AZIZI
DJAMAL
Buts de lanalyse?
Rechercher et dnombrer les micro-organismes:
Qualit marchande
Germes qui provoquent laltration de laliment. Saveur, odeur
Rfrentiels
Norme NF V 08- 010 :rgles gnrales pour la prparation des dilutions en vue de lexamen microbiologique. Norme NF EN ISO 6887-1 relative la suspension mre et dilutions dcimales;1.rgle gnrale. Norme NF V 08- 057- 2 Microbiologie alimentaire - Directives gnrales pour la prparation des dilutions en vue de lexamen microbiologique. Norme XP V 08 102 relative aux rgles gnrales pour le comptage des colonies et lexpression des rsultats. Norme NF ISO 7218 :rgles gnrales pour les examens microbiologiques. Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais.
La prise dessai:
(exemple: fromage, viande.). B -cas de produit liquide (exemple: lait pasteuris, jus..).
La 1re pese servira au contrle bactriologique. La seconde servira la recherche des Salmonella. La troisime servira la recherche de Listria.
BALANCE
BROYEUR
STOMACHER
DE TYPE
225 ml
TSE
(suspension mre) 10
Bouillon Fraser
+1
Suspension mre
25 ml
25 ml
+1
FRASER
Listria
Salmonella
1 ml
1 ml
1 ml
10
9 ml de TSE
10
10
Suspension mre
1 ml 1 ml
10
1 ml
9 ml de TSE
10
1 ml
9 ml de TSE
10
+1
suspension Solution mre mre
PARAMETRES RECHERCHES
Recherche et dnombrement des microorganismes totaux (Flore msophile) Recherche et dnombrement des levures et moisissures Recherche et dnombrement des Coliformes, Coliformes thermo tolrants et Escherichia coli Recherche et dnombrement des Anarobies Sulfito Rducteurs 37C Recherche et dnombrement de Clostridium Perfringens 46C Recherche et dnombrement des Staphylococcus aureus. Recherche des salmonelles Recherche de Listria
AZIZI
DJAMAL
RECHERCHE ET DENOMREMENT DES MICROORGANISMES PAR COMPTAGE DES COLONIES OBTENUES A 30 C, DANS LES DENRES ALIMENTAIRES
AZIZI AZIZI DJAMAL DJAMAL
Dfinition:
La Flore Msophile Arobie Totale (FMAT) est un indicateur sanitaire qui permet d'valuer le nombre d'UFC (Unit Formant une Colonie) prsentes dans un produit. Ce dnombrement se fait 30C ce qui permet de dnombrer trois grands types de flore: la flore thermophile, temprature optimale de croissance 45C; la flore msophile, temprature optimale de croissance entre 20C et 40C; la flore psychrophile, temprature optimale de croissance 20C.
Rfrentiels
Norme NF 08 051 relative au dnombrement des micro organismes mthode par comptage des colonies obtenues 30C Norme XP V 08 102 relative aux rgles gnrales pour le comptage des colonies et lexpression des rsultats Norme NF V 08 002:Microbiologie alimentaire Directives gnrales pour les examens microbiologiques Norme NF V- 057- 2 Microbiologie alimentaire - Directives gnrales pour la prparation des dilutions en vue de lexamen microbiologique Norme NF ISO 7218:rgles gnrales pour les examens microbiologiques. Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais
Milieu utilis:
Glose PCA
(Plate Count Agar)
AZIZI AZIZI DJAMAL DJAMAL
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
10
10
10
PC A CA
10
10
10
10
10
10
SE GE LO ANCH E BL
RECHERCHE ET DENOMBREMENT DES COLIFORMES,COLIFORME S THERMOTOLERANTS ET ESCERICHIA COLI DANS LES DENREES ALIMENTAIRES
AZIZI DJAMAL
Dfinition :
Les coliformes totaux sont des bactries en forme de btonnet arobies ou anarobies facultatives possdant lenzyme - galactosidase permettant lhydrolyse du lactose 35C avec production de gaz Les principaux genres inclus dans le groupe sont : Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Klebsiella et Serratia
Dfinition:
Les coliformes thermotolrants ou coliformes fcaux sont un sous-groupe des coliformes totaux capables de fermenter le lactose une temprature de 44C
Dfinition:
Escherichia coli: Il sagit l de
coliformes thermotolrants qui produisent , en outre , de lindole partir du tryptophane 44C . La bactrie E. coli reprsente toutefois 80 90 % des coliformes thermotolrants dtects
Milieu utilis:
VRBL:
glose au cristal
DESOXYCHOLATE 1
(pour les produits laitiers)
AZIZI DJAMAL
Rfrentiels
Norme NF ISO 4831 relative au dnombrement des coliformes technique du nombre le plus probable aprs incubation 30C Norme NF V 08 - 050 relative au dnombrement des coliformes mthode par comptage des colonies obtenues 30C Norme NF V 08 017 relative au dnombrement des coliformes fcaux et dEscherichia coli (annexe NF V 08 015 et NF V 08 -016) Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais.
