*TEMA 14

HISTOQUMICA

1. HISTOQUIMICA DE LOS HIDRATOS DE CARBONO 1.1 INTRODUCCIN

La histoqumica es la aplicacin de reacciones qumicas y bioqumicas en la tcnica histolgica, con el fin de localizar y determinar de manera cientfica ciertas sustancias o su actividad. En todas estas reacciones o bien se tie la sustancia que buscamos o los colorantes reaccionan qumicamente con ella, como es el caso del PAS. Los hidratos de carbono o glcidos son polialcoholes oxidados (polihidroxicetonas o polialdehidos). Los polisacridos son glcidos formados por la unin de muchas molculas de monosacridos (mas de 10). Entre los polisacridos adems de los polisacridos simples como el glucgeno destacan los polisacridos complejos. Los polisacridos complejos se dividen en 3 grandes grupos: 1. Mucopolisacaridos que pueden dividirse en : - Mucopolisacaridos neutros - Mucopolisacaridos cidos 2. Mucoprotenas 3. Mucolpidos.

1.2. REACCIONES HISTOQUMICAS BASADAS EN LA DEMOSTRACIN DE GRUPOS CARBONILO FORMADOS SOBRE LOS HIDRATOS DE CARBONO POR OXIDACIN PREVIA. TCNICA DEL PAS (cido Peridico Schiff) Consiste en oxidar los tejidos mediante el cido peridico (HIO4) para incrementar el nmero de grupos carbonilo (aldehdo o cetona) presentes en ellos, de forma que puedan ser demostrados posteriormente mediante reactivo de Schiff. Los hidratos de carbono contienen grupos carbonilos relativamente aislados, en una proporcin aproximada de uno por molcula de monosacrido. Precisamente por ello es necesario oxidarlos con el fin de incrementar dichos grupos, que solo pueden ser detectados por el reactivo de Schiff si se encuentran situados en carbonos contiguos y delimitados por grupos alcohlicos o amino. Para los grupos aldehidos que aparecen en posicin 1,2 glicol estas condiciones se cumplen exclusivamente tras la oxidacin de los correspondientes radicales hidroxilo. A. Procedimiento Tcnico: Fijacin:

- Formol al 4 % o Lquido de Carnoy o Bouin. cido Peridico0.5 % p/v. Reactivo de Schiff: Fucsina bsica (CI: 42510) 1g. Agua destilada... 200 ml. Disolver la fucsina en 200 ml de agua (d) hirviendo. Dejar enfriar hasta aproximadamente 50 C. y filtrar Posteriormente agregar 20 ml de HCl 1N. Despus enfriar hasta 25 C y aadir 1g de Bisulfito sdico o Metabisulfito potsico (sdico). Mantener en la oscuridad. El liquido tarda unos 2 das o a veces 24h en tornarse de color amarillo que indica que est listo para su uso. Aadir 2g de carbn activado, mezclar y filtrar hasta que desaparezca el color. La solucin debe conservarse en el refrigerado protegido de la luz. Bao de cido Sulfuroso o Agua sulfurosa: cido Clorhdrico (HCl) 1N 5 ml. Metabisulfito sdico 10 %... 6 ml. Agua (d)... 100 ml. Colorante de contraste: Hematoxilina, Orange G o Van Gieson. Tcnica de Tincin: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Desparafinar e hidratar (xilol y decrecientes alcoholes) cido peridico 0.5 % 5 min. Lavar en agua (d). Reactivo de Schiff.. 15- 30 min. Aclarar en 3 baos de agua sulfurosa 2 min. Cada uno. Lavar en agua corriente Colorante de contraste Lavar con agua corriente. Deshidratar, aclarar y montar.

Resultados: Material PAS +: rojo oscuro a magenta. B. Compuestos PAS + 1. polisacridos simples: como el glucgeno y la celulosa.

