Anda di halaman 1dari 6

METODE PEMISAHAN POLISAKARIDA Cara ekstraksi polisakarida secara umum Pemisahan polosakarida dari daun atau jaringan tumbuhan

lain memerlukan suatu ra ngkaian ekstraksi yang secara terpisah menghilangkan senyawa berbobot molekul re ndah dan polisakarida yang larut dalam air. Setelah ekstraksi berulang dengan pe larut air, sisa akan terdiri atas selulosa yang kira-kira murni. Berbagai langka h kerja yang paling umum dipakai untuk ekstraksi polisakarida ialah sebagai beri kut : kandungan berbobot molekul rendah dapat mudah dihilangkan dengan ekstraksi -habis menggunakan etanol mendidih. Bila jaringan kaya akan lipid (misalnya biji ), dapati dihilangkan dengan ekstraksi menggunakan aseton yang dilanjutkan denga n eter-benzena (1:1). Hal ini bertujuan untuk melarutkan lipid pada pelarut-pela rut nonpolar aseton, dan eter-benzena. Bila mengandung polisakarida netral yang larut dalam air dapat diekstraksi menggunakan larutan NaCl 1% atau air mendidih. Tujuan digunakannya NaCl 1% atau air mendidih yaitu untuk melarutkan polisakari da-polisakarida netral. Kemudian polisakarida tersebut diendapkan kembali dari l arutan dengan menuangkan ekstrak itu ke dalam beberapa volume alcohol. Untuk polisakarida pectin dapat diekstraksi dengan memakai ammonium oksalat -,5% . Hal ini bertujuan untuk menetralkan polisakarida pectin. Selanjutnya filtrat d iasamkan dengan penambahan alkohol. Selain bertujuan untuk pengasaman, alcohol j uga berfungsi untuk mengendapkan. Pada penambahan terus-menerus alcohol, hingga pada kejenuhan 80%. Pectin yang berupa senyawa asam pektat kemudian akan mengend ap. Hasil endapat kemudian dikumpulkan dengan melakukan penyaringan. Apabila dal am ekstrak mengandung lignin, maka lignin harus dihilangkan dari endapan . Ligni n dihilangkan dengan ekstraksi memakai natrium klorit 1% pada 70oC selama satu j am. Tujuan ditambahkannya natrium klorit 1% yaitu untuk melarutkan senyawa ligni n yang berada pada endapan. Dilakukan pada suhu 70oC untuk mempercepat pelarutan lignin. Bila jaringan kaya akan lignin, langkah kerja ekstraksi harus diulang b eberapa kali. Cara lainnya dapat dilakukan dengan ekstraksi memakai kloramin-T ( natrium-p-toluena-sulfonkloramida) dan etanolamina (Gailard, 1958). Filtrat ini dibuang dan sisa endapan dicuci, kemudian dikeringkan. Untuk ekstraksi hemiselulosa dapat dilakukan dengan menggunakan NaOH 7-12% dalam suasana gas Nitrogen pada suhu kamar selama 24 jam. Penambahan NaOH bertujuan u ntuk mendapatkan senyawa hemiselulosa dalam bentuk basanya. Untuk memisahkan hem iselulosa secara sempurna, langkah kerja ekstraksi hendaknya diulang juga sekura ng-kurangnya dua kali. Hemiselulosa kemudian didapatkan kembali dengan mengendap kan. Pengendapan dilakukan dengan mengasamkan ekstrak basa dengan asam asetat da n mengendapkannya dengan menggunakan etanol. Bahan yang tersisa kemudian dicuci betul-betul dan dikeringkan; ini merupakan fraksi selulosa murni. Berbagai fraksi polsakarida yang diperoleh itu kemudian difraksinasi lebih lanju t dan dimurnikan dengan berbagai langkah. Pemisahan polisakarida linier dan berc abang dalam sembarang fraksi seringkali diperlukan. Hal ini dapat dilaksanakan d engan mereaksikannya dengan iodium seperti ditunjukkan dibawah. Kromatografi per tukaran ion dan kromatografi sephadex dapat juga diterapkan pada fraksinasi poli sakarida. Adakalanya polisakarida tumbuhan berada secara alamiah dalam bentuk nisbi murni. Contohnya yaitu berbagai