Laporan Praktikum Biokimia

Hari / tanggal Waktu PJP Assisten

: 15 September 2009 : 09.00-10.40 WIB : Martini Hudayanti, S.Si : Dedy Suseno Wiwaswan Nukriswanto

PROTEIN REAKSI UJI ASAM AMINO

Kelompok 4 Aminatun muminah Risna Sari Kharis Yohan J3L108047 J3L108065 J3L108009

PROGRAM KEAHLIAN ANALISIS KIMIA DIREKTORAT PROGRAM DIPLOMA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008

Pendahuluan Protein (protos yang berarti paling utama") adalah senyawa organik kompleks yang mempuyai bobot molekul tinggi yang merupakan polimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan satu sama lain dengan ikatan peptida. Peptida dan protein merupakan polimer kondensasi asam amino dengan penghilangan unsur air dari gugus amino dan gugus karboksil. Jika bobot molekul senyawa lebih kecil dari 6.000, biasanya digolongkan sebagai polipeptida. Dalam kehidupan sehari-hari kita melakukan aktivitas. Untuk melakukan aktivitas tersebut, kita memerlukan energi yang dpat diperoleh dari bahan makanan yang kita makan. Dan pada umumnya makanan tersebut mengandung karbohidrat, protein, dan lemak. Protein merupakan suatu zat makanan yang sangat penting bagi tubuh karena zat ini berfungsi sebagai sumber energi dalam tubuh serta sebagai zat pembangun dan pengatur. Protein adalah polimer dari asam amino yang dihubungkan dengan ikatan peptida. Molekul protein mengandung unsur-umsur C, H, O, N, P, S, dan terkadang mengandung unsur logam seperti besi dan tembaga (Winarno, 1992). Melalui reaksi hidrolisis protein telah didapatkan 20 macam asam amino yang dibagi berdasarkan gugus R-nya, berikut dijabarkan penggolongan tersebut : asam amino non-polar dengan gugus R yang hidrofobik, antara lain Alanin, Valin, Leusin, Isoleusin, Prolin, Fenilalanin, Triptofan dan Metionin. Golongan kedua yaitu asam amino polar tanpa muatan pada gugus R yang beranggotakan Lisin, Serin, Treonin, Sistein, Tirosin, Asparagin dan Glutamin. Golongan ketiga yaitu asam amino yang bermuatan positif pada gugus R dan golongan keempat yaitu asam amino yang bermuatan negatif pada gugus R. Dari ke-20 asam amino yang ada, dijumpai delapan macam asam amino esensial yaitu valin, leusin, Isoleusin, metionin, Fenilalanin, Triptofan, Treonin, dan Lisin. Asam amino essensial ini tidak bisa disintesis sendiri oleh tubuh manusia sehingga harus didapatkan dari luar seperti makanan dan zat nutrisi lainnya. Kebanyakan protein merupakan enzim atau subunit enzim. Jenis protein lain berperan dalam fungsi struktural atau mekanis, seperti misalnya protein yang

membentuk batang dan sendi sitoskeleton. Protein terlibat dalam sistem kekebalan (imun) sebagai antibodi, sistem kendali dalam bentuk hormon, sebagai komponen penyimpanan (dalam biji) dan juga dalam transportasi hara. Sebagai salah satu sumber gizi, protein berperan sebagai sumber asam amino bagi organisme yang tidak mampu membentuk asam amino tersebut (heterotrof) . Struktur protein tidak stabil, karena mudah mengalami denturasi yaitu keadaan dimana protein terurai menjadi struktur primernya, baik reversibel maupun ireversibel. Faktor-faktor yang menyebabkan denaturasi adalah pH, panas, pelarut, kekuatan ion, terlarut, dan radiasi. Protein ada yang reaktif, karena asam amino penyusunnya mengandung gugus fungsi yang reaktif, seperti SH, , , dan

