência:
Temperatura 37ºC
U/L <25
A atividade de CK-MB representa de 6 a 20% da atividade de CK total.
Estes valores são unicamente orientativos. É recomendável que cada laboratório estabeleça seus próprios intervalos de
referência
y Linearidade:
A reação é linear até 1000 U/L.
Diluir as amostras que possuam uma atividade de CK Total superior a 1000 U/L, com uma solução de cloreto de sódio 9
g/L 1:1. Neste caso multiplicar o resultado obtido por 2. A diluição é realizada para que a atividade de CK total fique menor
que 1000 U/L. O reativo, uma vez preparado, possui um anticorpo anti CK-M humano, em quantidade suficiente para inibir
até 1500 U/L de CK-MM.
56
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos
valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.
y Interferências:
Hemoglobina acima de 200 mg/dL interfere nos resultados.
A hemólise interfere.
Concentrações de CK-MM superiores a 1500 U/L não são inibidas pelo anticorpo e interferirá na determinação.
Falsos Valores positivos: Pode ocorrer em algumas doenças neurológicas.
Falsos Valores baixos: Podem ser obtidos se o exame for realizado muito precocemente, antes de 2 horas ou após 48
horas do IM.
57
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
FERRO Ferrozine
Método Colorimétrico
1. INDICAÇÃO MÉDICA
Esta dosagem é utilizada principalmente na avaliação de anemias, anemias hemolíticas, neoplasias da medula óssea e
hepatopatias.
O ferro é um íon importante para a formação da hemoglobina, mioglobina e outras substâncias como os citocromos, a
citocromo oxidase, a peroxidase e a catalase. Portanto, é essencial se conhecer os meios pelos quais o ferro é utilizado no
corpo.
A quantidade total de ferro no corpo é em média de cerca de 4 g, dos quais cerca de 65% estão presentes na forma de
hemoglobina. Cerca de 4% estão presentes sob forma de mioglobina, 0,1% sob forma dos diversos compostos hêmicos
que promovem a oxidação celular, 0.1% combinado à proteína transferrina no plasma sangüíneo e 15 a 30% armazenados,
principalmente no fígado sob forma de ferritina.
Haverá um aumento de ferro sérico no tratamento de anemias com ferro, neoplasia da medula óssea, drogas
mielossupressoras, anemia hemolítica e perniciosa, hepatopatias virais e crônicas.
Esse aumento ocorre pelo fato da liberação do ferro da sua forma de armazenamento no fígado (nas lesões
hepatocelulares), diminuição da sua utilização na formação da hemoglobina principalmente nas neoplasias da medula
óssea e na hemólise aumentada nas doenças hemolíticas, onde teremos uma elevação na destruição da hemoglobina
liberada e conseqüentemente liberação de ferro.
A diminuição sérica ocorrerá na gravidez, crianças alimentadas unicamente com leite, nos casos de grandes hemorragias e
menstruação abundante.
3. PRINCÍPIO DO MÉTODO
O íon férrico presente na amostra e unido a transferrina é liberado por ação do guanidinio e reduzido a ferroso pela
hidroxilamina. O íon ferroso forma um complexo colorido com a ferrozina que se pode quantificar através de leitura
espectrofotométrica.
4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
Preparo do paciente
Recomenda-se jejum mínimo de 8 horas. Para controle terapêutico, é aconselhável colher a amostra sempre no mesmo
horário, devido a variações diurnas do ferro sérico.
Amostras:
Usar soro.
5. COMPONENTES DO KIT
Reativo A: Tampão acetato 100 mmol – pH 4,9, cloridrato de guanidina 4,5 mmol/L, hidroxilamina 0,1 mmol/L.
Reativo B: Ferrozine 40 mmol/L.
Padrão de Ferro: Solução de Ferro (valor da concentração do padrão vide etiqueta do frasco)
ATENÇÃO: OS REAGENTES SÃO NOCIVOS E IRRITANTES. NÃO PIPETAR COM A BOCA E EVITAR O CONTATO
COM OS OLHOS E A PELE.
y Reagente pronto para uso.
y Estabilidade: Estável até a data de validade do kit.
y Conservar entre 2-8 ºC.
58
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO
Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo.
Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.
8. CONTROLE DE QUALIDADE
Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.
Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.
9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES
59
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
Preparação do reativo:
Reativos prontos pra uso
Procedimento manual
Dois tubo/amostra
1. Pipetar:
Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).
Cuidados especiais
y Limpeza do material: todo material a ser utilizado na técnica deve estar livre de íons ferro. Deve-se deixar o
mesmo submerso em uma solução de Ácido Nítrico ou Clorídrico 10-15%, por 6 horas e, após, eliminar a
acidez com numerosas lavagens com água deionizada (livre de ferro), condutividade menor que 0,01
μSiemens.
y Secar o material a no máximo 80ºC em estantes de aço inox ou revestidos de plástico.
y Todo material utilizado nos procedimentos deve ser de plástico ou acrílico.
y ATENÇÃO: OS REAGENTES SÃO NOCIVOS E IRRITANTES. NÃO PIPETAR COM A BOCA E EVITAR O
CONTATO COM OS OLHOS E A PELE.
11. CÁLCULOS
A2 = Absorbância da amostra
A1 = absorbância do Branco da amostra
P2 = absorbância do padrão
P1 = absorbância do Branco do Padrão
[P] = valor do padrão
Exemplo:
A2 = 0,156 Ferro(μg/dL)= 0,156-0,042 x 100
A1 = 0,042 0,108-0,006
P2 = 0,108P1 = 0,006
[P] = 100 mg/dL Ferro (μg/dL) = 0,114 x 100
0,102
Valores de Referência:
Para amostras de Soro e Plasma:
y Homens: 70-155 µg/dL = 12,5 - 27,7 µmol/L
60
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
y Linearidade
Reação linear até 500 µg/dL = 89.5 µmol/L
Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos
valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.
y Interferências
Não devem ser usados soros lipêmicos, ictéricos ou hemolisados.
Falsos Valores elevados:
Falsos Valores baixos:
FERRO CRX
Método Cromazurol B
1. INDICAÇÃO MÉDICA
Esta dosagem é utilizada principalmente na avaliação de anemias, anemias hemolíticas, neoplasias da medula óssea e
hepatopatias.
61
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
O ferro é um íon importante para a formação da hemoglobina, mioglobina e outras substâncias como os citocromos, a
citocromo oxidase, a peroxidase e a catalase, por isso é essencial conhecer os meios pelos quais o ferro é utilizado no
corpo.
A quantidade total de ferro no corpo é em média de cerca de 4g, dos quais cerca de 65% estão presentes na forma de
hemoglobina. Cerca de 4% estão presentes sob forma de mioglobina, 1% sob forma dos diversos compostos hêmicos que
promovem a oxidação celular, 0.1% combinado à proteína transferrina no plasma sangüíneo e 15 à 30% armazenados,
principalmente no fígado sob forma de ferritina.
Haverá um aumento de ferro sérico no tratamento de anemias com ferro, neoplasia da medula óssea, drogas
mielossupressoras, anemia hemolítica e perniciosa, hepatopatias virais e crônicas.
Esse aumento ocorre pelo fato da liberação do ferro da sua forma de armazenamento no fígado (nas lesões
hepatocelulares), diminuição da sua utilização na formação da hemoglobina principalmente nas neoplasias da medula
óssea e na hemólise aumentada nas doenças hemolíticas, onde teremos uma elevação na destruição da hemoglobina
liberada e conseqüentemente liberação de ferro.
A diminuição sérica ocorrerá na gravidez, crianças alimentadas unicamente com leite, nos casos de grandes hemorragias e
menstruação abundante.
3. PRINCÍPIO DO MÉTODO
O ferro sérico reage com o cromazurol B do CTMA-Br para formar um complexo colorido azul. A intensidade de cor do
complexo é proporcional a concentração de ferro presente na amostra.
4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
Preparo do paciente
Recomenda-se jejum mínimo de 8 horas. Para controle terapêutico, é aconselhável colher a amostra sempre no mesmo
horário, devido a variações diurnas do ferro sérico.
Amostras:
Usar soro. Não utilizar amostra hemolisada.
5. COMPONENTES DO KIT
Reagente: Cromazurol B 0.13 mM, brometo de CTMA 0.82 mM, tampão acetato pH 4.75.
Padrão de Ferro: Solução de Ferro (valor da concentração do padrão vide etiqueta do frasco)
ATENÇÃO: OS REAGENTES SÃO NOCIVOS E IRRITANTES. NÃO PIPETAR COM A BOCA E EVITAR O CONTATO
COM OS OLHOS E A PELE.
Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo.
Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.
8. CONTROLE DE QUALIDADE
Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.
Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.
9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES
Preparação do reativo:
Reativo pronto pra uso
Procedimento manual
1. Pipetar em tubos de ensaio:
63
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).