Rfrentiels
Norme NF V 08-051:dnombrement des coliformes par comptage des colonies,mthode de routine. Norme NF V 08-017:dnombrement des coliformes fcaux et dEscherichia coli(annexe NF V 08-015 et NF V08-016) Norme NF ISO 7218:rgles gnrales pour les examens microbiologiques. Norme NF V 08- 010 :rgles gnrales pour la prparation des dilutions en vue de lexamen microbiologique Norme XP V 08-102:rgles gnrales pour le comptage des colonies et lexpression des rsultats:cas des dnombrements en milieu solide Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
10 10
10 10
10 10
CH 1
D E C S HO OXY L 1ATE
e Couler une 2m couche de glose blanche ou de dsoxycholatee 1 ou de VRBL 4ml. Laisser solidifier
glose blanche
glose blanche
2 Co 4 -4 lifo 8h rm es 4 4 fc C au x
Incuber une srie de boites 24-48 h 37C pour la recherche des coliformes totaux Incuber lautre srie 44 C pour la recherche des coliformes thermo tolrants et Escherichia coli
AZIZI AZIZI
DJAMAL DJAMAL
Milieu utilis:
Glose Baird Parker
AZIZI AZIZI
DJAMAL DJAMAL
DEFINITION:
microorganismes de forme sphrique cooci Gram positif halophiles c'est--dire cultivent en prsence de 5 % de NaCl possdent une catalase
(se multiplier dans des salaisons, ou en surface de poissons
sals. Certaines espces psychrotrophes se dveloppent
Rfrentiels
Norme NF ISO 6888 - 1 relative au dnombrement des Staphylocoques coagulase positive(S. aureus et autres espces) Partie 1: technique utilisant le milieu glos de Baird Parker Norme NF V 08 057 1 relative au dnombrement des Staphylocoques coagulase positive par comptage des colonies 37C 1: technique avec confirmation des colonies Norme NF V 08 057 2 relative au dnombrement des Staphylocoques coagulase positive par comptage des colonies 37C 2: technique sans confirmation des colonies Norme NF ISO 6888 -2 relative au dnombrement des Staphylocoques coagulase positive(S. aureus et autres espces) Partie 1: technique utilisant le milieu glos au plasma de lapin et au fibrinogne Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais
15 ml
de
JAUNE
DOEUF
TELLERUTE de POTASSIUM
au
ml
ml
0,1 ml
0,1 ml
0,1 ml
10
10
10
10
10
10
AZIZI AZIZI
DJAMAL DJAMAL
la forme la plus frquente est ovalaire ou sphrique la forme unicellulaire est prdomi
Rfrentiels
Norme XP V 08 059 relative au dnombrement des levures et moisissures par comptage des colonies 25 C Norme NF ISO 7954 relative au dnombrement des levures et moisissures par comptage des colonies 25 C Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais
Milieu utilis:
Sabouraud au Chloramphnicol
AZIZI AZIZI
DJAMAL DJAMAL
0,2 ml ml
0,2 ml
TEMOIN DILUANT
ml
0,2 ml
ml
0,2 ml
TEMOIN MILIEU
ml
10
10
10
Tmoin diluant
10
10
10
RECHERCHE ET DNOMBREMENT DES ANAROBIES SULFITORDUCTEURS A 37C DANS LES DENRES ALIMENTAIRES
AZIZI AZIZI
DJAMAL DJAMAL
Rfrentiels
Norme XP V 08 061 relative au dnombrement en anarobiose des bactries Sulfito Rductrices par comptage des colonies 46 C. Mthode de routine Norme V 08- 056 relative au dnombrement des Clostidium perfringens par comptage des colonies Norme NF V 08 019 relative au dnombrement des Clostidium perfringens par comptage des colonies Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais
Milieu utilis:
Glose Viande Foie
AZIZI AZIZI
DJAMAL DJAMAL
15 mn 75C 10 mn 80C
100C
10-
10-
10-
10-
10-
10-
10-
10-
10-
10-
10-
10-
Incuber 48 h 37C
AZIZI AZIZI
DJAMAL DJAMAL
SALMONELLA
Entrobactrie Bacilles Gram ngatif, Mobile (ciliature pritriche), Aro-anarobie facultatif, Oxydase Fermentative du glucose, Lactose
flagelles
Rfrentiels
Norme NF V 08 6- 052 relative la mthode de routine pour la recherche des Salmonella. Norme EN 12824 relative la recherche des Salmonella Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais
25 gr
BALANCE
Verser lEau Peptone Tamponne dans le sachet strile contenant 25 gr de produit Broyer laliment Verser le contenu dans le flacon dE.P. Tampon
flacon
de 225 ml
(+1) +1
Eau
Peptone tamponne
AZIZI
DJAMAL
RECHERCHE ET DENOMREMENT DES MICROORGANISMES PAR COMPTAGE DES COLONIES OBTENUES A 30 C, DANS LES DENRES ALIMENTAIRES
AZIZI AZIZI DJAMAL DJAMAL
e r
Lecture
24h dincubation
Dnombrer les colonies de formes lenticulaires qui poussent en masse et noter les dilutions correspondantes Tenir compte des boites ayant un nombre compris entre 15 et 300
Germes totaux
Germes totaux
Rincuber 30C
RECHERCHE ET DENOMBREMENT DES COLIFORMES,COLIFORME S THERMOTOLERANTS ET ESCERICHIA COLI DANS LES DENREES ALIMENTAIRES
AZIZI DJAMAL
Dnombrer les colonies rouges qui poussent en masse , noter la dilution correspondante. Tenir compte des boites ayant un nombre compris entre 15 et 150
Colonies rouges
Colonies rouges
Retenir 2 dilutions successives ( plus fortes dilutions) o le nombre de colonies dnombres soit : 15 c 150
Appliquer cette formule: c
Lecture et interprtation:
1,1 x d
c : c + c (c = nombre de colonies de la 1re e dilution et c = nombre de colonies de la 2m dilution retenues). d : le taux de dilution de la 1re boite retenue N = nombre de coliformes totaux / gr ou ml
Lecture et interprtation
Cas dune seule boite positive o C > 30:
N=
c D
Exposer la boite sous radiation UV Lecture immdiate dans une chambre noire Dnombrer les colonies fluorescentes
Lampe UV
Dnombrer les colonies rouges fluorescentes qui poussent en masse , noter les dilutions et les tempratures correspondantes. Tenir compte des boites ayant un nombre compris entre 15 et 150
Colonies fluorescentes
Colonies rouges
Retenir 2 dilutions successives ( plus fortes dilutions) o le nombre de colonies dnombres soit : 15 c 150 Appliquer cette formule: c N 1,1 x d c : c + c (c = nombre de colonies de la 1re dilution et c = nombre de e colonies de la 2m dilution ) d : le taux de dilution de la 1re boite retenue N = nombre de coliformes totaux ou coliformes fcaux / gr ou ml
Lecture et interprtation:
Lecture et interprtation
Cas dune seule boite positive o C > 30:
N=
c D
Coliformes thermotolrants
UREE
AZIZI AZIZI
DJAMAL DJAMAL
Dnombrer les colonies caractristiques et non caractristiques et noter les dilutions correspondantes Colonies Colonies non caractristiques (halo) caractristiques
RECHERCHE ET DNOMBREMENT DES ANAROBIES SULFITORDUCTEURS A 37C DANS LES DENRES ALIMENTAIRES
AZIZI AZIZI
DJAMAL DJAMAL
1 cm
10- 10-
10-
10-
rincuber 48 h 37C
AZIZI AZIZI
DJAMAL DJAMAL
tape denrichissement