2. Mucopolisacaridos neutros: se encuentran en el epitelio gstrico, en glndulas del duodeno y en cpsulas bacterianas, tambin en intestino y estmago. 3. mucoprotenas como son algunas mucinas del tubo digestivo y del rbol respiratorio o bronquial, tambin la tiroglobulina que est en el tiroides y la hormona estimulante. 4. Glucoprotenas del suero 5. Glucolpidos: como los ganglisidos y cerebros idos. C. Compuestos PAS Los mucopolisacaridos cidos no pueden ser oxidados por el cido peridico y por eso son PAS (ya que no aparecen los grupos carbonilos) D. Controles de la tcnica del PAS. Es imprescindible realizar preparaciones testigo o de control que confirmen los resultados obtenidos, para ello suelen ser muy tiles las tcnicas de bloqueo tales como las de bloqueo de grupos aldehdos en general y las de acetilacin de grupos aldehdos situados en posicin 1,2 glicol.

Tcnica de bloqueo para aldehdos en general Se realiza tratando los grupos aldehido presentes en el tejido, tras la oxidacin con cido peridico con una solucin de cido actico saturado con Dimedona, entre 1-16 h. a 60 C. Posteriormente se lava con agua destilada y se contina con PAS normal. nicamente se teir el material PAS + formado a expensas de grupos aldehdos situados en posicin 1,2 glicol (los que proceden de glcidos). Tcnica de bloqueo mediante acetilacin para grupos 1,2 glicol. Se basa en la negatividad de la reaccin del PAS despus de la acetilacin de los grupos 1,2 glicol presentes en los hidratos de carbono. Este proceso es total o parcialmente reversible por saponificacin posterior mediante tratamiento con hidrxido potsico. Si no se ha realizado el bloqueo de los aldehdos preexistentes debe realizarse un control sin oxidar el tejido; todo lo coloreado en esta preparacin no sern grupos 1,2 glicol oxidados, sino grupos aldehdos que ya estaban presentes antes de la oxidacin. Despus se realiza el PAS oxidando y se compara los resultados de ambas preparaciones. El 2 problema en la tcnica del PAS se plantea cuando se trata de diferenciar si los grupos aldehdos aparecidos tras la oxidacin lo han hecho sobre grupos alcohlicos situados en posicin 1,2 glicol o si los oxidados han sido grupos hidroxiaminos primarios o hidroxiaminos secundarios, compuestos no presentes habitualmente en los hidratos de carbono que son PAS +. Esta distincin pude realizarse mediante acetilacin reversible y saponificacin. Acetilar consiste en introducir un grupo acetilo en un compuesto orgnico. El anhdrido actico es un reactivo que tiene gran aplicacin para acetilar, de forma que con este reactivo se bloquean todos los grupos alcohlicos en general existentes en el tejido.

CH3 C O C CH3 + ROH O O Este tipo de unin se llama ster.

CH3 C O R O

Saponificar es romper un enlace tipo ester de forma que en condiciones idneas reaparece el grupo qumico que exista antes de la acetilacin. La acetilacin es totalmente reversible tras saponificacin para los grupos alcohlicos en posicin 1,2 glicol; totalmente irreversible para los grupos hidroxiaminos secundarios y moderadamente reversible para los hidroxiamino primarios. CH3 C O R O + KOH -----------CH3 COOK + R OH

Procedimiento tcnico de acetilacin saponificacin -

Soluciones:

1. Mezcla para la acetilacin: Anhdrido actico. 13 ml. Piridina anhidra 20 ml. 2. mezcla para la saponificacin Hidrxido potsico 1N en solucin acuosa o en alcohol 80 C. Modo de operar: 1. Acetilacin: Desparafinar e introducir los cortes en alcohol absoluto. Secarlos y pasarlos a la piridina. Tratar con la mezcla de acetilacin de 37 - 58 C durante un tiempo que depende del material biolgico y suele estar de 30 min. a 24 h. Pasamos los cortes a la piridina. Alcohol absoluto. Hidratar. 2. Acetilacin + saponificacin: Se repite el proceso anterior. Tratar con la disolucin de KOH durante 45 min. Enjuagar con agua. - Lotes de preparaciones y resultados en los controles de la tcnica del PAS. 1. Una preparacin a la que se le hace el PAS normal. 2. Otra preparacin del mismo corte. Se le hace un PAS sin oxidar para detectar grupos aldehdos ya existentes o bien se hace un mtodo de bloqueo especfico para dichos grupos. 3. Un lote de cortes que llevan acetilacin.

