SDS-PAGE

Origem: Wikipdia, a enciclopdia livre "PAGE" redireciona aqui. Para outros usos, veja pgina (desambiguao) .

Imagem de um SDS-PAGE. O marcador molecular na faixa da esquerda SDS-PAGE, de sdio dodecil sulfato de gel de poliacrilamida eletroforese , uma tcnica amplamente utilizada em bioqumica , cincia forense , gentica e biologia molecular para separar as protenas de acordo com sua mobilidade eletrofortica (uma funo do comprimento da cadeia polipeptdica ou peso molecular). SDS eletroforese em gel de amostras que tm a seu cargo idntico por unidade de massa devido ligao de resultados SDS no fracionamento por tamanho.

Contedo
[hide]
y

y y y y y y

Um Procedimento o 1,1 a preparao do tecido o 1,2 Preparar gel de acrilamida o 1,3 Eletroforese o 1,4 Colorao 2 ingredientes qumicos e seus papis o 2,1 gel de empilhamento o 2,2 ingredientes qumicos o 2,3 Qumicos para processamento e visualizao 3 Reduo SDS-PAGE 4 colorao prata 5 sistemas tampo 6 SDS eletroforese em gel de gradiente de protenas 7 Veja tambm 8 Referncias

9 Ligaes externas

[ editar ] Procedimento
[ editar ] preparao do tecido
Amostras podem ser colhidas a partir de tecido todo ou de cultura de clulas. Na maioria dos casos, os tecidos slidos so primeiro divididos mecanicamente usando um liquidificador (para maiores volumes de amostra), usando um homogeneizador (volumes menores), por sonicador ou usando ciclismo de alta presso. As clulas podem tambm ser arrombado por um dos mtodos acima mecnica. No entanto, deve notar -se que as bactrias, vrus ou amostras ambientais pode ser a fonte de protena e, assim, SDS-PAGE no se restringe a apenas estudos celulares. Uma combinao de tcnicas bioqumicas e mecnicas - incluindo vrios tipos de filtragem e centrifugao - pode ser usado para separar os compartimentos celulares diferentes e organelas . A soluo de protenas a ser analisado misturado com SDS , uma aninica detergente que desnatura secundrio e no-dissulfeto-linked estruturas tercirias, e aplica uma carga negativa para cada protena na proporo de sua massa Aquecimento das . amostras a pelo menos 60 graus C agita as molculas, ajudando SDS para ligar.[1] [2] [3]
[4]

Um corante de rastreamento pode ser adicionado soluo de protena (de um tamanho menor do que a protena) para permitir que o experimentador para acompanhar o progresso da soluo de protena atravs do gel durante a corrida eletrofortica.

[ editar ] Preparando gel de acrilamida

Os gis geralmente consistem de acrilamida , bisacrylamide , SDS , e um tampo TrisCl com pH ajustado. A soluo desgaseificado sob vcuo para evitar bolhas de ar durante a polimerizao. [5] persulfato de amnio e Temed so adicionados quando o gel est pronto para ser polimerizada. O gel de separao ou de resoluo normalmente

mais bsicos e tem um teor mais elevado do que o gel de poliacrilamida carregamento.
[6]

Gis so polimerizados em um rodzio gel. Primeiro, o gel de separao derramado e permitiu a polimerizar. Uma camada fina de prxima isopropanol adicionado, fazendo com que o topo do gel de separao para formar uma superfcie lisa. Emseguida, o gel de carregamento derramado e um pente colocado para criar os poos. Aps a carga de gel polimerizado o pente pode ser retirado eo gel est pronto para eletroforese.

[ editar ] Eletroforese
Primeiro, o anodo eo catodo buffers esto preparados. O buffer de anodo geralmente contm Tris-Cl, gua destilada deionizada e ajustado para um pH mais alto do que o buffer ctodo. O buffer de catodo contm SDS, Tris, tricine, e gua destilada deionizada. [7] [8]

O aparelho configurado eletroforese com tampo ctodocobrindo o gel na cmara de eletrodo negativo, e buffer anodo na cmara inferior do eletrodo positivo. Em seguida, as protenas desnaturadas amostra so adicionados uma poos final do gel com uma seringa ou pipeta. Finalmente, o aparelho ligado a uma fonte de energia sob condies apropriadas de execuo para separar as bandas de protenas.