Cuidados especiais
y Limpeza do material: todo material a ser utilizado na técnica deve estar livre de íons ferro. Deve-se deixar o
mesmo submerso em uma solução de Ácido Nítrico ou Clorídrico 10-15%, por 6 horas e, após, eliminar a
acidez com numerosas lavagens com água deionizada (livre de ferro), condutividade menor que 0,01
μSiemens.
y Secar o material a no máximo 80ºC em estantes de aço inox ou revestidos de plástico.
y Todo material utilizado nos procedimentos deve ser de plástico ou acrílico.
y ATENÇÃO: OS REAGENTES SÃO NOCIVOS E IRRITANTES. NÃO PIPETAR COM A BOCA E EVITAR O
CONTATO COM OS OLHOS E A PELE.
11. CÁLCULOS
Aa Æ Absorbância da Amostra
Ap Æ Absorbância do Padrão
[P] Æ Concentração do Padrão
Exemplo:
Aa=0,120 F= 100 = 854,7
Ap=0,117 0,117
[P]=100 μg/dL Ferro (μg/dL) = 0,12 X 854,7 = 102,6 μg/dL
Valores de Referência
Homens: 59 - 158 µg/dL = 10,6 - 28,3 μmol/L
Mulheres: 37 - 145 µg/dL = 6,62 – 25,9 μmol/L
Esses valores são unicamente orientativos. Recomenda-se que cada laboratório estabeleça seu próprio intervalo de
referência.
y Linearidade
Reação linear até 500 μg/dL = 89.5 μmol/L
Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos
valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.
y Interferências
Não devem ser utilizados soros hemolisados.
Recomenda-se utilizar um branco da amostra com água destilada se a amostra for fortemente ictérica (Bilirrubina Total >
3 mg/dL). Soros lipêmicos ou hemolisados não são apropriados para esta Técnica.
y Ferro CRX – Bula do Kit – BioTécnica Ind e Com. Ltda – Revisão Maio/2005.
y Inmetro – Boas Práticas de Laboratório Clínico e Listas de Verificação para Avaliação, Qualitymark ed., Rio de Janeiro,
1997.
y Manual de exames – Laboratório Fleury – 1999 – 200.
y Manual de exames – Laboratório H. Pardini – 2002 – 74
FOSFATASE ALCALINA
Método Cinético Colorimétrico
(DGKC – DEA)
1. INDICAÇÃO MÉDICA
65
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
A fosfatase alcalina é uma enzima com atividade ótima in vitro em pH próximo de 10, presente em muitos tecidos,
particularmente no epitélio intestinal, túbulo renal, osteoblastos, fígado e placenta. A forma presente no soro de adultos
normais origina-se principalmente do fígado e esqueleto e são acentuadamente dependentes da idade., Sua função precisa
no metabolismo ainda não está de todo compreendida e parece estar associada ao transporte lipídico no intestino e
processos de calcificação óssea.
Sua dosagem é de interesse na investigação de doenças hepatobiliares e ósseas associadas com hiperatividade
osteoblástica. Os níveis mais altos de fosfatase alcalina são encontrados na doença de Paget. Mulheres no terceiro
trimestre de gravidez podem apresentar aumentos em torno de duas a três vezes do intervalo normal, devido a adicional
fração placentária. Em osteomalácia, podem ser encontrados aumentados moderados, que diminuem lentamente em
resposta à terapia por vitamina D. Visto elevar-se em metástases do fígado e ósseas, esta enzima pode funcionar como
marcador tumoral.
A resposta de suas frações, quando expostas a altas temperaturas, pode ser mais um auxílio na identificação de suas
isoenzimas.
3. PRINCÍPIO DO MÉTODO
A determinação de fosfatase alcalina é feita através de método cinético com emprego do 4-nitrofenilfosfato de sódio. Neste
método, baseado na DGKC, o 4-nitrofenilfosfato de sódio é hidrolisado especificamente pela fosfatase alcalina do soro em
pH9,8, liberando o 4-nitrofenol, cuja velocidade de formação, medida a 405 nm, é proporcional à atividade da enzima
presente.
FAL
4-Nitrofenilfosfato + H2O ---------------> 4-Nitrofenol + fosfato
4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
Preparo do paciente
O paciente deve estar em jejum de, pelo menos, 08 horas.
Amostras
Soro e plasma.
5. COMPONENTES DO KIT
66
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO
Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo.
Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.
8. CONTROLE DE QUALIDADE
Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.
Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.
9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES
67
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
y A água utilizada na limpeza do material deve ser recente e isenta de agentes contaminantes. A limpeza da vidraria
deve ser feita com detergente neutro. O enxágüe deve ser exaustivo, sendo o último, com água destilada ou
deionizada. Fazer referência ao manual ou POP de Controle de Qualidade de Água ou Água Reagente
y A limpeza e secagem adequadas do material são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção
de resultados corretos. Fazer referência ao Manual ou POP de limpeza e validação da qualidade da limpeza dos
materiais.
y Usar pipetas de vidro e ponteiras descartáveis separadas para cada amostra, controle (se utilizado) e reagente. Não
trocar as tampas dos frascos de reagentes. Isso evitará contaminação cruzada, o que poderia causar resultados
errôneos.
Procedimento manual
1. Pré-aquecer o Reagente de Trabalho a temperatura desejada durante uns minutos.
2. Pipetar em uma cubeta:
Amostra 20μL
Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).
Cuidados especiais
y Como ocorre com toda reação enzimática, a rigorosa observação do tempo e da temperatura de incubação é de
grande importância para a qualidade dos resultados obtidos.
11. CÁLCULOS
Usando as leituras das absorbâncias, calcular a média da variação da absorbância por minuto (ΔA/min):
Exemplo:
A0 = 1,179
A1 = 1,225
A2 = 1,266
A3 = 1,312
ΔA/min = (1,225 – 1,179) + (1,266-1,225)+ (1,312-1,266)
3
ΔA/min = 0,044
Valores de Referência
37ºC
Adultos 100 - 290 U/L
Crianças 180 - 1200 U/L
68
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
Estes valores são unicamente orientativos. É recomendável que cada laboratório estabeleça seu próprio intervalo de
referência.
y Linearidade:
A reação é linear até ΔA/min: 0,250 = 700U/L.
Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos
valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.
y Interferências:
• Ácido ascórbico (vitamina C) maior que 400 mg/L
• Glicose maior que 500 mg/dL
• Triglicérides maior que 1200 mg/dL
• Os anticoagulantes fluoreto, oxalato, citrato e EDTA interferem.
• A hemólise interfere devido a fosfatase alcalina eritrocitária.
• A presença de Mg2+ e Zn2+, produz um aumento nos resultados.
FÓSFORO - UV
Método Molibdato
1. INDICAÇÃO MÉDICA
Esta dosagem é utilizada na avaliação da insuficiência renal, função da paratireóide, fraturas ósseas e em lesões
musculares extensas.
69
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
O fósforo é um importante elemento, amplamente distribuído pelo organismo na forma de fosfato orgânico ou inorgânico.
Em torno de 85% dos 600g deste elemento (medido como fósforo inorgânico) em adultos está presente no esqueleto. O
restante é principalmente combinado com lipídios, proteínas, carboidratos e incorporados a outras substâncias orgânicas
como fosfolipídios, ácidos nucléicos, fosfoproteinas e compostos de alta energia envolvidos na integridade celular
(estocagem e troca de energia).
Três órgãos são majoritariamente comprometidos com a homeostasia do fósforo: intestino delgado (absorção), rins
(filtração e reabsorção) e esqueleto (estocagem).
Em torno de 2/3 do fosfato ingerido é absorvido (absorção ativa) principalmente no jejuno e o restante é excretado pelas
fezes. A absorção é aumentada no decréscimo da ingestão de cálcio, na acidez do conteúdo intestinal e também pela
ação da vitamina D e hormônio de crescimento (GH). A ação do hormônio da paratireóide (PTH) na sua absorção é
provavelmente um efeito indireto do metabolismo da vitamina D. Cerca de 90% do fósforo plasmático é filtrado pelos
glomérulos e quase totalmente reabsorvido pelos túbulos. Os níveis séricos de fósforo são inversamente proporcionais
aos do cálcio sérico. O aumento do fósforo sérico ocorre por diminuição da filtração glomerular, aumento da reabsorção
tubular renal e aporte exógeno ou endógeno. A diminuição ocorre por desordens tubulares e aumento das perdas. O PTH
inibe a sua reabsorção tubular renal.
É recomendada a coleta pela manhã devido a relatos de variações diurnas.
Fósforo Urinário
Fosfato urinário varia com idade, massa muscular, função renal, hormônio da paratireóide, hora do dia e dieta.
Este parâmetro é mais informativo quando efetuado em urina de 24 horas, devido a sua variação diária.