gom dan musilago (lendir) yang dikeluarkan dari kulit pohon dan juga dari biji dan buah. Seringkali gom demikian dengan mudah dapat di murnikan dengan melarutkannya dalam air, didialisis untuk menghilangkan komponen berbobot molekul rendah, diendapkan dengan menuangkannya kedalam etanol, dikump ulkan dan dikeringkan. Empat contoh cara untuk membuat polisakarida tumbuhan akan diuraikan sekarang. P aragraf selanjutkan akan mengemukakan cara lain yang umum digunakan untuk pemur nian akhir sebelum pencirian. Pati dari kentang Kentang yang telah dikupas (1 kg) digiling dengan 750 ml NaCl 1%, kemudian disar ing melalui kain kasa halus. Fungsi penggilingan yaitu untuk mengecilkan ukuran kentang sehingga diperoleh luas permukaan yang besar. Luas permukaan besar ini d apat meningkatkan optimasi proses ekstraksi pati dari kentang. Sisa diekstraksi

kembali dengan 150 ml NaCl 1%, disaring dan dicampur dengan filtrate pertama. Se waktu didiamkan, butir pati yang lewat melalui kain kasa mengendap dan beningann ya dapat dituangkan dan dibuang. Pati basah dicuci tiga kali dengan NaCl 1%, sek ali dengan NaOH 0,01M dan sekali lagi dengan air. Dimana fungsi NaOH adalah untu k menetra Selanjutnya ditiriskan, dikeringkan, dan ditimbang (hasil kira-kira 20 g). Cara ekstraksi pectin 1. Pada buah apel Ekstraksi 300 gr sayatan tipis apel dengan etanol mendidih selama 5 menit berfun gsi untuk menghidrolisis protopektin menjadi pectin, lalu dibuang alkoholnya. Ja ringan yang tersisa dicincang dan ekstraksi dengan 200 ml air mendidih. Filtrate kemudian dinetralkan dengan NH4OH 1M sampai pH 6,5 dan diuapkan dalam hampa uda ra sampai 150 ml. Pada penambahan alkohol sampai kejenuhan 80%, menghasilkan pec tin yang kurang murni karena alcohol tidak hanya mengendapkan pectin, tetapi jug a senyawa lain seperti dekstrin dan hemiselulosa. Kemudian asam pektat yang tela h mengendap dikumpulkan, lalu dikeringkan. Pemurnian dilakukan dengan melarutkan nya kembali dalam air mendidih (20 ml), menyaring, mengendapkan dengan alkohol, mencuci, dan mengeringkannya. 2. Pada kulit buah kakao 1. Persiapan bahan Pada tahap persiapan bahan ini dilakukan perlakuan pendahuluan untuk menghilangk an kotoran, senyawa gula, dan bahan padat terlarut lainnya. Selain itu proses in i bertujuan untuk proses inaktivasi enzim pektin esterase yang dapat menghidroli sis pektin menjadi pekat. Pada tahap ini dicuci dengan dengan air dingin dan air dingin ini harus selalu diganti agar pencucian dapat berhasil baik. Bila bahan tidak dicuci, senyawa gula yang tertinggal akan menyebabkan terbentuknya jelly a tau pektin kering yang diperoleh memiliki sifat higroskopis. Selain itu tahap in i juga dapat dijalankan denan pemanasan, dan pengupasan. Proses ini juga dimaksu dkan untuk menghilangkan pigmen, senyawa gula, dan kotoran kotoran. 2. Ekstraksi pektin Merupakan proses pengeluaran pectin dari sel pada jaringan tanaman. Ekstraksi pe ctin dengan larutan asam dilakukan dengan cara memanaskan bahan dalam larutan as am encer yang berfungsi untuk menghidrolisis protopektin menjadi pectin. Ekstrak si ini dapat dilakukan dengan asam mineral seperti asam klorida atau asam sulfat . Makin tinggi suhu ekstraksi, makin singkat waktu yan dibutuhkan untuk mendapat kan hasil yang maksimum. Tapi dalam hal ini factor keasaman yang digunakan tidak bisa diabaikan. Kisaran pH yang dirokemendasikan 1,5 3,0 tetapi pH kisaran pada pH 2,6 2,8 lebih sering dipakai. 