Oleh: Purwadi, M.

Si

Disampaikan pada kuliah Kromatografi, UTB 2009

Elusi

Kromatografi Cair (KC)

Merupakan sistem kromatografi dengan fase gerak cairan Bagaimana fase diamnya? Jawab Bisa padat bisa juga cair

Fakta: Kromatografi Cair digunakan 90%, Kromatografi Gas hanya 10%, mengapa ?

Karena Kromatografi Cair 1. 2. Mempunyai banyak mekanisme pemisahan Tidak ada persyaratan analit harus menguap, sedangkan sebagian besar senyawa mempunyai titik didih relatif tinggi Jenis alat kromatografinya banyak (lihat Bagan) Teknologi tidak harus tinggi: misal KLT, KKt Tidak harus mahal: KLT, KKt

3. 4. 5.

Pembagian Kromatografi Berdasarkan fase gerak Kromatografi Fase gerak gas Kromatografi Gas Krom. Kolom
KK. Terbuka

Fase gerak cair KLT Krom. KCKT Kertas Kromatotron

KK. Vakum

Mekanisme kromatografi cair apakah dipengaruhi jenis peralatan ? Apakah mekanisme pemisahan dalam KLT pasti berbeda dengan KCKT? Jawab Jenis peralatan tidak mempengaruhi mekanisme pemisahan secara kromatografi Cair Terkadang mekanisme pemisahan dalam KLT sama dengan KCKT

ADSORBSI KCKT KLT Krom. Kertas Krom Kolom SIZE EXCLUSION Kolom FILTRASI GEL PERMEASI GEL Mekanisme PARTISI PERTUKARAN ION KROM. ION PASANGAN ION

Mengapa begitu banyak mekanisme? Apakah dalam satu perangkat alat kromatografi mempunyai bermacam mekanisme?

Jawab Tidak, dalam satu kromatografi hanya terdapat satu mekanisme saja Misal 1. kita bisa memilih KLT dengan mekanisme Adsorbsi Misal 2. kita bisa memilih KLT dengan mekanisme partisi

Farktor apa yang mendasari kita memilih satu mekanisme pemisahan dalam kromatografi?

Jawab Yang mendasari kita memilih satu mekanisme pemisahan dalam kromatografi sifat dan jenis analit yang ingin dipisahkan

KROMATOGRAFI DENGAN MEKANISME ADSORBSI ATAU DIKENAL DENGAN KROMATOGRAFI ADSORBSI Untuk analit yang bagaimana? Jawab: untuk analit yang polar

Bagaimana prinsipnya: Adsorbsi dan desorbsi

Bagaimana maksudnya adsorbsi - desorbsi Jawab Anda ingat like disolve like, seperti itulah mekanismenya Perjanjian: dalam kromatografi adsorbsi: fase diam selalu polar (contoh Silika, Alumina, dll)

Berdasarkan perjanjian tersebut Jika fase diam Polar, kemudian Ada campuran analit, dengan sifat Polar dan lainnya non polar, maka yang bersifat polar akan disukai oleh fase diam (dengan kata lain teradsorbsi lebih kuat) dibanding analit lain yang kurang polar.
Analit Lebih polar

m = fase gerak s = fase diam (polar)

Cerita mekanisme adsorbsi Campuran analit pertama-tama dijerapkan pada fase diam, selanjutnya aliran fase gerak akan memaksa analit-analit tersebut untuk bermigrasi (terdesorbsi). Analit yang lebih polar akan lebih terikat kuat pada fase diam yang juga polar, akibatnya kecepatan migrasinya lambat, dibanding analit yang kurang polar. Sehingga => terjadi pemisahan

Jadi Kromatografi dengan mekanisme adsorbsi 1. Digunakan untuk pemisahan analit yang bersifat polar 2. Fase diam yang digunakan bersifat polar: misal Silika dan Alumina 3. Mekanismenya adsorbsi dan desorbsi 4. Jadi kalau kita menggunakan fase diam silika pada KLT atau pun KCKT dll maka mekanismenya adalah adsorbsi