3. PRINCÍPIO DO MÉTODO
O fósforo inorgânico presente na amostra reage com o molibdato de amônio, em meio ácido, originando o complexo
fosfomolibdato, que quantifica-se por espectrofotometria à 340 nm. A absorbância é proporcional a quantidade de fósforo
inorgânico presente na amostra.
4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
Preparo do paciente
O paciente deve estar em jejum de, pelo menos, 08 horas.
70
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
Amostras
Soro, plasma ou urina.
5. COMPONENTES DO KIT
Reagente: Solução de Molibdato de Amônio 0,5 mmoL, Ácido sulfúrico 220 mmol/L; Triton X 0,1%.
Padrão: Solução de fósforo inorgânico (Vide valor da concentração do padrão na etiqueta do frasco)
O reagente de fósforo é cáustico e pode produzir queimaduras. No caso de contato com os olhos, deve-se lavar
imediatamente com grande quantidade de água e procurar auxílio médico. Deve-se utilizar os equipamentos de
proteção adequados para manipular reagentes cáusticos.
6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO
Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo.
Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.
8. CONTROLE DE QUALIDADE
Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.
71
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.
9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES
Preparo do reagente:
Reagente pronto para uso.
Procedimento manual
1. Pipetar em tubos de ensaio:
o
2. Homogeneizar, incubar à 37 C por 5 minutos.
3. Ler a absorbância do Padrão e da Amostra, zerando o aparelho com o Branco à 340 nm.
A cor é estável por 1 hora.
Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).
Cuidados especiais
y O uso de detergente iônico para limpar o material é outra fonte de contaminação com íons de fósforo.
11. CÁLCULOS
72
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
Devido a ótima reprodutibilidade, que pode ser obtida com a metodologia, pode-se utilizar o método do fator:
Valores de referência
• Soro, plasma: Adultos: 3,0 – 4,5 mg/dL
Crianças: 4,0 – 6,5 mg/dL
y Linearidade
Reação linear até 15 mg/dL = 4,84 mmol/L .
Para amostra hiperlipêmicas ou com conteúdo elevado de Bilirrubina é preferível fazer um branco da amostra adicionando
100 μL de amostra + 3 mL de água destilada. Obtendo-se o valor da absorbância da amostra (Aamostra).
Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos
valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.
y Interferências
Valores do branco elevados indicam contaminação, se os valores forem superiores a 0,600 A, desprezar o reativo.
Plasmas citratados, oxalados, fluoretados ou com EDTA produzem resultados falsamente diminuídos.
Anticoncepcionais, acetazolamida, salbutamol, alendronato, azatioprina, isoniazida, lítio e prometazina podem interferir nos
resultados.
FRUTOSAMINA
Método Cinético Colorimétrico
1. INDICAÇÃO MÉDICA
73
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
A glicose presente no plasma humano reage com diversas proteínas formando glicoproteínas estáveis sendo a principal
delas a albumina. Esta reação se dá através da ligação covalente da glicose com resíduos de lisina das proteínas
sanguíneas dando origem a bases de Schiff, as quais, num segundo momento, se transformam irreversivelmente em
cetoaminas estáveis (frutosaminas). Logo, a determinação de frutosamina trata-se basicamente da medição destas
glicoproteínas no soro. Desta forma, os níveis de Frutosamina no sangue são um reflexo direto dos níveis de glicose
sanguíneo tendo sua determinação grande utilidade no controle glicêmico de pacientes diabéticos ou de pacientes
hipoglicêmicos. A concentração de Frutosamina reflete o índice de variação de glicose durantes as últimas duas a três
semanas prévias à coleta da amostra.
3. PRINCÍPIO DO MÉTODO
Em meio alcalino as frutosaminas (proteínas séricas glicadas) presentes na amostra reduzem o reagente azul de
nitrotetrazol formando cor roxo-azulada. A intensidade desta coloração é proporcional a concentração de frutosamina
presente na amostra e é então determinada em espectrofotômetro a 520 nm.
4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
Preparo do paciente
O paciente deve estar em jejum de, pelo menos, 08 horas.
Amostras
Soro.
Estável 7 dias de 2 a 8 ºC. Não usar amostras hemolisadas e separar o soro o mais rapidamente o possível.
5. COMPONENTES DO KIT
Reagente: Tampão Carbonato 200 mmol/L pH 10,3; Azul de Nitrotetrazol 0,25 mmol/L.
Calibrador: Soro liofilizado contendo albumina glicada (Valor da concentração: vide rótulo do frasco de calibrador).
Potencialmente Infectante.
6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO
74
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo.
Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.
8. CONTROLE DE QUALIDADE
Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.
Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.
9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES
Preparo do reagente:
Reagente pronto para uso.
Procedimento manual
4. Pipetar em tubos de ensaio:
75
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
11. CÁLCULOS
Valores de referência
Soro: 1,9 a 2,9 mmol/L
y Linearidade
A reação é linear de 0,2 a 8,5 mmol/L. Para valores superiores a 8,5 mmol/L, diluir a amostra com NaCl 150 mM (0,9%),
realizar nova dosagem e multiplicar o resultado obtido pelo fator de diluição.
Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.
76
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
Esta dosagem é utilizada na avaliação das colestases hepáticas, doenças obstrutivas da árvore biliar e no monitoramento
da administração de algumas drogas.
Esta enzima está presente em numerosos tecidos, mas a concentração mais elevada está nos rins, pâncreas e fígado.
É usada na avaliação das colestases hepática, doença obstrutiva da árvore biliar, no uso prolongado de drogas que
induzem o sistema microssomal hepático, como exemplo, fenitoína, fenobarbital, carbamazepina, ácido valpróico e
contraceptivos, e no acompanhamento do tratamento de alcólatras, nas neoplasias do fígado valores elevados podem
ocorrer. Diminuição dos valores podem ocorrer no uso de azatioprina, clofibrato, estrógenos e metrovidazol.
3. PRINCÍPIO DO MÉTODO
4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
Preparo do paciente
Recomenda-se jejum mínimo de 8 horas.
Amostras:
Soro ou plasma.
5. COMPONENTES DO KIT
6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO
77
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo.
Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.
8. CONTROLE DE QUALIDADE
Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.
Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.
9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES
78
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
Procedimento manual
1. Pré-aquecer o Reagente de Trabalho a temperatura desejada durante alguns minutos.
2. Pipetar:
Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).
Cuidados especiais
y Como ocorre com toda reação enzimática, a rigorosa observação do tempo e da temperatura de incubação é
de grande importância para a qualidade dos resultados obtidos.
11. CÁLCULOS
Usando as leituras das absorbâncias, calcular a média da variação da absorbância por minuto (ΔA/min).
A atividade de γ-GT na amostra é calculada pela multiplicação do ΔA/min, utilizando –se o seguinte fator
γ-GT = ΔA/min X F
Exemplo:
Valores de referência
37°C
Homens 10 – 47
Mulheres 7 – 30
Fator de correlação: 37°C / 30°C – 1’24
37°C / 25°C – 1’68
Estes valores são unicamente orientativos. É recomendável que cada laboratório estabeleça seu próprio intervalo de
referência.
y Linearidade:
A reação é linear até 1000 U/L.
Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos
valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.
79
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
y Interferências:
O etanol e vários fármacos induzem a síntese hepática da y-glutamiltransferase.
Anticoagulantes contendo citrato, fluoreto ou oxalato inibem a atividade da GGT.
Valores de Bilirrubina até 38 mg/dL, Hemoglobina até 180 mg/dL e Triglicérides até 1800 mg/dL não produzem
interferências significativas.
Falsos Valores elevados: Valores de Triglicérides entre 1800 e 3500 mg/dL produzem resultados falsamente elevados. O
uso de fenitoína, fenobarbital, carbamazepina, ácido valpróico e contraceptivos, também podem aumentar o valor da GGT.
Falsos Valores baixos: O uso de azatioprina, clofibrato, estrogenose metronidazol, podem causar resultados diminuídos.
y Commitee of the Scand. Soc. for Clin. Chem. – Scand. J. Clin. Lab.
y Invest., 366, 119 (1976).
y Szasz G. – Clin Chem. 22, 2051 (1976).
y γ - glutamiltransferase (Gama GT) – Bula do Kit – BioTécnica Ind e Com. Ltda – Revisão Maio/2005.
y Inmetro – Boas Práticas de laboratório Clínico e Listas de Verificação para Avaliação, Qualitymark ed., Rio de Janeiro,
1997.
y Manual de exames – Laboratório Fleury – 1999 – 215
y Manual de exames – Laboratório H. Pardini – 2002 – 78
80
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
GLICOSE
Método Enzimático Colorimétrico
1. INDICAÇÃO MÉDICA
Esta dosagem é utilizada na avaliação do controle de produção, consumo e armazenamento da glicose no organismo.
* Ácido Acetilsalicílico, atropina, ácido ascórbico, anticonvulsivantes, diuréticos (tiazídicos, clortalidona, ácido etacrínico,
furosemida), adrenalina, corticóide, dopamina, indometacina, rifampicina, estrogênios, carbonato de lítio, contraceptivos
orais, tiabendazol, etc.