3. Pengendapan Pengendapan merupakan proses pemisahan pectin dari larutan dengan cara pengendap an senyawa pektinnya. Biasanya dilakukan dengan spray drying, salting out dan de ngan penambahan bahan pelarut organic seperti alcohol dan aseton. Spray drying j arang dilakukan karena mahal. Pengendapan dengan salting out juga tidak banyak d ilakukan karena kesulitan untuk memisahkan pectin yang dihasilkan dan garam yang digunakan. Pengendapan dengan alcohol merupakan cara yang pertama kali digunaka n, menghasilkan pectin yang kurang murni karena alcohol tidak hanya mengendapkan pectin, tetapi juga senyawa lain seperti dekstrin dan hemiselulosa. Pengendapan dengan aseton lebih disukai karena dapat membentuk endapan yang tegar sehingga mudah dipisahkan dari asetonnya. 4. Pemurnian dan pengeringan Proses ini dimaksudkan agar pectin yang dapat bebas dari senyawa senyawa lain. P encucian ini dengan aseton, kemudian dihaluskan dan diayak untuk mendapat serbuk pectin. Prosedur percobaan : 1. Persiapan Bahan

a) Kulit buah cokelat dibersihkan dari kotoran kotoran b) Kulit cokelat yang telah dibersihkan digiling dengan blender dengan mena mbahkan larutan alcohol 96% dengan perbandingan 1 : 2 atau tanpa alcohol sesuai dengan variable yang telah ditentukan dan juga ditambah air dengan perbandingan 4 : 1 c) Hasil yang diperoleh disebut dengan bubur kulit cokelat d) Sebelum diolah lebih lanjut, bubur ini didiamkan selama 30 menit 2. Ekstraksi Pektin a) Bubur cokelat ini ditambah dengan larutan HCL 5% dengan pH sesuai dengan variable. b) Hasil yang diperoleh disebut dengan bubur asam c) Bubur asam dipanaskan sampai suhu sesuai dengan variable sambil diaduk s elama waktu sesuai dengan variable d) Bubur asam yang telah dipanaskan, disaring dengan saringan penghisap unt uk memisahkan filtratnya. e) Filtrat ini disebut filtrate pectin. 3. Pengentalan a) Filtrat pectin dipanaskan pada suhu 95 970C sambil diaduk sampai volumen ya menjadi setengah volume semula. b) Hasil yang diperoleh disebut dengan filtrat pekat. c) Filtrat pekat ini didinginkan. 4. Pengendapan pektin a) Penyiapan larutan pengendap. b) Larutan alkohol 96% diasamkan dengan menambahkan 2 ml HCL pekat. Larutan ini disebut dengan alcohol asam. c) Filtrat pekat ditambah dengan alcohol asam dan diaduk sampai rata. Setia p 1 liter filtrate pekat ditambah dengan 1,5 liter alcohol asam. d) Filtrat didiamkan selama 10 14 jam (semalam) e) Endapan pectin dipisahkan dari filtratnya dengan saringan penghisap f) Hasil yang diperoleh disebut dengan pektin masam 5. Pencucian Pektin Masam a) Pektin masam ditambah dengan alcohol 96% kemudian diaduk b) Kemudian dilakukan penyaringan dengan saringan penghisap c) Hal ini dilakukan beberapa kali sampai pektin tidak bereaksi dengan asam lagi d) Pektin yang tidak beraksi asam ialah pectin yang tidak berwarna merah bi la ditambah dengan inidikator phenol phtalein(indicator PP) 6. Pengeringan a) Pektin basa dikeringkan pada suhu 30-400C selama 6-10 jam b) Hasil yang diperoleh disebut dengan pectin kering Xilan dari jerami Serbuk jerami (30 g) diekstraksi-pendahuluan dengan natrium sulfit 3% (satu lite r). Adapun fungsi penambahan ini adalah untuk memisahkan serat dan melarutkan li gnin sebagian dan zat zat lain non selulosa yang ada dalam bahan, kemudian diawa ligninkan dengan ekstraksi berulang, pertama dengan natrium hipoklorit 5% pada s uhu kamar dan kemudian dengan natrium hipoklorit 5% yang mengandung H2SO4 1% (da lam lemari asam). Asam biasanya berfungsi sebagai katalisator