D/C
Incuber 18 24h 37 C
AZIZI
DJAMAL
RECHERCHE ET DENOMREMENT DES MICROORGANISMES PAR COMPTAGE DES COLONIES OBTENUES A 30 C, DANS LES DENRES ALIMENTAIRES
AZIZI AZIZI DJAMAL DJAMAL
e m
Lecture
48h dincubation
Dnombrer les colonies de formes lenticulaires qui poussent en masse et noter les dilutions correspondantes. Tenir compte des boites ayant un nombre compris entre 30 et 300
Germes totaux
Germes totaux
Rincuber 30C
indole -
indole +
Lecture et interprtation
Formule: a = b x A c
b : Nombre de colonies caractristiques indole + c : Nombre total de colonies caractristiques sur la boite A : Nombre de colonies caractristiques repiqus a : Nombre dEscherichia Coli identifis par boite
( plus fortes
AZIZI AZIZI
DJAMAL DJAMAL
Dnombrer les colonies caractristiques et non caractristiques et noter les dilutions correspondantes Colonies Colonies non caractristiques (halo) caractristiques
CATALASE
Raction de la catalase:
Pipette Pasteur. Dposer 1 goutte dH2O2 20V Dposer une partie de la colonie
Raction de la coagulase:
a- ensemencer un bouillon cur cervelle
RECHERCHE ET DNOMBREMENT DES ANAROBIES SULFITORDUCTEURS A 37OU 46C DANS LES DENRES ALIMENTAIRES
AZIZI AZIZI DJAMAL DJAMAL
48h dincubation
1 cm
10- 10-
10-
10-
ASR
colonie
Calcul:
e ( x 1 + x 2 ) x inverse de la 1re dilution + ( x 3 + x 4 ) x inverse de la 2m dilution
AZIZI AZIZI
DJAMAL DJAMAL
10 ml
Anse de platine
SFB
D/C
SFB D/C
18-24 h 37C
AZIZI
DJAMAL
RECHERCHE ET DENOMREMENT DES MICROORGANISMES PAR COMPTAGE DES COLONIES OBTENUES A 30 C, DANS LES DENRES ALIMENTAIRES
AZIZI AZIZI DJAMAL DJAMAL
e m
Lecture
72h dincubation
Dnombrer les colonies de formes lenticulaires qui poussent en masse et noter les dilutions correspondantes. Tenir compte des boites ayant un nombre compris entre 30 et 300
Germes totaux
Germes totaux
Rincuber 30C
Lecture et interprtation:
Retenir 2 dilutions successives ( plus fortes dilutions) o le nombre de colonies dnombres soit : 30 c 300 Appliquer cette formule: c 1,1 x d 1 2 1 2 c : c + c (c = nombre de colonies de la 1re dilution et c e = nombre de colonies de la 2m dilution ). d : le taux de dilution de la 1re boite retenue
Lecture et interprtation
Cas dune seule boite positive o C > 30:
N=
c D
/ gr ou ml
Plasma de lapin
0,3 ml
AZIZI AZIZI
DJAMAL DJAMAL
AZIZI AZIZI
DJAMAL DJAMAL
levures
moisissures
LEVURES
MOISISSURES
RECHERCHE ET DENOMBREMENT DES LEVURES ET MOISISSURES DANS LES LAITS T PRODUITS LAITIERS
AZIZI
DJAMAL
AZIZI AZIZI
DJAMAL DJAMAL
Raction
Lecture et interprtation: a =b
FORMULE :
A A
= nombre de colonies caractristiques repiques = nombre de colonies non caractristiques nc repiques b = nombre de colonies caractristiques repiques coagulase + b = nombre de colonies non caractristiques nc repiques coagulase + c = nombre total de colonies caractristiques par boite c = nombre total de colonies non caractnc ristiques par boite
A c c
x c + b xc nc c AAAAAAAAAAA
nc
nc
Lecture et interprtation
Calcul du nombre de staphylocoques aureus: formule: N = a V x 1,1 x F
a = a 1+ a (a = nombre 2 1 de staphylocoques coagulase + 2 la 1re de dilution retenue et a = nombre de staphylocoques e coagulase + de la 2m dilution retenue.