** Bloqueadores pela adrenérgicos, esteróides anabólicos, anti-histamínicos, etanol, inibidora da MAO, acetaminofen,
levodopa, etc.
Glicose, Líquor
Níveis Aumentados Níveis Diminuídos
Hiperglicemia diabética Hemorragias subaracnóides
Encefalite epidêmica Meningoencefalites não
bacterianas
Glicose sérica aumentada Meningite piogênica aguda
Meningite tuberculósica
Meningite criptocócica
Sífilis neurológica
Sarcoidose
Tumor primário ou metastático
das meninges
3. PRINCÍPIO DO MÉTODO
A enzima glicose oxidase catalisa a oxidação da glicose existente na amostra, em presença de oxigênio, produzindo
peróxido de hidrogênio. A enzima peroxidase catalisa a oxidação do fenol pelo peróxido de hidrogênio formado, em
presença de 4-amino-antipirina, produzindo um composto róseo-avermelhado (quinonimina), que apresenta um máximo de
absorção em 500 nm. A intensidade de cor é proporcional à concentração de glicose na amostra.
glicose oxidase
Glicose + O2 + H2O --------------------> Ácido Glucônico + H2O2
peroxidase
81
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
Preparo do paciente
Glicemia de jejum: recomenda-se jejum mínimo de 8 horas.
Amostras
Soro.
5. COMPONENTES DO KIT
Reagente: Tampão fosfato 182,42 mmol/L - pH 7,0; 4-Aminoantipirina 0,3 mmol/L; GOD-Glicose oxidase > 15000 U/L;
POD-Peroxidase > 1200 U/L; Fenol 10 mmol/L.
Padrão: Solução de Glicose (valor da concentração do padrão vide etiqueta do frasco)
y Reagente pronto para uso.
y Estabilidade: Estável até a data de validade do kit.
y Conservar entre 2 - 8ºC.
6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO
Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo.
Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.
8. CONTROLE DE QUALIDADE
82
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.
Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.
9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES
Preparação do reativo:
Reativo pronto pra uso.
Procedimento manual
1. Deixar o Reagente durante alguns minutos à temperatura ambiente ou em banho de água.
2. Pipetar em tubos de ensaio:
3. Agitar bem e incubar os tubos durante 10 minutos a 37ºC ou durante 15 minutos a temperatura ambiente 25ºC.
4. Ler a absorbância (AP) do Padrão e (AA) da Amostra frente ao Branco a 505 nm.
A cor é estável durante pelo menos 1 hora.
Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).
83
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
11. CÁLCULOS
Devido a ótima reprodutibilidade, que pode ser obtida com a metodologia, pode-se utilizar o método do fator:
Valores de referência
Soro ou plasma: 70 a 110 mg/dL
Líquor: 40 a 75 mg/dL, (2/3 da glicemia)
Esses valores são unicamente orientativos. Recomenda-se que cada laboratório estabeleça seu próprio intervalo de
referência.
y Linearidade:
Até 400 mg/dL = 22 mmol/L
Para valores superiores, diluir a amostra 1:2 ou 1:4 com NaCl 0,85%, repetir a dosagem e multiplicar o resultado pelo fator
de diluição.
Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos
valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.
y Interferências:
O ácido ascórbico (5 mg/dL), a hemoglobina (0,2 g/dL) e a bilirrubina (40 mg/dL) não interferem. A lipemia moderada não
afeta os resultados.
84
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
MAGNÉSIO MONO
Método colorimétrico
MAGON SULFONADO
1. INDICAÇÃO MÉDICA
Magnésio Sérico
É o quarto mais abundante cátion no organismo humano. Atua como um c-fator essencial para enzimas ligadas à
respiração celular, glicólise e transporte (através da membrana) de outros cátions (cálcio e sódio). O magnésio é essencial
para a preservação da estrutura molecular de DNA, RNA e ribossomas. Um terço do magnésio sérico é ligado à proteína,
principalmente à albumina; os outros 2/3 existem predominantemente como íon livre e um pequeno percentual como
complexo de ânions. O magnésio ingerido é absorvido no intestino delgado e excretado na urina. O processo de absorção
parece ser de controle deficiente, sendo afetado por síndromes de má-absorção, com sua homeostase exercida
basicamente pela excreção renal (a qual é regulada pela reabsorção tubular). Diminuições do magnésio são mais
significativas e frequentes que o excesso, e sintomas dessa depleção não ocorrem em níveis séricos até 1,0 mEq/L.
Severas diminuições estão ligadas à função neuromuscular como tetania, convulsão, fraqueza, irritabilidade e delírio. Níveis
baixos de magnésio, após um infarto do miocárdio, podem indicar um mau prognóstico.
Níveis aumentados
Uso de sais de magnésio
Antiácidos e laxantes
Doença de Addison
Desidratação grave
Insuficiência renal
Acidose diabética
Hipertireoidismo
Hipercalcemia
Níveis diminuídos
Associados com hipocalemia e
hipocalcemia
Alcoolismo crônico
Pancreatite aguda
Má-absorção
Lactação excessiva
Diálise
Diarréia grave
Diabetes mellitus
Terapia diurética
Dietas pobres em magnésio
Hiperaldosteronismo primário
Má-nutrição
Nefropatias tubulares
Hiperparatireoidismo
Hiperaldosteronismo
Magnésio Urinário
A excreção do magnésio está intimamente ligada à dieta. Sua análise tem sido utilizada antes e após administração
terapêutica de magnésio.
Níveis Aumentados
Álcool
Diuréticos
Síndrome de Bartter
Glomerulonefrite crônica
Aldosteronismo
85
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
Níveis Diminuídos
Dieta pobre
Má-absorção
Hipoparatireoidismo
Decréscimo da função renal
3. PRINCÍPIO DO MÉTODO
O magnésio presente na amostra reage com azul de xilidina II (Magon Sulfonado) em meio alcalino formando um complexo
intensamente corado com máximo de absorção em 510 nm. O desenvolvimento de um monoreagente líquido estável, sem
solventes orgânicos voláteis, torna o método especialmente adaptável a analisadores automáticos.
4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
Preparo do paciente
O paciente deve estar em jejum de, pelo menos, 08 horas.
Amostras
Soro, plasma e urina.
5. COMPONENTES DO KIT
Reagente: Carbonato de potássio 120 mM, EGTA 40 mM, Magon sulfonado (xilidil blue) 0,1 mM e azida sódica 18,5 mM.
Padrão: Solução aquosa de íons Magnésio (valor da concentração do padrão vide etiqueta do frasco).
6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO
86
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo.
Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.
8. CONTROLE DE QUALIDADE
Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.
Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.
9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES
Procedimento manual
1. Os reagentes devem estar a temperatura ambiente.
2. Pipetar em tubos de ensaio:
87
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).
Cuidados especiais
y O uso de detergente iônico para limpar o material é outra fonte de contaminação com íons magnésio.
11. CÁLCULOS
Onde
Aa → Absorbância da Amostra
Ap → Absorbância do Padrão
Padrão → Valor da Concentração do Padrão
Magnésio (mg/dL) = Aa x F
F= 2 = 10,5
Exemplo: 0,191
Aa = 0,175
Ap = 0,191 Magnésio(mg/dL) = 0,175 x 10,5 = 1,8 mg/dL
Valor Padrão = 2,0 mg/dL
Valores de referência
Para amostras de Soro e Plasma: 1,9 – 2,5 mg/dL
Para amostras de Urina/24 h: 48 – 152 mg/24h
Liquido Céfalo Raquidiano: 2,5 – 3,5 mg/dL
Esses valores são unicamente orientativos. Recomenda-se que cada laboratório estabeleça seu próprio intervalo de
referência.
y Linearidade
A reação é linear até 4,5 mmol/L.
Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos
valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.
y Interferências
Hiperlipemia, ácido ascórbico, mesmo em elevadas concentrações (acima de 26 mg/dL) e bilirrubina (até 20 mg/dL) não
interferem.
Devido ao alto conteúdo intracelular de megnésio, hemólises mesmo discretas interferem significativamente. Não utilizar
amostras hemolisadas.
y Magnésio - Magon – Bula do Kit – BioTécnica Ind e Com. Ltda – Revisão Maio/2005.
y Inmetro – Boas Práticas de Laboratório Clínico e Listas de Verificação para Avaliação, Qualitymark ed., Rio de Janeiro,
1997.
y Manual de exames – Laboratório Fleury – 1999 – 324-325
y Manual de exames – Laboratório H. Pardini – 2002 – 87
89
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
PROTEÍNA TOTAL
Método Colorimétrico
1. INDICAÇÃO MÉDICA
A dosagem isolada da proteína total tem pouco valor clínico, porque a alteração em uma das frações pode ser compensada
por alteração oposta de outra fração, como ocorre nas doenças crônicas, em que há diminuição de albumina com aumento
de gamaglobulina.