dengan pengaktif a ir dengan kadar asam yang encer. Setelah dicuci dan dikeringkan, sisa diekstraks i dengan 400ml NaOH 6% selama 45 menit pada 1000C dan disaring.penambahaan ini b erfungsi sebagai penghasil alkali selulosa. Filtrat direaksikan dengan 200 ml la rutan Fehling dan kompleks xilan-tembaga yang mengendap dikumpulkan serta dicuci de ngan etanol 80%. Kompleks tersebut dihasilkan dari penambahan pereaksi Fehling. Kompleks tersebut kemudian dipecah dengan mensuspensikannya dalam etanol 96% dan melewatkan gas hydrogen klorida pada 00C. Sisa dikumpulkan dengan pemusingan, d icuci dengan etanol 80%, dan dikeringkan. Hemiselulosa linier dan bercabang Hemiselulosa linier dan bercabang dapat dipisahkan dengan menggunakan iodium (Ga

illard, 1965). Cara yang sama dapat juga digunakan untuk fraksinasi amilosa dan amilopektin dari pati. Hemiselulosa (1 g) dilarutkan dalam 100 mL CaCl2 (kerapatan larutan = 1,3) dan d ipusingkan untuk menjernihkan larutan. Penambahan CaCl2 bertujuan untuk membentu k kompleks Ca-hemiselulosa, sedangkan pemusingan dilakukan untuk meningkatkan en ergy kinetic rata-rata system sehingga menghasilkan endapat dan supernatant. Sup ernatan (beningan) kemudian ditambahkan 15 mL iodium (3%) dan kalium iodida (4%) . Struktur molekul pati berbentuk limier akan mengikat iodium membentuk kompleks berwarna biru. Penambahan KI untuk memperjelas warna biru yang terjadi dan untu k merenggangkan granula yang awalnya rapat. Pati akan merefleksikan warna biru b ila polimer glukosa lebih dari 20. Bila polimernya kurang dari 20 akan menghasil kan warna merah, sedangkan dekstrin dengan ukuran polimer 6-8 membentuk warna co klat. Oleh karena polimer glukosa lebih dari 20 maka terjadi endapan. Endapan po limer linier yang berwarna biru tua kemudian dikumpulkan. Sedangkan beningan ber warna coklat jernih, dinetralkan dengan natrium tiosulfat, dan larutan kemudian dituangkan ke dalam 5 volume etanol. Fungsi dari penambahan etanol yaitu agar te rjadi pengendapan. Polimer bercabang yang mengendap dilarutkan dalam 5 mL HCl 0, 1 M untuk menghilangkan ion kalsium, lalu diendapkan dengan 25 mL etanol dan dik umpulkan. Kompleks iodium dari polimer linier dicuci dengan larutan CaCl2 yang m engandung iodium dan kalium iodida. Selanjutnya kompleks dilarutkan dalam 100 mL air panas dan iodium dinetralkan dengan natrium tiosulfat. Polimer itu diendapk an setelah menuangkan larutan ke dalam 5 volume etanol. Akhirnya, ion kalsium di hilangkan dengan melarutkan endapan dalah KOH 1 M dalam suasana gas nitrogen. La rutan yang terjadi dinetralkan dengan HCl 1 M dalam suasana gas nitrogen. Laruta n yang terjadi dinetralkan dengan HCl 1 M dan diendapkan kembali dnegan etanol. Kemudian hasil dicuci dan dikeringkan. Cara lain Untuk elektroforesis polisakarida dapat digunakan film selulosa asetat dan dapar (NH4)2CO3 0,1 M pH 8,9 atau dapar asetat 0,1 M pH 4,7 pada arus 15 - 20 V/cm selama 2 - 4 jam. Polisakarida dideteksi dengan pereaksi periodat dan pewarnaan dengan rosanilina hidroklorida ( Conacher dan Rees, 1966 ). Polisakarida dapat dimurnikan pada kolom Sepharose-4B, dielusi dengan Na CL 1 M atau pada kolom DEAE-selulosa, dielusi secara landaian dengan larutan NaC l. Penerapan kromatografi pertukaran ion dan kromatografi Sephadex pada pemisaha n polisakarida daun gandum telah diuraikan oleh Reid dan Wilkie (1969). Untuk fraksinasi campuran polisakarida telah disebutkan juga pemakaian t embaga (seperti larutan Fehling) dan