Lecture et interprtation
N
/gr ou ml
d :
Lecture et interprtation
Si c < 15 c Ne = D /gr ou ml
AZIZI AZIZI
DJAMAL DJAMAL
TSI
+ Gaz +
H2S
Autres Salmonella
S.Typhi
S.Paratyphi A
TEMOIN LDC
ONPG UREE
RECHERCHE ET DENOMBREMENT DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS DANS LES DENREES ALIMENTAIRES Milieu utilis:
Bouillon Giolitti cantoni
10-
10-
10-
10-
10-
10-
Incuber 48 h 37C
10-
10-
10-
Reincuber 48 h 37C
Tubes -
Anse de platine
24 48h 37C
Faire une raction de la catalase partir de tout type de colonies ayant pousses
Raction de la catalase:
Pipette Pasteur Dposer 1 goutte dH2O2 20V Dposer une partie de la colonie
.
Apparition de bulles dair
Raction de la coagulase
ensemencer un bouillon cur cervelle
Si catalase +
BOUILLON COEUR CERVELLE
Plasma de lapin
BOUILLON COEUR CERVELLE
0,3 ml
Raction +
Lecture et interprtation
1 x inverse de la dilution
Calcul:
e ( x 1 + x 2 ) x inverse de la 1re dilution + ( x 3 + x 4 ) x inverse de la 2m dilution
AZIZI AZIZI
DJAMAL DJAMAL
225 ml
Fraser Bouillon
Prlever 25 ml de la
Solution mre
+1
FRASER
Listria
SUPPLEMENT
ETHANOL
FRASER
b- additionner le supplment
0,1ml 2.25 ml
SUPPLEMENT
FRASER
BOUILLON FRASER
BOUILLON
FRASER
EAU
DISTILLEE
Supplment
PALCAM
STERILE
Glose
PALCAM
1re tape:
Enrichissement primaire
Incuber le bouillon ensemenc FRASER 18-24h 30C
BOUILLON
FRASER
e 2m tape:
Enrichissement secondaire sur milieu Fraser en tube 1er Isolement sur glose Palcam 0,1ml
BOUILLON
FRASER
BOUILLON
FRASER
Enrichissement I
Incuber 24h 37C Incuber 24-48h 37C
FRASER
PALCAM 1
e 3m tape:
e 2m isolement sur la glose Palcam Lecture de la boite Palcam 1
BOUILLON
FRASER
PALCAM 1
PALCAM 2
Bacilles gram +
Catalase +
Identification de lespce:
ensemencer une galerie biochimique
Mannitol Mobilit
Bouillon Nitrate
Clark et Lubs
Ure
TSI
Esculine
Clark et Lubs
Ure
TSI
Clark et Lubs
RECHERCHE ET DENOMBREMENT DE CLOSTRIDIUM PERFRINGENS PAR COMPTAGE DES COLONIES A 37 C DANS LES LAITS ET PRODUITS LAITIERS
Milieu utilise:
Tryptone Sulfite Cyclosrine
Rfrences
Norme XP V 08 061 relative au dnombrement en anarobiose des bactries Sulfito Rductrices par comptage des colonies 46 C. Mthode de routine Norme V 08- 056 relative au dnombrement des Clostidium perfringens par comptage des colonies Norme NF V 08 019 relative au dnombrement des Clostidium perfringens par comptage des colonies Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
ml
10
10
10
104
TSC
TSC
10
10
10
10 4
Couler une deuxime couche de glose TSC 10 ml, refroidie 47 2C. Laisser solidifier
TSC
TSC
10
10
10
10 4
Jarre
BOUILLON
glycolate
THIO
Repiquer 5 gouttes sur le bouillon Lactose Sulfite + cloche partir du bouillon Thioglycolate 2 gouttes
LACTOSE SULFITE
BOUILLON
glycolate
THIO
Incuber 24 2h en anarobiose
Gaz
LACTOSE SULFITE
Dpt noir
Lecture et interprtation
Formule: a = b x c A b : Nombre de colonies caractristiques + c : Nombre total de colonies caractristiques A : Nombre de colonies caractristiques repiqus a : Nombre de Clostridium Perfringens identifis
Lecture et interprtation
N
/gr ou ml
+.