Kolom HPLC fase normal

Silica

gel Cyano Amino Diol

Si Silica gel

: pemakaian umum : pemakaian umum : analisa gula : analisa protein

-Si-CH2CH2CH2CN -Si-CH2CH2CH2NH2 -Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH)

Si

Modifikasi Si

Kasus: Suatu Campuran berisi

Dilakukan KLT dengan fase diam silika (polar) dan fase gerak heksan. Mana yang akan mempunyai nilai Rf lebih tinggi??

Jawab

Ikatan hidrogen

Non-polar

Silica gel (polar)

Apa yang terjadi jika campuran analit tersebut dipisahkan dengan KCKT dengan kolom berisi silika?
kuat SiOH SiOH lemah OH HO

KROMATOGRAFI DENGAN MEKANISME PARTISI ATAU DIKENAL DENGAN KROMATOGRAFI PARTISI Untuk analit yang bagaimana? Jawab: untuk analit yang Non-polar

Bagaimana prinsipnya: partisi

Apa yang dimaksud dengan partisi? Jawab: Ingatkah anda apa yang akan terjadi jika analit dimasukkan dalam corong pisah yang berisi dua cairan yang tidak saling larut? Analit tersebut setelah terjadi kesetimbangan sebagian akan masuk ke cairan satu dan sebagian lagi akan masuk ke cairan dua.

Apakah bisa fase diam berupa cairan? Jawab: bisa

Apakah tidak terjadi abrasi jika terkena aliran fase gerak? Jawab: bisa. Bagaimana caranya biar tidak terkena abrasi? Jawab: cairan tersebut ditambatkan dalam padatan

Bagaimana jika kita menginginkan cairan C18H36 sebagai fase diam? Jawab. Cairan tersebut di reaksikan secara kimia dengan padatan silika.

-Si-C18 H35
Si

Perjanjian: Kromatografi partisi: menggunakan fase diam non polar, dan fase gerak polar

Sistem kromatografi dengan menggunakan fase diam non polar, dan fase gerak polar dikenal sebagai fase balik

Bagaimana mekanisme partisi dalam kromatografi menjelaskan pemisahan kedua analit beikut?

A Jawab:

Ingat perjanjian: fase diam adalah bersifat non polar. Fase diam adalah cairan. Jika campuran analit A dan B dimasukkan ke sistem maka keduanya akan terpartisi masing-masing ke dua cairan, yaitu fase diam dan fase gerak. Senyawa B akan terparisi lebih banyak dalam fase diam karena dia lebih non polar. Akibatnya B akan tertahan lebih lama pada fase diam

Bagaimana interaksi?
Interaksi hidrofobik

Solven polar

Non-polar

Hidrofobisitas

Jika sampel memiliki

CH3CH2CH2--- : rantai karbon : gugus aromatis

Hidrofobisitas Jadi lebih kuat.

Jika sampel memiliki

-COOH -NH2 -OH X : gugus karboksil : gugus amino : gugus hidroksil

Hidrofobisitas jadi lebih lemah.

Waktu retensi dan Hidrofobisitas

OH

C18 (ODS) kuat OH

lemah

Pengaruh fase diam

C8 C18 (ODS) kuat sampel lemah sampel Medium sampel C4

Mekanisme pemisahan untuk melekul ionik

Bagaimana pembagian mekanisme pemisahan untuk analit ion? Kromatografi pasangan ion Kromatografi penekanan ion Kromatografi pertukaran ion

Kromatografi Pasangan Ion

Apa dasar pasangan ion?

Dalam satu sistem kromatografi bisa saja terjadi beberapa mekanisme, jika hal tersebut terjadi maka dapat mengakibatkan pemisahan tidak baik, misalnya terjadi pengekoran dan atau puncak pecah.