Um campo eltrico aplicado em todo o gel, fazendo com que as protenas de carga negativa para migrar atravs do gel em direo ao eletrodo positivo (+) (anodo). Dependendo do seu tamanho, cada protena vai passar de forma diferente atravs da matriz de gel: protenas curta ser mais fcil passar pela poros no gel, enquanto as maiores tero mais dificuldade (que encontram mais resistncia). Aps um determinado perodo de tempo (geralmente algumas horas, embora isso depende da voltagem aplicada atravs do gel; voltagens mais altas correr mais rpido, mas tendem a produzir um pouco mais pobres resoluo), as protenas diferencialmente tero migrado com base em seu tamanho; protenas menores sero ter viajado mais para baixo do gel, enquanto as maiores tero permaneceu mais perto do ponto deorigem. Portanto, as protenas podem ser separados cerca de acordo com o tamanho (e, portanto, o peso molecular), certas glicoprotenas comportar anormalmente em gel de SDS.

[ editar ] Colorao

Dois SDS-PAGE em gel depois de uma corrida concluda Aps a eletroforese, o gel pode ser manchada (mais comumente comCoomassie Brilliant Blue R-250 ou mancha de prata ), permitindo a visualizao das protenas separadas, ou ulteriormente tratados (por exemplo, Western blot ). Aps a colorao, diferentes protenas aparecer como bandas distintas dentro do gel. comum para executar marcadores de peso molecular tamanho da conhecida peso molecular em uma faixa separada no gel, a fim de calibrar o gel e determinar o aproximada de massa molecular de protenas desconhecidas, comparando a distncia percorrida em r lao ao e marcador. O gel formado, na verdade, porque a soluo de acrilamida contm uma pequena quantidade, geralmente cerca de 1 parte em 35 de bisacrylamide, que podem formar ligaes cruzadas entre duas molculas de poliacrilamida. A proporo de acrilamida a bisacrylamide pode ser variado para fins especiais. A concentrao de acrilamida do gel tambm podem ser variadas, geralmente na faixa de 5% a 25%. Gis menor percentagem so melhores para a resoluo muito alta de protenas de peso molecular, enquanto percentuais bem mais elevados so necessrios para resolver protenas menores. Determinar quanto das vrias solues para misturar juntos para fazer gis de concentrao de acrilamida em particular pode ser feito on-line SDS-PAGE geralmente a primeira escolha como um ensaio de pureza da prot na, e devido sua confiabilidade e facilidade. A presena de SDS e da etapa de desnaturao de protenas faz com que sejam separados apenas com base no tamanho. Falsos negativos e positivos so possveis. Um contaminante comigrating pode aparecer como a mesma banda como a protena desejada. Este comigration tambm poderia causar uma protena para ser executado em uma posio diferente ou no ser capaz de penetrar o gel. por isso que importante para manchar o gel inteiro, incluindo a seo de empilhamento. Coomassie Brilliant Blue tambm se ligam com menos afinidade com glicoprotenas e protenas fibrosas, o que interfere com a quantificao.

[ editar ] ingredientes qumicos e seus papis

Gel de poliacrilamida (PAG) havia sido conhecido como um meio potencial para a incorporao de corte de tecidos, j em 1964. Dois grupos independentes, Davis e Raymond, PAG empregados em eletroforese em 1959. [9] [10] Ele possui vrias caractersticas desejveis eletroforeticamente que fazem dele um mdio verstil. PAGE separa as molculas de protena de acordo com o tamanho e carga. um gel sinttico, termo-estvel, transparente, forte, relativamente quimicamente inerte, pode ser preparada com uma ampla gama de tamanhos de poros mdio. [11] O tamanho dos poros

de um gel determinada por dois fatores, a quantidade total de acrilamida presente (% T) (T = concentrao de monmero de acrilamida bisacrylamide total) ea quantidade de cross-linker (% C) (C = concentrao de Agente de crosslinking). Tamanho dos poros diminui com o aumento da T%, com cross-linking, C 5% d o menor tamanho de poros. Qualquer aumento ou diminuio no C% aumenta o tamanho dos poros, como o tamanho dos poros em relao ao% C uma funo parablica com vrtice como C. 5% Esta parece ser por causa da agregao no homognea de fios no gel. Este material gel tambm pode suportar a alta tenso gradientes, vivel para a colorao de vrios e procedimentos de descolorao, e pode ser digerida para extrair fraes separadas ou secas para autoradiografia e gravao permanente. Eletroforese DISC utiliza gis de diferentes tamanhos de poros. [12] [13] O DISC nome era derivado do descontinuidades na matriz eletrofortica e coincidentemente da forma discide das zonas separadas de ons. H duas camadas de gel, ou seja, o empilhamento ou gel espaador, e resolver ou separar gel.

Eletrnica de transmisso de imagem microscpica de um gel de poliacrilamida. Um gel de poliacrilamida um labirinto de tneis, o tamanho dos poros determinada pela quantidade total de presentes monmero (% T) ea quantidade de cross -linker (C%).