d :
RECHERCHE ET DENOMBREMENT DES COLIFORMES,COLIFORME S THERMOTOLERANTS ET ESCERICHIA COLI DANS LES DENREES ALIMENTAIRES
AZIZI DJAMAL
Rfrentiels
Norme NF ISO 4831 relative au dnombrement des coliformes technique du nombre le plus probable aprs incubation 30C Norme NF V 08 - 050 relative au dnombrement des coliformes mthode par comptage des colonies obtenues 30C Norme NF V 08 017 relative au dnombrement des coliformes fcaux et dEscherichia coli (annexe NF V 08 015 et NF V 08 -016) Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais
Introduire 1ml des diffrentes dilutions dans chaque tube. Chasser le gaz prsent dans les cloches avant lincubation
1 ml
1 ml
1 ml
10 10 10
10 10 10
10 10 10
VBL
VBL
VBL
VBL
VBL
VBL
VBL
VBL
VBL
Acidification du milieu
Gaz +
VBL
VBL
VBL
VBL
VBL
VBL
VBL
VBL
VBL
++
2
+
2
++ +
3
Dfinition:
Les coliformes thermotolrants ou coliformes fcaux sont un sous-groupe des coliformes totaux capables de fermenter le lactose une temprature de 44C
Dfinition:
Escherichia coli: Il sagit l de coliformes thermotolrants qui produisent , en outre , de lindole partir du tryptophane 44C . La bactrie E. coli reprsente toutefois 80 90 % des coliformes thermotolrants dtects
Repiquer chaque tube de milieu VBL + sur un autre tube de VBL et un tube dEau Peptone Exempt dIndole
2 gouttes 2 gouttes
VBL VBL
Chasser le gaz prsent dans la cloche avant lincubation. Incuber 24h 44C
VBL
-voir acidification du milieu VBL et le dgagement de gaz dans la cloche. -Ajouter le milieu Kovacs au tube dEau Peptone Exempt dIndole et voir la formation dun anneau rouge.
rouge
Gaz +
VBL
Acidification du milieu
Noter le nombre de tubes positifs pour chaque srie de dilutions et se rfrer la table de NPP
10 10 10 10 10 10
1010 10 10 10 10
10 1010 10 10 10
Eau Peptonne
Eau Peptonne
Eau Peptonne
Eau Peptonne
Eau Peptonne
Eau Peptonne
Eau Peptonne
Eau Peptonne
Eau Peptonne
VBL
VBL
VBL
VBL
VBL
VBL
VBL
VBL
VBL
+
2
+
1
+
2
On utilise la formule mathmatique suivante. Appliquer cette formule: c N = V m x (n1 l + 0,1n 2 ) x d1 1) 2 dilutions successives (plus fortes dilutions) o le nombre de colonies dnombres soit compris : 30 c 300. 2) 3) Boite contenant un nombre suprieur 0. Boite ne contenant aucune colonie Ne = 1/ D