. Contoh protein aktif adalah enzim, hormon, antibodi, dan protein transport. Reaksi protein aktif bersifat selektif dan spesifik, gugus sampingnya yang selektif dan susunan khas makromolekulnya. Ada berbagai cara dalam pengujian terhadap protein yaitu dengan reaksi uji asam amino dan reaksi uji protein. Reaksi uji asam amino sendiri terdiri dari 6 macam uji yaitu: uji millon, uji hopkins cole, uji belerang, uji xantroproteat, dan uji biuret. Sedangkan untuk uji protein, berdasarkan pada pengendapan oleh garam, pengendapan oleh logam dan alkohol. Serta uji koagulasi dan denaturasi protein. Pada uji asam amino terdapat uji bersifat umum dan uji bersifat uji berdasakan jenis asam aminonya. Seperti halnya uji millon bersifat spesifik terhadap tirosin, uji Hopkins cole terhadap triptofan, uji belerang terhadap sistein, uji biuret bereaksi positif terhadap pembentukan senyawa kompleks Cu gugus CO dan NH dari rantai peptida dalam suasana basa. Serta uji xantroproteat bereaksi positif untuk asam amino yang mengandung inti benzena.

Tujuan Praktikum bertujuan menentukan sifat dan struktur asam amino dan protein melalui uji-uji kualitatif.

Alat dan bahan Alat-alat yang digunakan pada praktikum adalah pipet tetes, tabung reaksi, gelas piala, hot plate, pipet mohr, dan bulb. Sedangkan bahan-bahan yang digunakan adalah albumin 0,02%, gelatin 0,02%, kasein 0,02%, pepton 0,02%, fenol 0,02%, ninhidrin, air, NaOH 10%, PbAsetat 5%, HNO3 pekat, NaOH pekat, CuSO4 0,1%, albumin 2%, gelatin 2%, kasein 2%, pepton 2%, dan fenol 2%

Prosedur Pada percobaan uji Ninhidrin dipipet 3 ml larutan protein yang akan di uji kedalam tabung reaksi. Kemudian ditambahkan 0,5 ml ninhidrin 0,1%. Lalu dipanaskan hingga terjadi perubahan warna. Pada percobaan uji belerang, dipipet 5 ml larutan protein yang akan di uji kedalam tabung reaksi. Kemudian ditambahkan 5 ml NaOH 10%, lalu dididihkan dan ditambahkan 15 tetes Pb-asetat 5%. Kemudian dipanaskan kembali hingga terjadi perubahan warna. Pada percobaan uji xantoproteat , dipipet 2 ml larutan protein yang akan di uji kedalam tabung reaksi dan ditambahkan 1 ml pekat. Kemudian dipanaskan,

lalu didinginkan kembali. Setelah dingin ditambahkan NaOH pekat pertetes hingga terjadi perubahan warna. Pada percobaan uji biuret, dipipet 3 ml larutan protein. Lalu ditambahkan 1 ml NaOH 10%. Kemudian dikocok dan ditambahkan 1 tetes kembali dan ditambahkan 2 tetes 0,1%. Lalu dikocok

. Lalu dicacat perubahan warnanya.

Hasil Percobaan Tabel 1 Hasil Uji Biuret Sampel Hasil

0,02% Albumin Gelatin Kasein Pepton Fenol (+) ungu (+) ungu (+) ungu (+) ungu (-) biru muda

2% (+) ungu (+) ungu (+) ungu (+) ungu (-) biru muda

Keterangan:

(+) (-)

= Dalam sampel terdapat ikatan peptida = Dalam sampel tidak terdapat ikatan peptida

Gambar 1. Uji biuret 0,02%

Tabel 2 Hasil Uji Ninhidrin Sampel 0,02% Albumin Gelatin Kasein (+) ungu muda (+) ungu muda (-) putih Hasil 2% (+) biru ungu (+) ungu bening (+) biru ungu

