Inovasi pemrograman ulang sel somatik untuk diinduksi sel induk pluripoten memberikan pendekatan baru mungkin untuk

mengobati -thalassemia dan penyakit genetik lainnya seperti anemia sel sabit. Induced pluripotent batang (iPS) sel dapat dibuat dari sel somatik pasien 'dan mutasi pada gen -globin dikoreksi oleh gen penargetan, dan sel-sel dibedakan menjadi sel hematopoietik harus dikembalikan kepada pasien. Dalam studi ini, kita memprogram fibroblas kulit seorang pasien dengan talasemia homozigot 0 ke iPS sel, dan menunjukkan bahwa sel iPS dapat dibedakan menjadi sel-sel hematopoietik yang sintesis hemoglobin. Prenatal diagnosis dan aborsi selektif sudah efektif dalam mengurangi jumlah kelahiran -thalassemia di beberapa negara yang telah memberlakukan carrier skrining dan konseling genetik. Untuk memanfaatkan sel-sel dari cairan ketuban atau Chorionic villus sampling yang digunakan untuk diagnosis pralahir, kami juga menunjukkan bahwa sel-sel ini dapat memprogram ke iPS sel. Hal ini meningkatkan kemungkinan memberikan opsi baru berikut diagnosis pralahir janin dipengaruhi oleh penyakit parah. Saat ini, orang tua akan memilih untuk mengakhiri kehamilan atau melanjutkan dan mengurus anak yang sakit setelah lahir. Sel-sel untuk diagnosis pralahir dapat dikonversi menjadi iPS sel untuk pengobatan pada periode perinatal. Pengobatan awal memiliki keuntungan dari sel-sel yang membutuhkan jauh lebih sedikit dibandingkan pengobatan dewasa, dan juga dapat mencegah kerusakan organ dalam penyakit-penyakit di mana kerusakan dapat dimulai di dalam rahim atau pada usia dini. * Amniosentesis * Villus sampling chorionic * Diferensiasi hematopoietik * Hemoglobin Worldwide, Thalassemia merupakan salah satu penyakit genetik yang paling umum. Ini mempengaruhi orang-orang yang berasal dari daerah Mediterania melalui Timur Tengah ke anak benua India dan Asia Tenggara (1). Para sindrom talasemia secara luas diklasifikasikan menjadi 2 kelompok: -talasemia, di mana sintesis rantai globin -rusak, dan -thalassemia, yang dihasilkan dari sintesis -globin rusak. talasemia ini paling sering disebabkan oleh delesi gen yang mempengaruhi satu atau kedua lokus globin -diduplikasi. Bentuk parah -thalassemia, umum di Asia Tenggara, disebabkan oleh penghapusan gen -globin digandakan, dan mayoritas homozigot janin mati di trimester ketiga kehamilan atau kelahiran. Pada -thalassemia, cacat molekul umum adalah hasil dari mutasi titik atau penghapusan kecil yang mempengaruhi transkripsi, splicing, atau menerjemahkan mRNA. Bayi yang baru lahir dengan talasemia homozigot-sehat, tetapi sebagai hemoglobin akan beralih dari janin untuk hemoglobin dewasa setelah lahir, kurangnya hasil -globin pada anemia progresif. Meskipun tingkat anemia dapat bervariasi, tergantung pada derajat kekurangan -globin dan jumlah hemoglobin sintesis janin, banyak pasien dengan -thalassemia mengalami anemia berat dan memerlukan transfusi darah seumur hidup. Karena transfusi darah yang diberikan oleh kaya zat besi, pasien memerlukan terapi khelasi besi sepanjang hidup. Oleh karena itu, -Thalassemia menimbulkan risiko kesehatan yang parah dan beban ekonomi untuk keluarga beresiko. Obat untuk -thalassemia dapat dicapai dengan transplantasi sumsum tulang atau tali darah jika donor histocompatible tersedia (2, 3). Namun, karena keluarga pasien 'biasanya kecil, donor tidak umum