[ editar ] gel de empilhamento

O gel de empilhamento um PAG poros grandes (4% T). Este gel preparado com Tris / HCl tampo pH 6,8 de cerca de 2 unidades de pH mais baixo do que o tampo de eletroforese ( Tris / glicina ). Estas condies proporcionam um ambiente para Kohlrausch reaes determinao de condutividade molar , como resultado, SDSrevestido protenas esto concentrados para vrias vezes e uma zona fina de partida da ordem de 19 mM alcanado em poucos minutos. Este gel lanada sobre o gel de resoluo. A altura da regio de gel de empilhamento sempre m antido mais que o dobro da altura e do volume da amostra a ser aplicada. Isto baseado em isotachophoresis .

[ edi
y

]i

edientes qu i s

Tris (tris (hidrxi metil ) aminometano) (C 4 H 11 NO 3; mW: 121,14). El t si usada como um amort cedor, pois uma subst cia i cua para a maioria das prote as. Seu pKa de 8,3 a 20 C, tornando-se um buffer muito satisfat ria na fai a de pH de cerca de 7-9. Gli ina (cido actico Amino) (C 2 H 5 NO 2; mW: 75,07). Gl cine tem sido utili ado como fonte de trailing ion ion ou lento porque o seu pKa 9,69 ea mobilidade dos glicinato so tais que a mobilidade efecti a pode ser definido em um valor inferior ao do mais lento protenas conhecidas da net carga negativa na fai a de pH. O pH mnimo deste intervalo de aproximadamente 8.0. Acrilamida (C 3 H NO 5; mW: 71,08). um p branco cristalino. Enquanto dissolver em gua, auto polimeri ao de acrilamida ocorre. um processo lento espont nea pela qual as molculas se juntam acrilamida por cabea em forma de cauda. Mas, em presena de radicais livres gerando sistema, acrilamida monmeros so ativadas em um estado livre-radical. Estes monmeros ativados polimeri a rapidamente e formam longas cadeias de polmeros . Este tipo de reao conhecida como vinil de polimeri ao de adio . Uma soluo destas cadeias de polmeros torna-se viscoso, mas no formam um gel, porque as cadeias simplesmente desli am uns sobre os outros. Formao de gel requer ligar vrias cadeias juntos. A acrilamida uma neurotoxina . tambm essencial para armazenar acrilamida em um lugar fresco e escuro e seco para reduzir autopol merisation e hidrlise . Bisacrylamide ( N, N'-Methylenebisacrylamide ) (C 7 H 10 N 2 O 2; mW: 154,17). Bisacrylamide o mais freqentemente usados agente reticulao para gis de acrilamida poly. Quimicamente o pensamento de ter duas molculas de acrilamida-cabea acoplada a cabea em suas extremidades no-reativo. Dodecilsul ato de sdio (SDS) (C 12 H 25 NaO 4 S; mW: 288,38). SDS o agente dissociar mais comum usado para desnaturar protenas nativas individuais polipeptdeos . Quando uma mistura de protenas aquecido a 100 C na presena de SDS, o detergente envolve a espinha dorsal polipeptdica. Liga-se a polipeptdeos em uma proporo de peso constante de 1,4 g / g de polipeptdeo. Neste processo, as acusaes de polipeptdeos intrnseca torna-se insignificante quando comparado com as cargas negativas contribuiu por SDS. Assim, aps o tratamento torna-se polipeptdeos uma vara como a estrutura que possui uma densidade de carga uniforme, que carga lquida negativa mesmo por unidade de comprimento. Mobilidades destas protenas ser uma funo linear dos logaritmos de seus pesos moleculares. Sem SDS, as protenas diferentes, com pesos moleculares semelhantes seria migrar de maneira diferente devido a diferenas na relao carga massa, j que cada protena tem um ponto isoeltrico e peso molecular particular, a sua estrutura primria . Isto conhecido como PAGE nativo . Adicionando SDS resolve este problema, uma vez que se liga e se desdobra a protena, dando uma carga negativa uniforme perto ao longo do comprimento do polipeptdeo.

y y

Persul ato de amnio (APS) (N 2 H 2 O 8 S 8; mW: 228,2). APS um iniciador para a formao de gel. Temed (N, N, N ', N'-tetrametiletilenodiamina) (C 6 H 16 N 2; mW: 116,21). Polimerizao qumica do gel de acrilamida utilizada para SDS-PAGE. Ele

pode ser iniciado por persulfato de amnio e amina quaternria , N, N, N ', N'tetrametiletilenodiamina (Temed). A taxa de polimerizao e as propriedades do gel resultante depende da concentrao de APS e Temed. Aumentar a quantidade de APS e os resultados Temed em uma diminuio da durao mdia cadeia polimrica, um aumento na turbidez gel e uma diminuio da elasticidade do gel. Diminuindo a quantidade de iniciadores mostra o efeito inverso. O menor cataltico concentraes que permitir polimerizao no perodo ideal de tempo deve ser usado. APS e Temed so utilizados, aproximadamente, em concentraes equimolares na faixa de 1 a 10 mM.