4. Un lote de cortes que llevan acetilacin + saponificacin. Resultados: Al acetilar desaparecen todos los grupos PAS+ menos los aldehdos ya existentes. Al acetilar y saponificar los grupos alcohlicos en posicin 1,2 glicol quedan como estaban, recuperan la PAS positividada. Los hidroxiamino primarios reaparecen mucho ms dbilmente y los secundarios permanecen bloqueados al ser la acetilacin irreversible.

1.3 TCNICAS PARA DETERMINAR MUCOPOLISACRIDOS CIDOS. Los mucopolisacaridos cidos son unos polisacridos que no tienen grupos alcohlicos en posicin 1,2 glicol sino grupos cidos carboxilos o sulfatados. Las tcnicas para determinar mucopolisacridos cidos son principalmente: a) Azul Alcin b) Reaccin Metacromtica a) Tcnica del Azul Alcin: se ha comprobado que usando el azul alcin en condiciones de pH en torno a 2,4 -2,6 se colorean los mucopolisacridos cidos sulfatados y los carboxlicos. Si por el contrario se emplea a un pH muy bajo, en torno a 1, slo se colorea los mucopolisacridos sulfatados, los carboxlicos no se tien. Si se sigue disminuyendo el pH hasta 0,5 se incrementa la selectividad de la tincin y en este caso slo se tien los mucopolisacridos fuertemente sulfatados. Procedimiento Tcnico: Fijacin: formol al 4%. Soluciones: b) Azul alcin a pH 2,5: Azul alcin (C.I. 74240) 1 g. cido Actico 3%.. 100 ml. c) Azul alcin a pH 1: Azul alcin. 1 g. HCl 0,1 N 100 ml. d) Azul alcin a pH 0,5 : Azul alcin . 1 g. HCl 0,5 N .. 100 ml. Filtrar todas las soluciones antes de usar.

Las soluciones son estables durante 2 semanas aproximadamente, como colorante de contraste se puede usar una solucin de Rojo nuclear al 1 %. Modo de operar: Desparafinar e hidratar. Tratar con la solucin deseada de azul alcin durante 30 min. Si se us la solucin a pH 2,5, lavar con agua (d) ; si se us cualquiera de los otros dos, secar slo con papel de filtro. Contrastar si se desea con rojo nuclear. Deshidratar, aclarar y montar.

Resultados: Azul alcin a pH 2,5 los mucopolisacaridos cidos (carboxilos y sulfatos) se tien de azul. Azul alcin a pH 1 slo se tien de azul los mucopolisacaridos cidos sulfatados. Azul alcin a pH 0,5 slo se tien de azul los mucopolisacaridos cidos fuertemente sulfatados.

b) Reaccin Metacromtica: La metacromasia indica un cambio de color cuando un colorante qumicamente puro tie selectivamente una estructura tisular de color diferenteal de la solucin diluida de colorante; se dice que ha ocurrido una reaccin metacromtica. La estructura responsable de este cambio se llama cromotropa. Para distinguirla de las restantes que se tien normalmente (ortocromticas) Sustancias cromotropas son los mucopolisacaridos cidos, cidos nucleicos, lpidos de carcter cido y partculas de slice. La reaccin metacromtica presenta grandes variaciones ante las ms pequeas modificaciones del medio donde reproduce, por lo tanto la reaccin metacromtica es de difcil interpretacin e incluso puede proporcionar resultados contradictorios. AZUL DE TOLUIDINA (tcnica de metacromasia que mas se hace) - Fijacin: En el caso de los mucopolisacaridos cidos pueden emplearse tejidos fijados con alcohol, Bouin alcohlico e incluso formol pero deben evitarse los fijados con agentes oxidantes. Soluciones: Solucin Tampn de cido actico acetato a pH 4,2: Acetato sdico. 2,7 g.

H2O (d). 100 ml. cido actico 0,5 M.. 1,1 ml H2O (d). 100 ml. Solucin A. 30 ml. Solucin B. 90 ml. Solucin a 0,2 % de azul de toluidina en la solucin tamponada anterior. Solucin acuosa al 4 % de molibdato amnico. Procedimiento Tcnico: Desparafinar e hidratar. Teir con azul de Toluidina. 2 5 min. Lavar en la solucin tamponada. Tratar los cortes en la solucin de molibdato.. 10 min. Lavar con agua (d). Deshidratar, aclarar y montar.