O nível de proteínas séricas é basicamente um reflexo de sínteses hepáticas ou de perda de proteínas devido a
enfermidade renal, desnutrição severa, queimaduras graves e hemodiluição.
A eliminação excessiva de proteínas pelos rins ou a diminuição da síntese hepática provoca uma diminuição na pressão
coloidosmótica do plasma, que aumenta a reabsorção de sódio e água levando a edema.
Valores Aumentados
A concentração de proteína total do soro está comumente aumentada em pacientes com desidratação, mieloma múltiplo,
macroglobulinemia, crioglobulinemia, lupus eritematoso, artrite reumatóide, sarcoidose, infecções crônicas, linfogranuloma
e endocardite bacteriana sub-aguda.
Valores Diminuídos
A concentração de proteína total do soro está diminuída na hiperhidratação, desnutrição grave, insuficiência renal, nefrose,
queimaduras graves, síndrome de má absorção, deficiência de cálcio e vitamina D.
3. PRINCÍPIO DO MÉTODO
A proteína presente na amostra reage com os íons cobre (II) em meio alcalino, originando um complexo de cor violácea,
cuja absorbância em 550 nm é proporcional à concentração protéica da amostra.
4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
Preparo do paciente
O paciente deve estar em jejum de, pelo menos, 08 horas.
Amostras
Soro e plasma.
5. COMPONENTES DO KIT
Reagente: Sulfato de cobre 10 mM, tartarato de sódio e potássio 15 mM, iodeto de potássio 15 mM, hidróxido de sódio 140
mM.
Padrão: Solução de Albumina bovina (valor da concentração do padrão vide etiqueta do frasco).
6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO
Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo
Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.
8. CONTROLE DE QUALIDADE
Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.
Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.
9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES
91
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
Preparação do reativo:
Reativo pronto pra uso
Procedimento manual
1. Pipetar em tubos de ensaio:
Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).
11. CÁLCULOS
Com fator
Fator de calibração (FC) = concentração do padrão
A do padrão
Exemplo:
A amostra = 0,352
A padrão = 0,25
Concentração do padrão = 5 g/dL
FC= 5,0 = 20 Proteína (g/dL) = 0,352 x 20
0,25
Proteína (g/dL) = 7,04 g/dL
Valores de referência
Valores Normais
Soro : 6,5 – 8,0 g/dL
Plasma: 6,8 – 8,3 g/dL
Estes valores são unicamente orientativos. Recomendamos que cada laboratório estabeleça seus próprios intervalos de
referência.
y Linearidade
A reação é linear até 12 g/dL.
Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos
valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.
y Interferências
92
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
y Gornall AG, Bardawill CS, David MM. J Biol Chem 1949; 177:751.
y Henry, R.: Sobel, C. & Berkman, S Anal Chem 29/10: 1491 (1957).
y Doumas, B. T: Watson, WA & Biggs. H.G Clin. Chim. Acta 31/1:87 (1971).
y Proteína Total – Bula do Kit – BioTécnica Ind e Com. Ltda – Revisão Maio/2005.
y Inmetro – Boas Práticas de laboratório Clínico e Listas de Verificação para Avaliação, Qualitymark ed., Rio de Janeiro,
1997.
y Manual de exames – Laboratório Fleury – 1999 – 398-400
y Manual de exames – Laboratório H. Pardini – 2002 – 90-91
93
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
PROTEÍNA URINÁRIA
Método Colorimétrico
1. INDICAÇÃO MÉDICA
A proteinúria é um marcador de doença renal e constitui um fator de risco independente para a sua progressão. Aumentos
ou decréscimos no valor de proteinúria são importantes marcadores do prognóstico renal do paciente. Dessa forma, em
pacientes com doença renal a pesquisa de proteinúria constitui um elemento importante no diagnóstico e no
acompanhamento.
A sua presença e a determinação do seu grau podem, em associação a outros achados, ajudar a estabelecer o diagnóstico
de certas síndromes ou entidades patológicas cujos achados renais são conhecidos.
A urina de pessoas saudáveis não contém proteínas ou contém somente em pequenas quantidades; normalmente o
glomérulo evita a passagem das mesmas do sangue para o filtrado glomerular.
Alterações glomerulares causam o aumento da permeabilidade das proteínas plasmáticas o que ocasiona a proteinúria.
A presença persistente de proteína na urina indica enfermidade renal.
Concentrações elevadas de proteínas no líquido cefalorraquidiano (Líquor) podem ser devidas a infecções ou à pressão
intracraniana elevada.
O diagnóstico clínico deve ser realizado levando-se em conta todos os dados clínicos e de laboratório.
3. PRINCÍPIO DO MÉTODO
A proteína presente na amostra reage com o vermelho de pirogalol e o molibdato, em meio ácido, formando um complexo
colorido. A intensidade da cor formada é proporcional à concentração protéica da amostra.
4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
Amostras
Urina e Líquor.
Urina
- Utilizar amostra colhida no período de 24 horas, não havendo necessidade de adicionar conservantes.
- Homogeneizar a urina, medir o volume e separar uma amostra de cerca de 20 mL.
- Centrifugar por 10 minutos a 3000 rpm.
- Utilizar o sobrenadante para proceder o ensaio.
Líquor:
Utilizar amostra centrifugada.
5. COMPONENTES DO KIT
Reagente: Vermelho de pirogalol 0,04 mmol/L, Molibdato de sódio 0,13 mmol/L, Ácido succínico 0,05 Mol/L, pH 2,5.
Oxalato de sódio 1 mmol/L, Benzoato de sódio 0,35 mmol/L, SDS 0,1mmol/L.
Padrão: Solução de Albumina (valor de padrão: vide rótulo do frasco).
94
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO
Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo
Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.
8. CONTROLE DE QUALIDADE
Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.
Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.
9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES
Preparação do reativo:
Reativo pronto pra uso
95
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
Procedimento manual
Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).
11. CÁLCULOS
Urina de 24horas:
Líquor (LCR):
A Amostra X concentração do padrão = mg/L proteínas
A Padrão
Com fator
Fator de calibração (FC) = concentração do padrão
A Padrão
Exemplo:
A amostra = 0,025
A padrão = 0,133
Concentração do padrão = 1000 mg/L
Volume urinário 24h = 1,2L
Valores Normais
CRIANÇAS ADULTOS
Líquor 300 - 1000 mg/L 150 - 450 mg/L
Estes valores são unicamente orientativos. Recomendamos que cada laboratório estabeleça seus próprios intervalos de
referência.
y Linearidade
A linearidade da reação é de 3000 mg/L. Para valores superiores, diluir a amostra com água deionizada ou destilada,
realizar nova dosagem e multiplicar o resultado obtido pelo fator de diluição. Indicar o procedimento de diluição adotado
pelo laboratório.
96
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
y Interferências
• Watanabe, N. Kamei, S., Ohkubo, A., Yamanaka, M., Oshawa, S., Clin. Chem. 32: 1551 (1986).
• Orsonneau JL et al. An Improved Pyrogallol Red-Molybdate Method for Determing Total Urinary Protein. Clin Chem 1989;
35:2233-22236.
• Koller A. Total serum protein. Kaplan A et. Al. Clin Chem The C.V. Mosby Co. St Louis. Toronto. Princeton 1984; 1316-
1324 and 418.
• Young DS. Effects of drugs on Clinical Lab. Tests, 4th ed. AACC Press, 1995.
• Young DS. Effects of disease on Clinical Lab. Tests, 4th ed. AACC Press, 2001.
• Burtis A et al. Tietz Testbook of Clinical Chemistry, 3rd ed. AACC 1999.
• Tietz N W et al. Clinical Guide to Laboratory tests, 3rd ed. AACC 1995.
• Westgard J. O., Barry P. L., Hunt M. R., Groth T. A multi-rule Shewhart chart quality control in clinical chemistry. Clin.
Chem., 27: 493-501, 1981.
97
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
TGO / AST
Método Cinético - UV
1. INDICAÇÃO MÉDICA
Esta dosagem é utilizada na avaliação de hepatites agudas e é um bom indicador no diagnóstico de infarto agudo do
miocárdio.
3. PRINCÍPIO DO MÉTODO
O Aspartato aminotransferase (AST ou GOT) catalisa a transferência do grupo amino do aspartato a 2-oxo-glutarato,
formando oxalacetato e glutamato. A concentração catalítica se determina, empregando a reação acoplada de malato
desidrogenase (MDH), a partir da velocidade de desaparecimento do NADH, medido à 340 nm.
AST
L-Aspartato + 2-Oxoglutarato -----------> Oxaloacetato + L-Glutamato
MDH
Oxalacetato + NADH + H+ ------------> Malato + NAD+
LDH
Piruvato endógeno + NADH ------------> L- Lactato + NAD
4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
Preparo do paciente
Recomenda-se jejum mínimo de 8 horas.
