Pendahuluan
Produk alat kesehatan Kontaminasi bakteri Bakteri gram negatif Kualitas produk farmasi dari aspek mikrobiologi
Pendahuluan
Produk farmasi parenteral
Produk-produk farmasi parenteral harus steril karena pemberian langsung ke sistem sirkulasi pembuluh darah. Salah satu tahap : Sterilisasi Produk parenteral terkadang terkontaminasi oleh ENDOTOKSIN
Struktur LPS
Contoh : LPS dari Salmonella terdiri dari bagian Lipid A yang hidrofob yang terikat pada suatu daerah inti yang mengandung molekul KDO (2-keto-3deoksioktonat)
LAL-test
The Limulus amebocyte lysate (LAL) test adalah uji in vitro untuk deteksi dan analisis kuantitatif endotoksin bakteri. Metode analisis LAL yang dilakukan mencakup teknik gel-clot dan turbidimetri kinetik dan kromogenik (kolorimetri)
Solum (1970, 1973) dan Young (1972), melakukan pemurnian dan karaterisasi protein yang dapat bergumpal dari reaksi LAL dan menunjukkan bahwa reaksi dengan endotoksin merupakan reaksi enzimatik.
LAL Chromogenic endotoxin assay utilizes a modified Limulus Amoebocyte Lysate and a synthetic color-producing substrate to detect endotoxin presence. This assay is quantitative and the color intensity developed upon addition of the sample to the LAL supplied with the kit is proportional to the amount of endotoxin present in the sample and can be calculated from a standard curve. The kinetic chromogenic quantitative assay for bacterial endotoxin can be performed at the low assay range (0-5 EU/ml) or the higher range (5-50 EU/ml)
Pemilihan metode tergantung pada penggunaan, volume uji, dan tipe produk
Selanjutnya enzim yang diaktivasi (enzim koagulase) menghidrolisis ikatan spesifik dalam suatu protein penggumpal (koagulogen) yang juga terdapat pada lisat amubosit Limulus menghasilkan koagulin. Sekali terhidrolisis, koagulin yang dihasilkan bergabung dengan sendirinya dan membentuk suatu gumpalan/bekuan seperti gel
FAKTOR C
FAKTOR C YG DIAKTIVASI
FAKTOR B
PROCLOTTING ENZYME
KOAGULOGEN
KOAGULIN (GEL)
Batas deteksi untuk beberapa produk diperoleh dari monografi USP atau EP. Kalau tidak dinyatakan dalam farmakope, batas endotoksin harus dihitung dari dosis maksimum manusia
Beberapa istilah lain untuk batas deteksi endotoksin EL: Endotoksin Limit MAEC (maximum allowable endotoxin concentration) ERL (endotoxin release limit) ELC (endotoxin limit concentration)
EL = K/M
K = konstanta = 5 EU atau IU per kg berat badan, M = dosis maksimum untuk manusia per kg per jam. Umumnya dinyatakan sbb : Batas endotoksin untuk berat badan rata2 70 kg = 350 EU per jam (5 EU kg-1)
Penentuan MVD dan MVC tergantung pada sensitivitas lisat yang digunakan (). Semakin sensitif lisat atau metoda, semakin tinggi MVD atau semakin rendah MVC
Perhitungan MVC
MVC = M K = sensitifitas dari lisat yaitu nilai terkecil dari standar untuk pengujian kuantitatif K= konstanta = 0,5 EU kg-1 M= dosis maksimum manusia
Perhitungan MVD
MVD = C x K xM C = konsentrasi obat K = konstanta = 0,5 EU kg-1 M= dosis maksimum manusia
Contoh
Potensi injeksi insulin 100 unit per ml, dosis maksimum 2 unit per kg dan sensitivitas lisat 0,125 unit/ml, maka MVD = 100x 5 = 1: 2000 0,125 x 2 Nilai MVD dapat diperoleh dari MVC MVD = potensi sediaan/MVC
Metode Gel-Clot
Pada metode ini, hasil akhir dapat dideteksi berupa spot pada slide, atau microplate Perlu pembanding, berupa Control Standard Endotoxin (CSE) Peralatan gelas yang digunakan harus di de-pirogenasi
Metode kromogenik
Metode kromogenik merupakan metode LAL test yang paling banyak digunakan saat ini karena lebih mudah dan murah Sesuai untuk jumlah produk yang diuji tidak banyak dan tidak sering (infrequent) Digunakan untuk uji sampel serum pada uji klinis
New Discoveries
Alternatif thp LAL saat ini telah berhasil diteliti di India dan China, yaitu pereaksiTAL, or Tachypleus amoebocyte lysate, fungsinya mirip dengan LAL, juga untuk deteksi gram-negative bacteria. Scientists di Singapore tengah meneliti cloning gene pendeteksi toxin dalam darah horseshoe crab. Jika gen tsb dapat di klon derivat LAL dapat dibuat tanpa harus menggunakan horseshoe crabs untuk ekstraksi darahnya.