Resultados: Elementos de carcter metacromtico se van a ver de rojo a prpura y el resto se va a ver azul. Los baos en alcohol etlico inhiben la metacromasia por lo que deben realizarse preparaciones testigo. Una 1 preparacin se observa tras su paso por el agua ctica antes de fijar con molibdato. Esto tiene por objeto evaluar el efecto metacromtico inmediato en fase inestable. A continuacin se sigue el procesamiento normal. Otra preparacin no se deshidrata y se monta en un medio acuoso para evitar el paso por alcohol etlico. La ltima preparacin se confecciona normalmente, es decir, deshidratando y montando por el mtodo habitual. Comparando las 3 preparaciones se puede seguir la evolucin del efecto metacromtico y la influencia del procesamiento histolgico realizado sobre ellas. Tambin se deben realizar controles de especificidad en la reaccin metacromtica. Se usan para distinguir entre mucopolisacaridos cidos carboxlicos y sulfatados. Son principalmente de 2 tipos: 1. Variacin de pH: consiste en realizar la tincin entorno a un pH de3, 5. en este caso la mayora de los mucopolisacaridos cidos carboxlicos pierden su metacromasia mientras que los sulfatados la conservan. Haremos 2 lotes: el 1 se tien a pH 4,5 y el 2 a 3,5.

Los mucopolisacaridos cidos que siguen siendo metacromticos en el 2 lote corresponden a mucopolisacaridos cidos sulfatados ya que los carboxlicos pierden su metacromasia. 2. Metilacin reversible: consiste en tratar un grupo de cortes con una mezcla de alcohol metlico y cido clorhdrico, con lo que se bloquean por metilacin los grupos cidos de los mucopolisacaridos cidos. Despus se realiza mutilacin seguida de saponificacin, reapareciendo la metacromasia solamente en los mucopolisacaridos cidos carboxlicos. 1.4 TCNICA PARA DIFERENCIAR MUCOPOLISACRIDOS CIDOS, NEUTROS Y GLICOPROTENAS. TCNICA DEL AZUL ALCIAN PAS. Procedimiento Tcnico: Fijacin: formol al 4 %. Soluciones: 1. Solucin azul alcin a pH 2,5. 2. Solucin cido peridico el 0,5 %. 3. Reactivo de Schiff. 4. Solucin de cido sulfuroso. 5. Colorante de contraste.

Tcnica: Desparafinar e hidratar. Solucin azul alcin a pH 2,5 30 min. Lavar con agua (d) cido peridico. 10 min. Lavar con agua (d). Reactivo de Schiff 15 30 min. Aclarar con 3 baos de agua sulfurosa.. 2 min. Cada uno. Lavar con agua corriente ... 5 min. Colorante de contraste (Hematoxilina Harris normalmente). Lavar, clorar y montar.

Resultados: Mucopolisacaridos cidos: azul Mucopolisacaridos neutros y glicoprotenas: rojo o rosa. Resto: violeta (si se usa hematoxilina).

2. HISTOQUMICA DE PROTENAS Y ACIDOS NUCLEICOS. 2.1. METODOS HISTOQUMICOS PARA LA COLORACION DE PROTENAS. Desde la introduccin de los mtodos inmunohistoqumicos que permiten caracterizar antignicamente a la mayor parte de las protenas, todos los mtodos de coloracin puramente histoqumicas para protenas han perdido vigencia. De forma genrica las tcnicas histoqumicas para colorear protenas pueden clasificarse en 3 grupos: 1. Reacciones generales: pretenden colorear globalmente a las protenas presentes en un tejido. 2. Reacciones de grupo: pretenden caracterizar, no la molcula proteica globalmente sino un corto numero de grupos reactivos especficos de dichas sustancias. 3. Reacciones especficas: para grupos qumicos particulares propios de de determinados aminocidos, como por ejemplo el grupo fenol. A) Reacciones de grupo. Reaccin de Ninhidrina Schiff. Se trata de establecer la naturaleza proteica de una determinada sustancia a partir de la demostracin en ellas de ciertos grupos qumicos que se encuentran de forma exclusiva en los polipptidos. La reaccin de la Ninhidrina Schiff se basa en un proceso de desaminacin oxidativa de las cadenas polipeptdicas, provocado por la ninhidrina por el cual los grupos amino son sustituidos por grupos carbonilo. Tras el proceso se realiza la determinacin de los carbonilos neoformados mediante reactivo de Schiff (igual que la tcnica del PAS). TCNICA DE LA NINHIDRINA SCHIFF Fijacin: alcohol o acetona. Formol tamponado y lquido de Zenker, tambin se puede utilizar pero en estos casos el tiempo de incubacin con la ninhidrina debe ser superior a 20 horas. Se pueden utilizar secciones en congelacin o en parafina. Soluciones: - Solucin de ninhidrina: Ninhidrina.. 0.5 g. Etanol absoluto............... 100 ml. Solucin de reactivo de Schiff. Procedimiento:

1. Desparafinar e hidratar. 2. Tratar los cortes con alcohol etlico al 70 %. 3. Incubar a 37 C con la solucin de ninhidrina entre 6 24 horas, (habitualmente toda la noche).

4. 5. 6. 7. 8. -

Lavar bien las secciones en agua corriente. Teir con reactivo de Schiff.. 30 45 min. Contrastar con hematoxilina de Harris. Posteriormente lavar con agua corriente 10 min. Deshidratar, aclarar y montar. Resultados: Grupos amino (NH2): rojo rosa prpura.

Controles: La ninhidrina solo oxida los grupos amino cuando estn prximos a un radical metilo o a un radical cido. Adems es posible la aparicin de falsos positivos en casos de preexistencia de grupos aldehdos en el tejido (R C = O), por ello debe incluirse siempre un lote de preparaciones sin tratamiento con la ninhidrina, es decir, que se traten slo con el reactivo de Schiff. 2.2 METODOS HISTOQUMICOS PARA LA DETERMINACION DE ACIDOS NUCLEICOS. Los cidos nucleicos estn compuestos por largas cadenas de unidades llamadas nucletidos, enlazadas por uniones covalentes. En general los nucletidos estn formadas por: - cido fosfrico, implicado en el mecanismo fisico-quimico de coloracin por el cual se tien intensamente con colorante bsicos como le hematoxilina. - Una pentosa (5 carbonos), que puede ser ribosa (ARN) o desoxiribosa (ADN). - Bases nitrogenadas ( ADN : A,C,T,G), ( ARN: A,C,G,U) En condiciones normales los cidos nucleicos se conjugan con protenas bsicas para formar nucleoprotenas, por ello la realizacin de una hidrlisis cida permite separar el componente proteico y as poder demostrar la presencia de cidos nucleicos (los cidos nucleicos se enrollan sobre las protenas y la hidrlisis es para eliminar las protenas). A) Tcnicas que permiten separar el ADN de otras estructuras. Reaccin de Feulgen. Estas tcnicas se utilizan para visualizar el ncleo, el proceso de tincin se realiza en 2 fases: 1 Fase. Una hidrlisis cida del ADN: con esto se pretende mediante la actuacin del cido clorhdrico romper la estructura del ADN por el lugar en que la pentosa se une a la base nitrogenada, de forma que sobre cada molcula de azcar (pentosa) reaparece un grupo carbonilo. Estos grupos se encuentran situados a una distancia entre 1 1.1 nm. 2 Fase. Demostracin de los grupos carbonilos: mediante reactivo de Schiff (color rosa ADN slo). El ARN no puede ser detectado por el reactivo de Schiff tras la realizacin de

la hidrlisis cida, puesto que la distancia entre grupos carbonilo es menor de 1 nm, y por tanto no se produce la reaccin con el reactivo de Schiff. Problemas generales de esta tcnica:

1. Hidrlisis excesiva: el cido clorhdrico es un cido fuerte, si se prolonga excesivamente el tiempo de hidrlisis se puede disgregar la molcula de ADN en su totalidad, impidiendo as su posterior deteccin. Por ello el aspecto ms importante de la tcnica es el tiempo de hidrlisis, que varia mucho segn el fijador utilizado. 2. Envejecimiento del reactivo de Schiff: en condiciones normales es incoloro, la aparicin de una tonalidad rosada indica envejecimiento y por tanto debe desecharse, puesto que el envejecimiento lo hace inservible para detectar los grupos carbonilos.