ditemukan. Selanjutnya, penyakit graft versus host variabel keparahan umumnya mengikuti. Pencegahan kelahiran baru dengan talasemia homozigot- telah dicapai dengan diagnosis pralahir. Di negara-negara seperti Italia, Yunani, dan Siprus, skrining pembawa, konseling genetik, diagnosis pralahir, dan aborsi selektif dari janin homozigot secara efektif menurunkan jumlah kelahiran dengan homozigottalasemia . Pendekatan eksperimental untuk pengobatan terapi gen -thalassemia dan anemia sel sabit. Menggunakan vektor lentiviral mengekspresikan gen -globin untuk transduce sel hematopoietik ex vivo, beberapa kelompok peneliti telah berhasil merawat mouse model -thalassemia atau anemia sel sabit (4-6). Sebuah percobaan manusia dikatakan melanjutkan di Eropa (7). The (8-10) reprogramming sel somatik ke dalam sel-sel induk induced pluripoten (iPS) membuka pendekatan baru mengobati -thalassemia. sel iPS telah dibuat dari berbagai jaringan, termasuk fibroblas kulit, hepatosit, perut, testis, dan sel-sel saraf (11-14). Selain itu, sel iPS juga telah dibuat dari sel somatik pasien dengan sejumlah penyakit termasuk kekurangan deaminase adenosin, penyakit Gaucher, dystrophies otot, penyakit Parkinson, penyakit Huntington, diabetes mellitus tipe 1, amyotrophic lateral sclerosis, dan Down dan Lesch -Nyhan sindrom (15-17). Sel-sel ini iPS menyediakan sarana belajar patofisiologi serta pendekatan untuk pengujian agen terapi untuk penyakit. Sebagai Thalassemia adalah penyakit genetik yang sangat umum, kita meneliti pemrograman ulang sel somatik dari pasien dengan -thalassemia ke iPS sel. -thalassemia, seperti anemia sel sabit, tampaknya menjadi calon yang baik untuk terapi sel iPS. Mutasi gen -globin dari kebanyakan pasien diketahui, dan pada anemia sel sabit, mereka dapat diperbaiki dengan teknik penargetan gen (18, 19), dan sel-sel iPS dibedakan menjadi sel-sel hematopoietik yang, pada gilirannya, dapat kembali ke pasien untuk pengobatan. Memang, anemia sel sabit disembuhkan dengan cara ini dalam model tikus (20). Kesempatan lain untuk terapi sel iPS terletak pada periode perinatal. Ketika diagnosis pralahir penyakit genetik yang terkait dengan penyakit parah dibuat, orang tua memilih untuk mengakhiri kehamilan atau untuk melanjutkan dan merawat anak dengan penyakit seumur hidup. Dalam kebanyakan kasus, orang tua akan memilih pengakhiran. Sel-sel dari cairan ketuban (AF) atau sampel chorionic villus (CVS) yang digunakan untuk diagnosis pada akhirnya dibuang. Jika sel-sel ini dapat diprogram ke dalam sel iPS, mereka dapat digunakan untuk pengobatan awal janin terkena selama periode perinatal. Dalam studi ini, kita diselidiki (i) generasi iPS sel dari fibroblas kulit dari pasien dengan talasemia homozigot- dan (ii) metode membedakan sel iPS menjadi sel-sel hematopoietik yang mensintesis hemoglobin. Selain itu, kami juga mempelajari kelayakan pemrograman ulang AF dan sel CVS menjadi sel-sel iPS yang dapat digunakan untuk pengobatan awal talasemia, anemia sel sabit, dan penyakit genetik lainnya. RESULT Pemrograman Ulang -Thalasemia fibroblast.

Kultur fibroblas dari biopsi kulit berasal dari pasien dengan 0-talasemia yang homozigot untuk bp 41/42 kodon 4-(CTTT) penghapusan. mutasi ini menyebabkan frameshift dan tidak ada rantai globin dibuat. Sel dari CVS dan amniocentesis diperoleh anonim dari laboratorium klinis di University of California San Francisco. Dua jenis infeksi diciptakan dalam generasi iPS sel dari fibroblast kulit dengan vektor retroviral. Dalam satu, fibroblast kulit terinfeksi dengan vektor retroviral yang berisi gen faktor 4 transkripsi (Oct4, Sox2, Klf4, dan cMyc), dan yang lainnya dengan 3 gen menghilangkan cMyc. Dengan penambahan asam valproik dalam medium kultur, sekitar 450 dan 50 koloni padat mirip dengan koloni sel ES manusia mulai bermunculan pada 2 sampai 3 minggu (21) setelah infeksi 1 105 sel dengan 4 dan 3 gen faktor, masingmasing . Empat puluh dari 4-koloni faktor diinduksi (4sy series) dan 30 dari 3-koloni faktor diinduksi (3sy seri) yang dipanen pada 30 sampai 35 hari setelah infeksi. Tiga puluh lima dari 4 koloni faktor yang terinfeksi dan 28 dari 3 koloni faktor yang terinfeksi bisa diperluas dan menunjukkan morfologi yang sama seperti batang embrionik manusia (ES) sel. Mereka menyatakan spidol pluripotency, seperti Nanog, SSEA3, SSEA4, Tra-1-60, dan Tra-1-81, serta fosfatase alkali, mirip dengan sel-sel ES manusia (Gbr. 1). Analisis Western blot koloni ini menunjukkan tingkat yang sama Nanog ekspresi dibandingkan dengan sel-sel ES manusia (data tidak ditampilkan). Sel-sel ini dapat dipertahankan dalam keadaan dibeda-bedakan pada pelat Matrigel-dilapisi dalam medium ES fibroblas embrio tikus-AC sel manusia. Beberapa koloni telah dibudidayakan selama lebih dari 4 sampai 7 bulan di laboratorium kami. Gambar. 