Pepton Fenol

(+) ungu tua (-) kuning

(+) biru ungu (-) kuning

Keterangan:

(+) (-)

= sampel mengandung asam amino bebas = sampel tidak mengandung asam amino bebas

Gambar 2. Uji ninhidrin 0,02% Tabel 3 Hasil Uji Xantoproteat Sampel 0,02% Albumin Gelatin Kasein Pepton Fenol (+) jingga (-) tidak berwarna (+) kuning jingga (+) kuning jingga (+) jingga Hasil 2% (+) jingga (-) tidak berwarna (+) kuning jingga (+) kuning jingga (+) jingga

Keterangan:

(+) (-)

= Sampel mengandung inti benzena = Sampel tidak mengandung inti benzena

Gambar 2. Uji Xantoproteat 0,02%

Tabel 4 Hasil Uji Belerang Sampel 0,02% Albumin Gelatin Kasein Pepton Fenol (-) tidak berwarna (-) tidak berwarna (-) tidak berwarna (-) tidak berwarna (-) tidak berwarna Hasil 2% (-) tidak berwarna (-) tidak berwarna (+) keruh (+) cokelat bening (-) tidak berwarna

Keterangan:

(+) (-)

= terdapat sistein dalam sampel = tidak terdapat sistein dalam sampel

Gambar 4. Uji belerang 0,02%

Pembahasan Pada berbagai uji kualitatif yang dilakukan terhadap beberapa macam protein, semuanya mengacu pada reaksi yang terjadi antara pereaksi dan komponen protein, yaitu asam amino tentunya. Beberapa asam amino mempunyai reaksi yang spesifik pada gugus R-nya, sehingga dari reaksi tersebut dapat diketahui komponen asam amino suatu protein. Prinsip dari uji millon adalah pembentukan garam merkuri dari tirosin yang ternitrasi. Tirosin merupakan asam amino yang mempunyai molekul fenol pada gugus R-nya, yang akan membentuk garam merkuri dengan pereaksi millon. Pereaksi millon adalah larutan yang berisi merkuri dan ion merkuro dalam asam nitrat dan nitrit. Apabila peraksi ini ditambahkan pda larutan protein, akan menghasilkan endapan putih yang dapat berubah menjadi merah oleh pemanasan. Warna merah yang terbentuk adalah garam merkuri dari tirosin yang ternitrasi. Pada dasrnya reaksi ini positif untuk fenol, karena terbentuknya senyawa merkuri dengan gugus hidroksifenil yang berwarna. Protein yang mengandung tirosin akan memberikan hasil positif. Dalam praktikum kali ini, uji millon tidak dilakukan. Pereaksi yang digunakan dalam uji Hopkins-Cole mengandung asam glioksilat. Reaksi ini berdasarkan adanya triptofan dalam molekul protein. Triptofan

mudah sekali berkondensasi dengan aldehid bila ada asam kuat, sehingga membentuk persenyawaan berwarna, yaitu cincin berwarna ungu. Larutan protein yang mengandung triptofan dapat direaksikan dengan pereaksi Hopkins-cole yang mengandung asam glioksilat. Pereaksi ini dibuat dari asam oksalat dengan serbuk magnesium dalam air. Triptofan mudah sekali berkondensasi dengan aldehid bila ada asam kuat sehingga membentuk persenyawaan berwarna. Bahan yang mengandung triptofan, membentuk warna violet pada batas antara bahan dan asam glioksilat. Pereaksi ini memberikan hasil positif khas untuk gugus indol dalam protein. Asam oksalat COOH COOH Serbuk Mg Asam Glioksilat CHO COOH Biuret adalah senyawa dengan dua ikatan peptida yang terbentuk pada pemanasan dua mulekul urea. Ion Cu2+ dari preaksi Biuret dalam suasana basa akan berekasi dengan polipeptida atau ikatan-ikatn peptida yang menyusun protein membentuk senyawa kompleks berwarna ungu atau violet. Reaksi ini positif terhadap dua buah ikatan peptida atau lebih, tetapi negatif untuk asam amino bebas atau dipeptida. Polipeptida mempuyai perbedaan dengan protein. Polipeptida mempunyai residu asam amino 100 dan dan bobot mulekul 6.000. Sedangkan, pada protein residu asam amnionya 100 dan bobot mulekulnya 6.000. pada percobaan ini, semua sampel menunjukkan hasil posiif. Hal ini terjadi karena Albumin, Gelatin, dan Kasein memiliki rumus bangun yang lebih kompleks dan mengikat dua atau lebih asam amino esensial, sehingga terbentuk ikatan peptida. Berikut gambaran proses pembantukan ikatan peptida : NH2 C=O NH2 NH2 C=O NH2 NH2 C=O NH NH3 + C=O NH2 Ikatan peptida