Amostra
Soro ou plasma.
5. COMPONENTES DO KIT
Reagente A: Tampão Tris 80 mmol - pH 7,8., L-aspartato 240 mmol, MDH - malato desidrogenase > 600 U/L, LDH - lactato
desidrogenase > 1200 U/L,
Reagente B: Malato desidrogenase 0,18 mmol, 2-Oxoglutarato: 12mmol.
6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO
Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo.
Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.
8. CONTROLE DE QUALIDADE
Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.
Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.
9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES
99
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
y A água utilizada na limpeza do material deve ser recente e isenta de agentes contaminantes. A limpeza da vidraria
deve ser feita com detergente neutro. O enxágüe deve ser exaustivo, sendo o último, com água destilada ou
deionizada. Fazer referência ao manual ou POP de Controle de Qualidade de Água ou Água Reagente
y A limpeza e secagem adequadas do material são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção
de resultados corretos. Fazer referência ao Manual ou POP de limpeza e validação da qualidade da limpeza dos
materiais.
y Usar pipetas de vidro e ponteiras descartáveis separadas para cada amostra, controle (se utilizado) e reagente. Não
trocar as tampas dos frascos de reagentes. Isso evitará contaminação cruzada, o que poderia causar resultados
errôneos.
Procedimento manual
1. Pré-aquecer o Reagente de Trabalho durante 5 minutos, à 37ºC.
2. Pipetar em uma cubeta:
37oC
Reagente de Trabalho 1000 μL
Amostra 100 μL
Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).
Cuidados especiais
y Como ocorre com toda reação enzimática, a rigorosa observação do tempo e da temperatura de incubação é de
grande importância para a qualidade dos resultados obtidos.
11. CÁLCULOS
Usando as leituras das absorbâncias, calcular a média da variação da absorbância por minuto (∆A/min.).
A atividade da TGO na amostra é calculada pela multiplicação do ∆A/minuto pelo seguinte fator:
Exemplo:
Temperatura = 37ºC
A0= 1,268
A1= 1,228
A2= 1,189
A3= 1,152
Valores Normais:
100
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
37ºC
HOMENS até 37 U/L
MULHERES até 31 U/L
Estes valores são unicamente orientativos sendo recomendável que laboratório estabeleça seus próprios intervalos de
referência.
y Linearidade:
A reação é linear até: ΔA/min de 0,250 = 440 U/L.
Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos
valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.
y Interferências:
Falsos valores elevados: Acetaminofem, Anfotericina B, Alopurinol, Anticoncepcionais orais, Metildopa, Fenotiazinas,
Colchicina, Narcóticos, Corticoesteróides, Barbiturados.
Falsos valores baixos: Salicilatos (aspirina)
101
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
TGP / ALT
Método Cinético - UV
1. INDICAÇÃO MÉDICA
Esta dosagem é utilizada na avaliação de pacientes com lesões hepáticas virais, tóxicas e cirrose.
A Transaminase Pirúvica – TGP (sinonímia: Alanina Aminotransferase (ALT), é uma enzima intracelular presente em
grandes quantidades no fígado e rim, e pequenas quantidades na musculatura esquelética e coração. Como teste de
função hepática, a ALT é mais sensível para detecção de danos do hepatócito do que para obstrução biliar, sendo
considerada um excelente marcador hepatocelular. Níveis elevados são encontrados na hepatite infecciosa e tóxica,
doença pancreática, cirrose, icterícia obstrutiva e carcinoma metastático. Em pacientes com infarto do miocárdio a ALT
geralmente está normal ou ligeiramente elevada. Entretanto, insuficiência cardíaca ou choque com necrose hepática
concomitante pode levar a elevações de seus níveis.
3. PRINCÍPIO DO MÉTODO
A Alanina Aminotransferase (ALT ou GPT) catalisa a transferência do grupo amino da alanina a 2-oxoglutarato, formando
piruvato e glutamato. A concentração catalítica se determina, empregando a reação acoplada de lactato desidrogenase
(LDH), a partir da velocidade de desaparecimento do NADH, medido à 340 nm.
LDH
ALT
L - alanina + 2-Oxoglutarato -----------> Piruvato + L-Glutamato
LDH
Piruvato + NADH ------------> D - Lactato + NAD+
4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
Preparo do paciente
Recomenda-se jejum mínimo de 8 horas.
Amostra:
Soro ou plasma.
5. COMPONENTES DO KIT
Reagente A: Tampão Tris 100 mmol - pH 7,5, L-alanina 500 mmol, MDH - malato desidrogenase > 600 U/L, LDH - lactato
desidrogenase > 1200 U/L,
Reagente B: Malato desidrogenase 0,18 mM, 2-Oxoglutarato: 15mM.
102
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO
Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo.
Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.
8. CONTROLE DE QUALIDADE
Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.
Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.
9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES
y A limpeza e secagem adequadas do material são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção
de resultados corretos. Fazer referência ao Manual ou POP de limpeza e validação da qualidade da limpeza dos
materiais.
y Usar pipetas de vidro e ponteiras descartáveis separadas para cada amostra, controle (se utilizado) e reagente. Não
trocar as tampas dos frascos de reagentes. Isso evitará contaminação cruzada, o que poderia causar resultados
errôneos.
Procedimento manual
6. Pré-aquecer o Reagente de Trabalho durante 5 minutos, `37ºC.
7. Pipetar em uma cubeta:
o
37 C
Reagente de Trabalho 1000 μL
Amostra 100 μL
Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).
Cuidados especiais
y Como ocorre com toda reação enzimática, a rigorosa observação do tempo e da temperatura de incubação é de
grande importância para a qualidade dos resultados obtidos.
11. CÁLCULOS
Usando as leituras das absorbâncias, calcular a média da variação da absorbância por minuto (∆A/min.):
A atividade da TGP na amostra é calculada pela multiplicação do ∆A/minuto pelo seguinte fator:
Fator (37ºC) 1746
Exemplo:
Temperatura: 37ºC
A0 = 1,297
A1 = 1,278
A2 = 1,263
A3 = 1,245
∆A/min.= (1,297 – 1,278) + (1,278 – 1,263) + (1,263 – 1,245)
3
∆A/min = 0,017
Valores Normais
104
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
37ºC
HOMENS até 42 U/L
MULHERES até 32 U/L
Estes valores são unicamente orientativos sendo recomendável que laboratório estabeleça seus próprios intervalos de
referência.
y Linearidade:
A reação é linear até: ΔA/min de 0,200 = 350 U/L.
Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos
valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.
y Interferências:
Falsos valores elevados: hemólise
y Wroblewski F., LaDue JS.- Proc. Sec. Exp. Biol. And med. 1956; 34:381
y Henry R.J. et al. – Am. Jnl. Clin. Path. 1960.
y Deustchen Gesellschaft fur Klinische Chemie (DGKC) Z. Klin. Chem. 10: 281 (1972).
y Scandinavian Society for Clinical Chemistry (SSCC) Scand. J. Clin. Lab. Invest. 33: 291 (1974).
y International Federation of Clinical Chemistry (IFCC) Clinica Chimica Acta 105: 147 (1980).
y TGP – Bula do Kit – BioTécnica Ind e Com. Ltda – Revisão Maio/2005.
y Inmetro – Boas Práticas de laboratório Clínico e Listas de Verificação para Avaliação, Qualitymark ed., Rio de Janeiro,
1997.
y Manual de exames – Laboratório Fleury – 1999 – 455
y Manual de exames – Laboratório H. Pardini – 2002 – 93
105
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
TRIGLICÉRIDES
Método Enzimático Colorimétrico
1. INDICAÇÃO MÉDICA
Esta dosagem é utilizada como parâmetro na avaliação dos riscos de doenças cardiovasculares.
Os triglicerídeos são ésteres de glicerol. Os triglicerídeos provenientes da dieta sofrem digestão no duodeno e íleo
proximal. Através da ação de lípases e ácidos biliares, são hidrolisados a glicerol e ácidos graxos. Após absorção são
ressintetisados nas células epiteliais intestinais e combinados com colesterol e apolipoproteínas para formar quilomícrons,
que são transportados via ducto torácico para a circulação.
O aumento de triglicerídeos no plasma é indicativo de distúrbios metabólicos.
Esta dosagem serve como parâmetro na avaliação dos riscos de doenças cardiovasculares, no diabetes, no
hipotireoidismo, na pancreatite aguda, na uremia, na obesidade e nos hábitos alimentares errôneos.
O aumento dos triglicerídeos no diabetes está relacionado ao aumento da mobilização das áreas de armazenamento de
lipídeos (triglicerídeos) em decorrência da diminuição da insulina, produzindo seu metabolismo anormal e depósito de
lipídeos nas paredes vasculares levando à arteriosclerose.