Molekul ionik bisa dibuat non ionik dengan cara dipasangkan dengan ion lawannya, sehingga mempunyai satu mekanisme, misalnya partisi. Tidak partisi dengan sedikit adsorbsi

Kromatografi Fase Terbalik dengan pasangan ion

Ion-Pair Reagent

Untuk apa dipasangkan?

Jawab. Agar molekul analit netral sehingga bersifat non polar. Ingat: PARTISI: Pemisahan senyawa non polar dengan fase diam non polar (misal C-18)

Reagen Ion-Pair

Untuk Analit bersifat Anion, maka pasangannya:

Tetra-n-butylammonium hydroxide (TBA)

Untuk Analit bersifat Kation, maka pasangannya:

Butanesulfonic acid sodium salt Pentanesulfonic acid sodium salt Hexanesulfonic acid sodium salt Heptanesulfonic acid sodium salt Octanesulfonic acid sodium salt Decanesulfonic acid sodium salt (C4) (C5) (C6) (C7) (C8) (C10)

Ion Pairing Separation of Carboxylic Acids

Column: Bonded C18 Mobile Phase: H2O/MeOH 1:1 with TetrabutylAmmonium Hydroxide

Pasangan Ion Hal yang penting diperhatikan

Tipe

reagen Ion-Pair Konsentrasi reagen Ion-Pair pH solven

R-COOH R-NH2 + H+ RCOO- + H+ (pKa=4.5) R-NH3+ (pKa=6.0)

Tipe reagen ion-pair

Hexane Sulfonate Pentane Sulfonate

Mobile Phase: H 2O/MeOH 1:1,with 0.005M ion pairing reagent and 1% HOAc
1 Maleic Acid 2 Phenylephrine 3 Phenylpropanolamine 4 Naphazoline 5 Phenacetin 6 Pyrilamine

Mekanisme: Penukar ion

Jika analit anion maka fase diam kation, fase gerak anion

Kekuatan antar ion Sampel

N+ R R

Jika analit kation maka fase diam anion, fase gerak kation

SO3

+ + + + + + Sampel + + + + + + +

Penukar ion
Lingkungan biologi (protein, peptide, amino acid analysis) Kromatografi ion

Penukar kation
Strong Cation Exchange Week Cation Exchange (SCX) (R-SO3-) (WCX) (R-COO-)

Penukar anion
Strong Anion Exchange Week Anion Exchange (SAX) (R4N+) (WAX) (DEAE)

Hal yang perlu diperhatikan pada Kromatografi Penukar ion

pH larutan dapar Konsentrasi larutan dapar Metoda elusi

Elusi Isokratik Elusi gradien pH Elusi gradien peningkatan kekuatan ionik

Mekanisme pemisahan berdasarkan ukuran molekul

Apakah SEC ?
Size

Exclusion Chromatography (SEC)

GPC (Gel Permeation Chromatography) terutama untuk sampel polimer GFC (Gel Filtration Chromatography) terutama untuk sampel biologi

Prinsip SEC
Tidak

ada kekuatan interaksi Perbedaan waktu tempuh

SEC
Fase diam: partikel berpori Molekul ber BM besar Molekul relatif besar tidak dapat dijebak oleh fase diam, akibatnya waktu tambat singkat Molekul relatif kecil dapat dijebak oleh fase diam, akibatnya waktu tambat lama

Hubungan antara Bobot molekul & waktu tambat

Batas eksklusi Batas permeasi Kolom GPC
M o L l ukel o m are B g ( t

Waktu

Kromatografi Afinitas

Pustaka
SusanR.Mikkelsen and Eduardo Corton, 2004, BIOANALYTICAL CHEMISTRY, A JOHNWILEY&SONS, INC., PUBLICATION, New Jersey. PT. Ditek Jaya. Presentation for Shimadzu LC