Pada uji biuret, semua protein yang diujikan memberikan hasil positif. Biuret bereaksi dengan membentuk senyawa kompleks Cu dengan gugus -CO dan -NH pada asam amino dalam protein. Fenol tidak bereaksi dengan biuret karena tidak mempunyai gugus -CO dan -NH pada molekulnya. Pada uji Biuret, perbedaan konsentrasi larutan relatif memberikan hasil yang sama. Protein yang mengandung sedikitnya satu gugus karboksil dan gugus asam amino bebas akan bereaksi dengan ninhidrin membentuk persenyawaan berwarna. Uji ini bersifat umum untuk semua asam amino, dan menjadi dasar penentuan kuantitatif asam amino. Pada uji ini, hanya kasein yang menunjukkan uji negatif terhadap ninhidrin. Hal ini disebabkan karena pada kasein tidak mengandung sedikitnya satu gugus karboksil dan amino yang terbuka. Apabila ninhidrin dipanaskan dengan asam amino, maka akan terbentuk kompleks warna. Untuk salah satu asam amino dapat ditentukan secara kuantitatif dengan jalan mengamati intensitas warna yang terbentuk yang sebanding dengan konsentrasi dari asam amino tersebut. Dalam hal ini NH3 dan CO2 dikeluarkan sehingga kemungkinan dapat diukur secara kuantitatif. Reaksi : RCH(NH2)COOH RCHO + NH3 + CO2 (warna ungu) Pada uji ninhidrin yang dilakukan pada konsentrasi 0,02% albumin, gelatin dan pepton menunjukan hasil positif ( menghasilkan kompleks warna biru yang ). Sedangkan pada konsentrasi 2%, semua asam amino yang diuji menghasilkan hasil positif. Hanya fenol yang mempunyai gugus amino sekunder, bereaksi berbeda dan

menghasilan zat warna kuning pada konsentrasi 0,02% dan 2%, tetapi ini pun dapat digunakan untuk analisis. Senyawa ninhidrin merupakan hidrat dari triketon siklik, dan bila bereaksi dengan asam amino, menghasilkan zat warna ungu. Hanya atom nitrogen dari zat warna ungu yang berasal dari asam amino, asam amino selebihnya terkonversi menjadi aldehid dan karbon dioksida. Jadi, zat warna ungu yang sama dihasilkan dari semua asam amino dengan gugus amino primer dan intensitas warnanya berbanding

lurus dengan konsentrasi asam amino yang ada. Pada uji xantoproteat, ada sebagian peptida dan protein yang mempunyai gugus asam amino berinti benzene, seperti fenol, tirosin, albumin, riptofan dan lain sebagainya. Jika ditambahkan asam nitrat pekat akan mengendap dengan endapan berwarna putih yang dapat berubah menjadi kuning sewaktu dipanaskan. Senyawa nitro yang terbentuk dalam suasana basa akan terionisasi dan warnanya akan berubah menjadi lebih tua atau jingga. Rekasi ini didasarkan pada uji nitrasi inti benzena yang terdapat pada molekul protein menjadi senyawa intro yang berwarna kuning. Uji Xantoproteat positf bagi kebanyakan protein.Pada percobaan ini, hasil positif terjadi pada albumin, kasein pepton fenol pada konsentrasi 0,02% dan 2%. Sedangkan, hasil percobaan pada gelatin menghasilkan larutan tidak berwarna yang mmberi hasil negatif. Berikut contoh struktur bangun protein yang berinti benzena :