3. PRINCÍPIO DO MÉTODO
A enzima lípase lipoprotéica hidrolisa os triglicerídeos existentes na amostra, produzindo glicerol livre. A enzima glicerol
quinase fosforila o glicerol livre formado cujo produto, em presença de oxigênio e sob a ação catalítica da enzima glicerol-P-
oxidase, produz peróxido de hidrogênio. A enzima peroxidase catalisa a oxidação do reagente fenólico (p-clorofenol) pelo
peróxido de hidrogênio formado, em presença da 4-amino-antipirina, produzindo um composto róseo-avermelhado
(quinonimina), que apresenta um máximo de absorção em 500 nm.
lipase
Triglicérides ⎯⎯⎯→ Glicerol + Ácidos graxos
glicerol quinase
Glicerol + ATP ⎯⎯⎯⎯⎯⎯→ L-Glicerolfosfato + ADP
L-Glicerolfosfato-oxidase
L-Glicerolfosfato + O2 ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯→ Dihidroxiacetona-P + H2O2
peroxidase
2H2O2 + Clorofenol + 4-AF ⎯⎯⎯⎯⎯→ p-benzoquinona monoímio fenazona + 4 H2O
4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
Preparo do paciente
Recomenda-se jejum mínimo de 8 horas e jejum alcoólico de 24 horas.
Amostra
Soro ou plasma
5. COMPONENTES DO KIT
106
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
Reagente de Trabalho: GK – glicerolquinase > 1000 U/L; POD – Peroxidase > 1000 U/L; LPL – Lipoproteína lípase > 2000
U/L; GPO – Glicerol-3-fosfato oxidase > 5000 U/L; 4 clorofenol 2,7 mM; 4-aminoantipirina 0,3 mM; ATP - adenosina
trifosfato 2,0 mM; tampão Tris 50,0 mM pH 7,2.
Padrão: Solução de Glicerol equivalente à concentração de Triglicérides (valor da concentração do padrão vide etiqueta do
frasco)
6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO
Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo.
Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.
8. CONTROLE DE QUALIDADE
Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.
Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.
9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES
107
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
y Não utilizar o reativo quando este mostrar-se turvo ou com sinais de contaminação.
y A água utilizada na limpeza do material deve ser recente e isenta de agentes contaminantes. A limpeza da vidraria
deve ser feita com detergente neutro. O enxágüe deve ser exaustivo, sendo o último, com água destilada ou
deionizada. Fazer referência ao manual ou POP de Controle de Qualidade de Água ou Água Reagente
y A limpeza e secagem adequadas do material são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção
de resultados corretos. Fazer referência ao Manual ou POP de limpeza e validação da qualidade da limpeza dos
materiais.
y Usar pipetas de vidro e ponteiras descartáveis separadas para cada amostra, controle (se utilizado) e reagente. Não
trocar as tampas dos frascos de reagentes. Isso evitará contaminação cruzada, o que poderia causar resultados
errôneos.
Preparação do reativo:
Reativo pronto pra uso.
Procedimento manual
1. Deixar ambientar o Reagente durante alguns minutos à temperatura ambiente ou em banho de água.
2. Pipetar em tubos de ensaio:
3. Agitar bem e incubar os tubos durante 15 minutos à temperatura ambiente (16-25º C) ou durante 10 minutos a 37º
C.
4. Ler a absorbância (AP) do Padrão e (AA) da Amostra frente ao Branco a 500 nm.
A cor é estável durante pelo menos 1 hora.
Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).
Cuidados especiais
y Cuidado com a limpeza do material utilizado para os testes. Lavar no mínimo 3 vezes com água deionizada para
eliminar qualquer vestígio de Glicerol que é um forte contaminante nas reações do triglicérides.
11. CÁLCULOS
Com fator:
ƒc = valor do padrão
Apadrão
Exemplo:
Aamostra = 0,276 F= 200 = 806,5
Apadrão = 0,248 0,248
Valores de referência
30 - 170 mg/dl = 0.70 - 1.70 mmol/L
Esses valores são unicamente orientativos. Recomenda-se que cada laboratório estabeleça seu próprio intervalo de
referência.
108
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
y Linearidade:
A reação é linear até 1000 mg/dL Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o
valor encontrado fique dentro dos valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.
y Interferências
O ácido ascórbico (0,3 mmol/L), a hemoglobina (3 g/L) e a bilirrubina (0,25 mmol/L) interferem. A lipemia não afeta os
resultados.
y Schettler G., And Nussel E., Arb. Med. Prav. Med., 10 (1975) 25.
y Jacobs, N.J., Van Denmark, P.J. Aarch. Biochem. Biophys. 88 (1960), 250-255.
y Kodischek, L.K., Umbreit, W.W. Bacteriol. 98 (1969) 1063-1068.
y Trinder P. - Ann Clin Biochem 6 (1969); 24-27.
y Triglicérides – Bula do Kit – BioTécnica Ind e Com. Ltda – Revisão Maio/2005.
y Inmetro – Boas Práticas de Laboratório Clínico e Listas de Verificação para Avaliação, Qualitymark ed., Rio de Janeiro,
1997.
y Manual de exames – Laboratório Fleury – 1999 – 460-461
y Manual de exames – Laboratório H. Pardini – 2002 – 94
109
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
URÉIA ENZIMÁTICA
Método Enzimático Colorimétrico
1. INDICAÇÃO MÉDICA
A uréia é o metabólito quantitativamente mais importante do catabolismo das proteínas. Produzida no fígado, ela passa
para a circulação sangüínea, onde é degradada em nível intersticial e eliminada pelo suor, trato gastrintestinal e rim. É
livremente filtrada pelos glomérulos dependendo do estado de hidratação e 40% a 80% da uréia filtrada são passivamente
reabsorvidas nos túbulos proximais. Sua concentração varia em indivíduos sadios e é influenciada por diversos fatores
como: grau de hidratação, dieta protéica e função renal. É utilizada na avaliação do estado do funcionamento renal.
A uremia é observada na dieta rica em proteínas, insuficiência cardíaca congestiva, nefrite, insuficiência renal aguda e
carcinomas no trato urinário.
A diminuição da uréia está relacionada a insuficiência hepática grave, aumento da diurese e redução do catabolismo
protéico. A lesão renal provoca uma retenção de substâncias tóxicas como a uréia através de distúrbios da filtração,
reabsorção, secreção e excreção. Na lesão hepática, haverá uma diminuição da conversão de amônia em uréia, causando
uma hiperamoniemia.
Níveis aumentados
A - Pré-renal
Condições em que a circulação através dos rins é menos eficiente que o
normal
Desidratação (diarréia persistente)
Choque
Diminuição do volume sangüíneo (hemorragias digestivas)
Catabolismo protéico aumentado (febre, estresse, queimaduras etc.)
Insuficiência cardíaca
B - Renal
Diminuição da filtração glomerular como conseqüência de uma doença
renal aguda ou crônica
Nefropatias
Tratamento com glicocorticóides (efeito antianabólico)
C - Pós Renal
Resultado de uma obstrução do trato urinário. Obstrução do trato urinário
(cálculo, obstrução prostática etc.)
Níveis diminuídos
Caquexia, gravidez, doença celíaca, hemodiluição, na infância,
insuficiência hepática aguda e ingestão protéica diminuída.
3. PRINCÍPIO DO MÉTODO
A uréia é hidrolisada na presença da enzima urease e água, com produção de NH3 e CO2. A amônia formada reage com
salicilato e hipoclorito de sódio em meio alcalino, originando uma coloração verde (reação de Berthelot modificada). O
aumento da absorbância em 580 nm é proporcional a concentração de uréia na amostra.
4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
Preparo do paciente
O paciente deve estar em jejum de, pelo menos, 08 horas.
Amostras
Soro, plasma (heparina) e urina.
110
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
5. COMPONENTES DO KIT
Reagente A: Tampão fosfato pH 6,70 – 50 mmol/L, EDTA 2 mmol/L, Salicilato sódico 60 mmol/L, Nitroprussiato de sódio
3,2 mmol/L.
Reagente B: Hipoclorito de sódio 140 mmol/L e hidróxido de sódio 150 mmol/L.
Reagente C: Urease – 30.000 U/L.
Padrão: Solução de Uréia (valor da concentração do padrão vide etiqueta do frasco)
6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO
Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo.
Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.
8. CONTROLE DE QUALIDADE
Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.
Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.