1. koloni sel iPS memprogram dengan 3 faktor (3sy) atau 4 faktor (4sy) dari fibroblast kulit pasien dengan talasemia homozigot- ( -thal) dibandingkan dengan koloni hESC (HES). Mereka patri untuk fosfatase alkali (AP, Inset) dan spidol sel ES Nanog, SSEA3, SSEA4, Tra-1-60, dan Tra-1-81. Untuk mengkonfirmasi bahwa garis iPS dihasilkan sel berasal dari fibroblas kulit pasien talasemia teman, analisis sekuensing DNA genom dilakukan dalam 5 baris sel individu iPS. Homozigot kodon 41/42 4-bp (CTTT) delesi telah diverifikasi di semua 5, identik dengan urutan fibroblas kulit (Gbr. 2A). Kariotipe dari 5 baris iPS individu setelah 5 bagian normal, dan 1 dikultur selama 15 ayat-ayat tambahan juga ditemukan untuk mempertahankan kariotipe normal (Gambar 2B). Gambar. 2. Analisis Sequence (A) dan kariotipe (B) iPS sel memprogram dari fibroblas dari pasien dengan thalassemia. Untuk menguji pluripotency dari iPS sel yang dihasilkan in vivo, kita disuntikkan 106 iPS sel intramuskular ke kaki belakang mencit imunodefisiensi (NOD-SCID). Tujuh minggu setelah injeksi, pembentukan tumor diamati. Analisis histologi tumor mengungkapkan bahwa mereka mengandung jaringan perwakilan dari semua 3 lapisan kuman termasuk epitel pernapasan dan usus seperti ciliary (yaitu, endoderm), tulang dan otot (misalnya, mesoderm), dan saraf dan kelenjar sebasea (yaitu, ektoderm; Gb 3).. Gambar. 3. Photomicrographs H & E noda teratoma terbentuk pada tikus NOD-SCID setelah penyuntikan sel iPS dari

pasien dengan menunjukkan pasien -thalassemia (A) jaringan heterogen di bawah kekuasaan rendah (perbesaran 4), (B) epitel pernafasan, (C) tulang , dan (D) jaringan saraf (perbesaran 20). Kami menyelidiki kemampuan sel iPS untuk membedakan ke dalam sel hematopoietic. sel tunggal dibuat dari salah satu koloni iPS -thalassemia dengan Accutase enzim. Setelah pencucian, sel-sel resuspended dalam medium diferensiasi pertama, yang adalah medium basal, SFM ditambah dengan protein tulang manusia rekombinan morphogenetic 4, manusia VEGF (hVEGF), stem sel faktor manusia (hSCF), Flt3 manusia, IL3 manusia, manusia IGF-II, dan TPO (22). badan embryoid (EBS) yang dibuat oleh plating selsel di piring 96 V-bawah-baik dan disentrifugasi menurut metode Ng et al. (23, 24). Awalnya, kami mengoptimalkan pembentukan EB oleh plating 5.000, 10.000, dan 20.000 sel dalam sumur. EBS dibentuk dalam sumur, dimana jumlah sel lebih besar dari 10.000. Setelah inkubasi pada suhu 37 C dan CO2 5% selama 10 sampai 14 d, EBS kemudian tunggal ditempatkan di piring kultur jaringan gelatinized dan diijinkan untuk dibedakan lebih lanjut ke garis keturunan hematopoietic pada medium diferensiasi sekunder, yang MHL-dilengkapi dengan hVEGF, hSCF , Flt3 manusia, IL6 manusia dan eritropoietin manusia. Beberapa sel fibroblast-seperti tumbuh dan menyebar keluar dari kanan EBS pergi dan bulat beberapa, sel tidak patuh muncul di beberapa sumur setelah 4 sampai 5 inkubasi d dan "hemoglobinized" koloni yang nyata dengan inkubasi lebih lama. Setelah 2 minggu, sel-sel ini tidak patuh telah dihapus, berputar di atas slide, dan diwarnai dengan antibodi hemoglobin F. Sel-sel dari sumur yang mengandung koloni hemoglobinized menunjukkan positif pewarnaan dengan antibodi terhadap F hemoglobin (Gbr. 4).