iodium. Barium hidroksida juga merupakan pe reaksi yang efektif. Untuk polisakarida asam (misalnya pektin), pereaksi yang be rguna ialah garam amonium kuartener, setilmetilamonium klorida. Garam polisakari da tidak larut dalam air dan kemudian dapat dipisahkan dengan mudah dari polisak arida netral yang tertinggal dalam larutan. Mencirikan polisakarida Analisis yang paling penting dan yang paling mudah dilaksanakan adalah h idrolisis dan deteksi gula yang dikandung. Hidrolisis dapat dilakukan dalam H2SO 4 1M selama empat jam pada 100oC dan larutan dinetralkan dengan Ba(OH)2 ,disari ng, dan filtrat dipekatkan. Hidrolisis bertujuan untuk menghidrolis polisakarida menjadi gula-gula sederhananya. Berbagai gula sederhananya diperiksa secara KKt atau KGC. Pada pencirian polisakarida yang lebih terinci biasanya dilakuka n metilasi sempurna. Hal ini dilaksanakan dengan menggunakan dimetilsulfat dalam basa, diikuti dengan metiliodida dan perakoksida. Metilasi berjalan lebih cepat bila dipakai pelarut seperti dimetilformamida atau dimetil sulfoksida. Karbohid rat termetilasi sempurna, lalu dihidrolisis seperti biasa dengan asam. Selanjutn ya, berbagai monosakarida-termetilasi-sebagian yang terjadi dipisahkan dan diana lisis secara KKt dan KGC. Cara lain yang digunakan untuk menentukan struktur mel iputi hidrolisis asam-sebagian (H2SO4 0,1M), selama tiga jam pada 100oC, hidroli sis enzim, dan oksidasi periodat. Analisa spektrum kurang bermanfaat meski pengu kuran IM dan RMI kadang-kadang dapat menunjukkan konfigurasi ikatan glikosidik.

Bobot molekul atau ukuran molekul polisakarida murni dapat ditentukan dengan fil trasi gel pada Sephadex G-100, dielusi dengan NH4HCO3 0,05M pH 8,0; untuk pemban ding digunakan dekstrin baku. Kemungkinan lain,dapat digunakan kromatografi perm easi gek kinerja tinggi,dengan kolom Toya Soda TSK Gel G3000SW,dielusi dengan Na Cl 0,9%. Menentukan gula dalam polisakarida Cara sederhana untuk memperoleh informasi tentang polisakarida t umbuhan adalah menentukan jumlah dan banyaknya monosakarida yang dihasilkan pada hidrolisis asam. Analisis demikian dapat dilakukan langsung terhadap ffraksi po lisakarida keseluruhan dari daun,diikuti dengan ekstraksi habis bahan berbobot m olekul rendah dengan etanol panas (Andrews dkk, 1960). Pada dasarnya, analisis i ni nisbi kasar dan lebih baik dilaksanakan terhadap fraksi polisakarida setelah difraksinasi berdasarkan kelarutan (Bailey dkk, 1967). Dari segi perbandingan lebih bermanfaat bila kita menentukan sus unan karbohidrat fraksi dinding sel itu (selulosa dengan hemiselulosa) setelah m enghilangkan polimer larut air. Terdapat perbedaan sangat besar dalam susunan gu la dari fraksi ini, baik dalam angiospermae (Gaillard, 1965) maupun dalam paku-p akuan (Bailey dan ain, 1971). Telaah mengenai gula pada dinding sel juga merupak an cara penting pada jamur dan bakteri (Bartnicki-Garcia, 1966 ; 1971) dan bahka n dapat digunakan untuk membedakan berbagai jenis pada famili yang sama (Wilkins on dan Carby, 1971). Siegel (1962) telah menulis uraian umum mengenai dinding se l tumbuhan. (b) Langkah Kerja 1. Pada isolasi fraksi polisakarida total, jaringan daun dipotong-potong de ngan tujuan untuk mengecilkan ukuran dari daun sehingga senyawa-senyawa yang ter kandung didalam daun lebih mudah untuk keluar saat diekstraksi. Selanjutnya poto ngan daun yang telah kecil ini direndam ke dalam alcohol mendidih agar terpisah antara fraksi polar dan nonpolar serta untuk