[ editar ] Produtos qumicos para o processamento e visualizao

Os seguintes produtos qumicos so usados para processamento do gel de protenas e as amostras visualizadas em que:
y

y y

Azul de bromofenol (BPB) (3 ', 3 ", 5', 5" tetrabromophenolsulfonphthalein) (C 19 H 10 O 5 Br 4 S; mW: 669,99). BPB o corante marcador universal. Protenas e cidos nuclicos so na sua maioria incolor. Quando so submetidos eletroforese, importante para parar o processo antes de executar fora do gel. BPB o corante mais comumente empregada de rastreamento, porque vivel em pH alcalino e neutro, uma molcula pequena, ionizvel e carregada negativamente acima de pH 4,6 e, portanto, se move em direo ao nodo . Sendo uma pequena molcula que se move frente da maioria das protenas e cidos nuclicos. Ao atingir o andica final da eletroforese meio de eletroforese est parado. Ele pode se ligar com as protenas fracamente e dar cor azul. Glicerol (C 3 H 8 O 3; mW: 92,09). um conservante e um agente de pesagem. Adio de glicerol (20-30 ou 50%) frequentemente recomendada para o armazenamento de enzimas. Glicerol mantm a soluo de protena a uma temperatura muito baixa, sem congelamento. Tambm ajuda a pesar a amostra nos poos sem ser distribudos durante o carregamento. Coomassie Brilliant Blue R-250 (CBB) (C 45 H 44 N 3 NaO 7 S 2; mW: 825,97). CBB a protena mais popular mancha. um corante aninico, que liga a protenas no-especificamente. A estrutura da CBB predominantemente no-polar. Ento, normalmente usado (0,025%) em soluo de metanol (40%) e cido actico (7%). Protenas no gel so fixos pelo cido actico e, simultaneamente, manchado. O excesso de corante incorporado no gel pode ser removido por descolorao com a mesma soluo, mas sem o corante. As protenas so detectados como faixas azuis sobre um fundo claro. Como SDS tambm est aninicos, pode interferir com o processo de colorao. Portanto, grande volume de soluo de colorao recomendada, aproximadamente dez vezes o volume do gel. n-butanol (C 4 H 10 O; mW: 74,12). butanol saturado de gua usada como uma soluo de sobreposio no gel de resoluo. Ditiotreitol (DTT; C 4 H 10 O 2 S 2; mW: 154,25). TDT um agente redutor usado para interromper pontes dissulfeto para garantir a protena totalmente desnaturado antes de carregar no gel, garantindo a protena funciona de maneira uniforme. Tradicionalmente, o txico e menos potente 2-mercaptoetanol foi usado.

[ editar ] Reduo da SDS-PAGE

Alm da adio de SDS, as protenas podem, opcionalmente, ser brevemente aquecida para perto de ebulio na presena de um agente redutor, como ditiotreitol (DTT) ou tradicionalmente 2-mercaptoetanol (beta-mercaptoethanol/BME) , o que mais desnatura as protenas, reduzindo dissulfeto ligaes, superando assim algumas formas de enovelamento de protenas superior, e quebrando a estrutura da protena quaternria (subunidades oligomrica). Isto conhecido como a reduo da SDS-PAGE, e mais comumente usado. No-reduo da SDS-PAGE (nenhum agente de ebulio e no a reduo) pode ser usado quando a estrutura nativa importante para anlise posterior (por exemplo, atividade enzimtica, mostrado pelo uso de zimogramas ). Por exemplo, q uantitative p reparadora n ative c p ontinuous oly um crylamide g el lectrophoresis e ( QPNC-PAGE ) um novo mtodo para a separao de nativos metaloprotenas em matrizes biolgicas complexas.