9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES
111
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
y O reagente, uma vez usado, contém soro, plasma ou urina, eventualmente infectado, e deve ser tratado como material
potencialmente infeccioso. Descartar as sobras das reações de acordo com as Boas Práticas de Laboratório, em lugar
apropriado para material potencialmente infectante.
y O reagente e o padrão não contêm substâncias perigosas nas quantidades reportadas.
y O nível de água no banho-maria deve ser superior ao dos tubos de ensaio que contém as reações.
y Em caso de vazamento acidental, lavar o local com água corrente.
y Não é necessário nenhum tipo de proteção respiratória, mas recomenda-se o uso de óculos de segurança e de luvas
descartáveis durante o manuseio das substâncias.
y Em caso de contato com os olhos ou pele, lavar abundantemente com água corrente.
y Em caso de ingestão procurar atendimento médico.
y Fazer referência ao Manual ou POP de segurança.
y Não misturar ou trocar diferentes lotes de reativos.
y Não utilizar o reativo quando este mostrar-se turvo ou com sinais de contaminação.
y A água utilizada na limpeza do material deve ser recente e isenta de agentes contaminantes. A limpeza da vidraria
deve ser feita com detergente neutro. O enxágüe deve ser exaustivo, sendo o último, com água destilada ou
deionizada. Fazer referência ao manual ou POP de Controle de Qualidade de Água ou Água Reagente
y A limpeza e secagem adequadas do material são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção
de resultados corretos. Fazer referência ao Manual ou POP de limpeza e validação da qualidade da limpeza dos
materiais.
y Usar pipetas de vidro e ponteiras descartáveis separadas para cada amostra, controle (se utilizado) e reagente. Não
trocar as tampas dos frascos de reagentes. Isso evitará contaminação cruzada, o que poderia causar resultados
errôneos.
Preparação do reativo:
Reativo A de Trabalho: Misturar na proporção de 25,0 mL de Reativo A-1 + 1,0 mL de Reativo A-2
Estabilidade do Reativo A de Trabalho: 15 dias, se refrigerado.
Reativo B: pronto para uso.
Procedimento manual
1. Deixar ambientar os Reagentes durante alguns minutos à temperatura ambiente ou em um banho de água.
2. Pipetar em tubos de ensaio:
5. Agitar bem e incubar os tubos durante 10 minutos à temperatura ambiente (15-30º C) ou durante 5 minutos a 37º C.
6. Ler a absorbância (AP) do Padrão e (AA) da Amostra frente ao Branco a 580 nm.
A cor é estável por 30 minutos..
Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).
11. CÁLCULOS
Onde,
Aamostra = Absorbância da amostra
Apadrão = Absorbância do padrão
Com fator:
F = Valor do Padrão Uréia = Aamostra x F
Apadrão
112
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
Exemplo:
Aamostra = 0,109
Apadrão = 0,237
Valor padrão = 70mg/dL
F= 70 = 295,4
0,237
Valores de referência
- Soro e plasma: 15 – 45 mg/dL (2,49 – 7,49 mmol/L)
- Urina: 20 – 35 g / 24 horas
Estes valores são unicamente orientativos sendo recomendável que cada laboratório estabeleça seu próprio intervalo de
referência.
y Linearidade:
A reação é linear até 200 mg/dL.
Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos
valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.
y Interferências:
O ácido ascórbico, mesmo em concentrações elevadas (acima de 20 mg/dL), hemoglobina até 400 mg/dL, hiperlipemia e
bilirrubina até 20 mg/dL, não interferem nos resultados.
Não devem utilizar-se sais de amônia como anticoagulantes, já que interferem na reação.
113
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
URÉIA UV
Método Cinético Enzimático - UV
1. INDICAÇÃO MÉDICA
A uréia é o metabólito quantitativamente mais importante do catabolismo das proteínas. Produzida no fígado, ela passa
para a circulação sangüínea, onde é degradada em nível intersticial e eliminada pelo suor, trato gastrintestinal e rim. É
livremente filtrada pelos glomérulos dependendo do estado de hidratação e 40% a 80% da uréia filtrada são passivamente
reabsorvidas nos túbulos proximais. Sua concentração varia em indivíduos sadios e é influenciada por diversos fatores
como: grau de hidratação, dieta protéica e função renal. É utilizada na avaliação do estado do funcionamento renal.
A uremia é observada na dieta rica em proteínas, insuficiência cardíaca congestiva, nefrite, insuficiência renal aguda e
carcinomas no trato urinário.
A diminuição da uréia está relacionada a insuficiência hepática grave, aumento da diurese e redução do catabolismo
protéico. A lesão renal provoca a retenção de substâncias tóxicas como a uréia devido aos distúrbios da filtração,
reabsorção, secreção e excreção. Na lesão hepática, haverá uma diminuição da conversão de amônia em uréia, causando
uma hiperamoniemia.
Níveis aumentados
A - Pré-renal
Condições em que a circulação através dos rins é menos eficiente
que o normal
Desidratação (diarréia persistente)
Choque
Diminuição do volume sangüíneo (hemorragias digestivas)
Catabolismo protéico aumentado (febre, estresse, queimaduras etc.)
Insuficiência cardíaca
B - Renal
Diminuição da filtração glomerular como conseqüência de uma
doença renal aguda ou crônica
Nefropatias
Tratamento com glicocorticóides (efeito antianabólico)
C - Pós Renal
Resultado de uma obstrução do trato urinário (cálculo, obstrução
prostática etc.)
Níveis diminuídos
Caquexia, gravidez, doença celíaca, hemodiluição, na infância,
insuficiência hepática aguda e ingestão protéica diminuída.
3. PRINCÍPIO DO MÉTODO
A uréia da amostra é hidrolisada pela enzima urease com produção de gás carbônico e íons amônio. Estes são captados
por uma segunda enzima, a glutamato desidrogenase, a qual em presença de outros substratos como o NADH2 e α-
cetoglutarato, produz NAD e glutamato. A diminuição da concentração de NADH2 no meio pode ser medida
espectrofotometricamente em 340 nm, sendo proporcional à concentração de uréia na amostra.
Urease
Uréia + H2O ---------------> 2 NH4+ + CO2
glutamato desidrogenase
NH4+ + NADH + H+ + 2-Oxoglutarato ------------------------>Glutamato + NAD+
4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
Preparo do paciente
O paciente deve estar em jejum de, pelo menos, 08 horas.
Amostras
Soro, plasma ou urina.
Urina de 24 horas: Centrifugar antes de processar. Diluir a amostra 1/50 com água destilada (0,1 mL de urina + 4,9 mL de
H2O destilada ou deionizada). Multiplicar o resultado obtido por 50.
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Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
5. COMPONENTES DO KIT
6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO
Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo.
Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.
8. CONTROLE DE QUALIDADE
Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.
Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.
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Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES
Preparação do reativo:
Reativo de Trabalho: Misturar na proporção de 50,0 mL de Reativo A + 0,5 mL de Reativo B + 0,5 mL de Reativo C.
Estabilidade do Reativo A de Trabalho: 15 dias, se refrigerado.
Descartar o reativo de trabalho se sua absorbância em 340 nm, medida frente a água, for inferior a 1,00.
Procedimento manual
Reagente de Trabalho: Misturar 4 (quatro) partes do Ragente A com 1 (uma) parte do Reagente B. Ex: Adicionar 4,0 mL
de Reagente A – Tampão a 1,0 mL de Reagente B – Enzimático.
O reagente de trabalho é estável por 4 semanas se mantido ao abrigo da luz, refrigerado de 2 a 8ºC e fora de refrigeração
somente o tempo necessário para as dosagens.
• Desprezar o Reagente de Trabalho se sua absorbância em 340 nm, medida frente a água, for inferior a 0,900.
B) Procedimento
Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).
11. CÁLCULOS
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Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica
Exemplo:
A1- amostra = 0,023 F= 70 = 70 = 752,7
A2- amostra = 0,054 (0,145 – 0,052) 0,093
A1-padrão = 0,052 Uréia (mg/dL) = (0,054-0,023) x 752,7
A2- padrão = 0,145 Uréia (mg/dL) = 23,34 mg/dL
Valor do padrão = 70 mg/dL
Valores de referência
y Soro e plasma: 15-45 mg/dL
y Urina: 20-35 g/24 horas
Estes valores são unicamente a título orientativo; é recomendável que cada laboratório estabeleça seu próprio intervalo de
normalidade.
y Linearidade:
A reação é linear entre 6 e 250 mg/dL. Para valores acima de 250 mg/dL, diluir a amostra com água destilada. Multiplicar o
resultado obtido pelo fator de diluição.
Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos
valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.
y Interferências:
Não devem ser utilizados sais de amônia como anticoagulantes, pois os mesmos interferem na reação.
Ácido Ascórbico e Hemoglobina: Ácido Ascórbico apenas em concentrações elevadas (acima de 20 mg/dL) e
hemoglobina (acima de 200 mg/dL) induzem a resultados falsamente elevados.
Bilirrubina: A bilirrubina até 15 mg/dL não interfere.
Falsos Valores elevados: Hidroclorotiazida, ácido Etacrínico, furosemida, tianterene, bacitracina, cefalosporida,
gentamicina, kanamicina, cloranfenicol, meticilina, mitramicina, neomicina, vancomicina, metildopa, guanetimidina, morfina,
lítio, salicilato, propanolol, sulfonamidas.
Falsos Valores Diminuídos: fenotiazinas, timol.
Sensibilidade: 6 mg/dL
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