menghilangkan senyawa klorofil yang terkandung didalam daun. Daun lalu dimaserasi dalam pelumat Waring selama lima menit. Maserasi dengan pelumat Waring untuk menarik keluar senyawa-senyawa didal am sel daun sampai terjadi kesetimbangan konsentrasi antara diluar dan didalam s el. Jika maserasi masih terdapat klorofil didalam hasil maserasi, larutan perlu diekstraksi lagi dengan alcohol panas. Sisa larutan kemudian disentrifuse dan di saring filtratnya,. Filtrate yang tersaringkan dikeringkan dalam oven hingga did apatkan serbuk putih yang rapuh. Bila yang diekstraksi merupakan fraksi dinding sel, dilakukan ekstraksi seperti diatas. Selanjutnya, serbuk diekstraksi berturu t-turut dengan air panas, NaCl 1% panas,dan amonium oksalat panas untuk menghila ngkan semua polisakarida yang larut. Sisa yang tak larut dicuci dan dikeringkan. 2. Serbuk dipanaskan dalam H2SO4 1M pada suhu 100C selama 8-16 jam bertujuan untuk menghidrolisis gula yang terkandung di dalam serbuk. Digunakan suhu 100C s ebagai katalis untuk mempercepat reaksi penghidrolisan dengan asam tersebut. Set elah di saring dan didinginkan, filtrat ditambahkan dengan Ba(OH)2 atau BaCO3 un tuk menetralkan asam yang tadi ditambahkan. Setelah itu, endapan BaSO4 yang terb entuk dipisahkan dari larutan dengan cara mensentrifuse larutan. Supernatan yang ada (bagian beningan) ditambahkan sedikit damar penukar asam dan basa untuk men ghilangkan sesepora terakhir ion anorganik. Larutan jernih yang didapat lalu dip ekatkan dalam hampa udara hingga volumenya tinggal sedikit. 3. Kromatografi sebagian cuplikan pekat pada kertas dalam dua pengembang gu la yang baku untuk mendeteksi ada tidaknya senyawa gula yang terkandung dalam sa mpel. Kromatografi dilakukan pada waktu yang bersamaan dengan sejumlah larutan p embanding baku yang konsentrasi gula umumnya diketahui. Kertas dikeringkan lalu dideteksi dengan anilina hidrogen ftalat,dan perkirakan konsentrasi berbagai mon osakarida yang dihasilkan pada skala satu sampai lima. Bila dibutuhkan ketepatan lebih lanjut,bercak gula dapat dielusi dan konsentrasi ditentukan dengan spektr ofotometri. Beberapa petunjuk mengenai jenis hasil analisis yang dapat diperoleh den gan fraksi polisakarida total dari daun tumbuhan,diberikan pada pada tabel 7.4 (

data dari Andrews dkk,1960). Terlihat bahwa gula yang selalu ada ialah galaktosa ,glukosa,arabinosa,xilosa,dan asam uronat (terutama galakturonat). Manosa dan ra mnosa sering terdapat dalam jumlah sesepora. Komponen yang sekali-sekali terdapa t dalam jumlah sesepora ialah apiosa, fukosa, dan turunan monometil tertentu dar i gula-umum. Gula amino (misalnya glukosamina ) ditemukan dalam dinding sel jamu r dan bakteri. Tabel monosakarida yang terdapat dalam Jenis Tumbuhan Jumlah Gula Gal Glc Man Ara Taxus baccata 2 2 Sp Pinus sylvestris 3 4 Cedrus atlantica Sp 5 Fagus sylvatica 2 2 Sp Quercus penduculata 2 2 Pyrus malus 2 4 Sp Ilex aquifolium 4 2 Aesculus hippocastanum 2 5 Hedera helix 2 4 sp polisakarida daun tumbuhan Xyl 4 4 Sp 2 4 5 2 Rha Sp 4 2 5 4 3 5 2 2 Uronat 2 Sp 4 Sp Sp 2 Sp 2 Sp 1 2 4 Sp 2

1 2 2 2

Perbedaan konsentrasi antara berbagai gula sangat menarik dan perlu dica tat meski hal ini sampai batas tertentu bergantung pada faktor lingkungan. Perba ndingan antara heksosa (glukosa dengan galaktosa) dan pentosa (arabinosa dengan xilosa) dapat sangat beragam ; misalnya,pada Quercus penduculata perbandingan in i 1 : 2, pada pinus 1 : 1, dan pada Aesculus hippocastanum hampir 2 : 1.