[ editar ] colorao prata

Gis de poliacrilamida prata manchada SDS No sculo 14 a colorao pela prata tcnica foi desenvolvida para colorir a superfcie do vidro. Tem sido amplamente utilizado para este fim desde o sculo 16. A cor produzida pela manchas de prata incio variou entre amarelo claro e um laranja -avermelhado. Camillo Golgi aperfeioou a colorao pela prata para o estudo do sistema nervoso . Golgi do mtodo manchas um nmero limitado de clulas ao acaso em sua totalidade. [14] A mecanismo qumico exato pelo qual isso acontece ainda largamente desconhecida. [15] colorao de prata foi introduzido por Kerenyi e Gallyas como um procedimento sensvel para detectar pequenas quantidades de protenas emgis . [16] A tcnica foi estendida para o estudo da diversidade biolgica outros macromolculas que foram separadas em uma variedade de suportes. [17] Classical Coomassie Brilliant Blue colorao geralmente pode detectar a 50 ng banda de protena, colorao de prata aumenta a sensibilidade tipicamente 50 vezes. Muitas variveis podem influenciar a cor e intensidade de cada protena tem suas caractersticas prprias colorao;. limpar vidros, reagentes e gua pura da mais alta pureza so os pontos chave para a colorao de sucesso [18]

[ editar ] Buffer sistemas

Migrao postulada de protenas em um sistema de gel Laemmli A: gel de empilhamento, B: Soluo de gel, o: aplicao de exemplo c: descontinuidades no buffer e matriz eletrofortica Separaes mais protenas so realizadas usando um "descontnuo"buffer de sistema que aumenta significativamente a nitidez das bandas dentro do gel. Durante a eletroforese em gel de um sistema descontnuo, um gradiente de ons formado na fase inicial de eletroforese que faz com que todas as protenas para se concentrar em uma nica banda afiada. Isso ocorre em uma regio do gel que tem poros maiores para que a

matriz de gel no retardar a migrao durante a focagem ou "empilhamento" de eventos. ons negativos do buffer no tanque e depois "fugir" da SDS-cobertas de protena "pilha" e eliminar o gradiente de ons, para que posteriormente as protenas separadas pela ao de peneiramento na parte inferior, "resolver" regio do gel. Muitas pessoas continuam a usar um tris-glicina ou " Laemmli "sistema de tamponamento que as pilhas em um pH de 6,8 e resolve em um pH de ~ 8,3-9,0. Estes pHs promover dissulfeto de formao da ligao entre cistena resduos nas protenas, especialmente quando eles esto presentes em altas concentraes porque o pKa da cistena gamas 8-9 e porque agente redutor presente no tampo de carregamento no co migram com as protenas. Recentes avanos na tecnologia de buffer aliviar este problema, resolvendo as protenas em um pH muito abaixo do pKa da cistena (por exemplo, bis-tris , pH 6,5) e incluem agentes redutores (por exemplo, bissulfito de sdio) que se movem na frente do gel de protenas para manter um ambiente redutor. Um benefcio adicional do uso de buffers com pHs mais baixos que o gel de acrilamida mais estvel para que o gel pode ser armazenado por longos perodos de tempo antes de usar. [19] [20]

[ editar ] SDS eletroforese em gel de gradiente de protenas

Migrao de protenas em gis SDS das concentraes de acrilamida variadas (% T). A migrao de nove protenas variando de 94 kDa a 14,4 kDa mostrado. Empilhar e desempilhar ocorre continuamente no gel, para cada protena em um gel de concentrao diferente. A linha pontilhada indica a descontinuidade na Gly / Cl fronteira em movimento. protenas entre o eletrlito lder rpido eo eletrlito lento no final no so diludas por difuso . Como a voltagem aplicada, os nions (as molculas da amostra carregada negativamente) migram em direo ao eletrodo positivo (nodo) na cmara baixa, o on lder Cl (alta mobilidade e alta concentrao); glicinato o on direita (baixa mobilidade e baixa concentrao). SDS-protena partculas no migrar livremente na fronteira entre o Cl do buffer de gel eo Gly do tampo ctodo. Friedrich Kohlrausch descobriu que a lei de Ohm tambm se aplica aos dissolvido eletrlitos . Por causa da queda de tenso entre o Cl-e-Glycine buffers, as protenas so compactados (empilhados) em camadas finas micrmetro. [21] A fronteira se move atravs de um gradiente de poros ea pilha de protena gradualmente dispersa devido a um aumento da resistncia de atrito do gel matriz. Empilhar e desempilhar ocorre continuamente no gel de gradiente, para cada protena em uma posio diferente. Para uma protena completa desempilhar a concentrao em gel de poliacrilamida-deve ser superior a 16% T. O

sistema de dois-gel de "Laemmli" um gel de gradiente simples. A descontinuidade pH dos buffers no significativa para a qualidade de separao, e um "empilhamento gel" com um pH diferente, no necessrio.