3. METODOS PARA LA IDENTIFICACION Y TINCION DE PIGMENTOS E IONES METLICOS. 3.1 MTODOS PARA DETECTAR IONES TCNICOS. TCNICAS DEL AZUL DE PERLS. En el interior de los tejidos el hierro se puede depositar de 2 formas: 1. En forma inica, o formando sales ferrosas y ferricas, por lo general en forma de cloruros o hidrxidos. 2. Como hierro ligado a protenas. La tcnica del azul de Perls es la de mayor importancia para detectar hierro, ya que el hierro ferrico es el ms frecuente en los tejidos. El fundamento de esta tcnica se basa en la propiedad que tiene el ferrocianuro potasico, para transformarse en presencia de hierro frrico en ferrocianuro ferrico, o azul de Prusia por accin del cido clorhdrico que acta como desencadenante de la reaccin. CL3Fe Ferrocianuro potsico + HCL Ferrocianuro frrico.

TCNICA. Fijacin: cualquier fijador es vlido. Se pueden utilizar secciones en parafina o improntas. Soluciones: 1. Ferrocianuro K al 10 % (conservar en nevera).

2. cido clorhdrico : - cido clorhdrico concentrado. 2 ml. - Agua destilada...... 98 ml. 3. Solucin de ferrocianuro K, cido clorhdrico: mezclando a partes iguales la solucin 1 y 2. esto se debe preparar inmediatamente antes de su uso. 1. 2. 3. 4. 5. Procedimiento Tcnico: Desparafinar e hidratar. Tratar con la mezcla de ferrocianuro K, cido clorhdrico 10 min. Lavar con agua destilada (el Fe se ve azul). Se puede contrastar con una solucin rojo nuclear al 1 %.. 2 3 min. Deshidratar, aclarar y montar.

Resultados: - Hierro frrico: azul. - Ncleos: rojo. Observaciones: El tiempo de tincin depende de la cantidad de hierro existente en los tejidos. Siempre deben utilizarse preparaciones positivas de control. Si al echar la disolucin 3 en la porta toma color verde debemos desecharla, enjuagar y poner reactivo nuevo. 3.2. METODOS PARA LA DETERMINACIN DE CALCIO. TECNICA DE VON KOSSA. Las sales de calcio estn presentes normalmente en los huesos, dientes y sangre aunque en ocasiones tambin aparecen reas de calcificacin en tejidos desprovistos de ellas. En general las sales que con mayor frecuencia se depositan son carbonatos, oxalatos y fosfatos. TCNICA Fijacin: formol al 4 % preferiblemente y utilizar secciones en parafina.

Soluciones: 1. Solucin acuosa de nitrato de plata al 1 %. 2. Solucin de tiosulfato sdico al 2,5 %. 3. Rojo neutro al 1 %. Procedimiento tcnico: 1. Desparafinar e hidratar. 2. Tratar con la solucin de nitrato de plata a plena luz.. 30 60 min.

3. 4. 5. 6. 7.

Lavar con agua destilada. Lavar en la solucin de tiosulfato.. 5 min. Volvemos a lavar con agua destilada. Contrastar con el rojo neutro. 2 3 min. Deshidratar, aclarar y montar. Resultados: - Iones calcio o calcificacin: negro. - Ncleos: rojo.

3.3 METODOS PARA RUBENICO.

LA

DETERMINACION

DE

COBRE.

TCNICA

CIDO

Este metal se encuentra presente de forma casi exclusiva en el hgado y otros rganos de pacientes con enfermedad de Wilson. En ocasiones se encuentra presente en algunas cirrosis hepticas aunque en muy pequea proporcin. TCNICA Fijacin: cualquier fijador es vlido. Se deben utilizar secciones en parafina o en congelacin. Soluciones: 1. Solucin madre de cido rubenico al 0,1 %. 2. Solucin de acetato sdico al 10 %. 3. Solucin de trabajo: - De la solucin 1: por cada 2.5 ml se echan de la solucin 2, 50 ml Procedimiento Tcnico: Desparafinar e hidratar. Tratar con solucin de trabajo a 37 durante toda la noche en un recipiente tapado hermticamente. tratar los cortes con alcohol etlico al 70 % 15 min. Alcohol etlico absoluto.. 6 horas. Aclarar con xileno y montar. Resultados: - Depsitos de Cobre: con granulaciones de verde a negras.

1. 2. 3. 4. 5.