OH

Fenol Pada uji belerang digunakan pereaksi Pb-asetat. Dalam larutan basa, yang berasal dari sistein akan bereaksi dengan Pb-asetat membentuk garam PbS yang berwarna hitam. Dari hasil percobaan, kasein 2% dan pepton 2% menunjjukan hasil positif membentuk warna coklat muda. Sedangkan pada konsentrasi 0,02% semua

asam amino yang diuji menunjukan hasil negatif yaitu pada larutan tetap tidak terjadi perubahan warna. Sistein dan Metionin merupakan asam amino yang mengandung atom S pada molekulnya.. Reaksi Pb-asetat dengan asam-asam amino tersebut akan membentuk endapan berwarna kelabu, yaitu garam PbS. Penambahan NaOH dalam hal ini adalah untuk mendenaturasikan protein sehingga ikatan yang menghubungkan atom S dapat terputus oleh Pb-asetat membentuk PbS. Dari semua bahan yang diuji, hanya albumin yang membentuk endapan PbS, sehingga dapat disimpulkan albumin mengandung Sistein ataupun Metionin. Inti benzena dapat ternitrasi oleh asam nitrat pekat menghasilkan turunan nitrobenzena. Fenilalanin, Tirosin, dan Triptofan yang mengandung inti benzena pada molekulnya juga mengalami reaksi dengan HNO3 pekat. Untuk perbandingan, dapat ditunjukkan oleh fenol yang bereaksi membentuk nitrobenzena. Hasil uji menunjukkan bahwa dari semua bahan, hanya kasein yang tidak mengandung asam amino yang mempunyai inti benzena pada molekulnya. Protein yang tercampur oleh senyawa logam berat akan terdenaturasi. Hal ini terjadi pada albumin yang terkoagulasi setelah ditambahkan AgNO3 dan Pb-asetat. Senyawa-senyawa logam tersebut akan memutuskan jembatan garam dan berikatan dengan protein membentuk endapan logam proteinat. Protein juga mengendap bila terdapat garam-garam anorganik dengan konsentrasi yang tinggi dalam larutan protein. Berbeda dengan logam berat, garam-garam anorganik mengendapkan protein karena kemampuan ion garam terhidrasi sehingga berkompetisi dengan protein untuk mengikat air. Pada percobaan, endapan yang direaksikan dengan pereaksi millon memberikan warna merah muda, dan filtrat yang direaksikan dengan biuret berwarna biru muda. Hal ini berarti ada sebagian protein yang mengendap setelah ditambahkan garam. Simpulan

Pada praktikum kali ini didapatkan albumin positif pada uji ninhidrin, uji xantoproteat, dan uji biuret. Sedangkan gelatin positif pada uji ninhidrin dan uji biuret. Kasein positif pada uji biuret, uji ninhidrin pada kasein 2%, uji xantoproteat, dan pada uji belerang pada kasein 2%. Pepton positif pada uji biuret, uji ninhidrin, uji xantoproteat, dan uji belerang pada kasein 2%. Fenol positif pada uji xantoproteat. Daftar Pustaka Jalip, I.S. 2008. Penuntun Praktikum Kimia Organik. Laboratorium Kimia Fakultas Biologi Universitas Nasional. Jakarta. Robinson, Trevor. 1995. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi. Bandung: Penerbit ITB Hawab, H.M. 2004. Pengantar Biokimia. Malang: Bayumedia Publishing