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ANALYSE

BACTERIOLOGIQUE
DES PRODUITS
ALIMENTAIRES
La prise d’essai:
A - cas de produit solide(exemple:
fromage).
B -cas de produit liquide(exemple:
lait pasteurisé).
Références
• Norme NF EN ISO 6887-1 relative à la suspension
mère et dilutions décimales;1.règle générale.
• Norme NF V- 057- 2 Microbiologie alimentaire -
Directives générales pour la préparation des
dilutions en vue de l’examen microbiologique.
• Norme XP V 08 – 102 relative aux règles générales
pour le comptage des colonies et l’expression des
résultats.
• Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions
générales concernant la compétence des
laboratoires d’étalonnage et d’essais.
A- Cas de produit solide.
Peser dans un sachet La 1ère pesée servira au
stérile 3× 25 gr du contrôle bactériologique.
produit à analyser La seconde servira à la
aseptiquement. recherche des Salmonella.

25 gr
La troisième servira à la
recherche de Listéria.

BALANCE
La prise d’essai pour une analyse
bactériologique classique:
Verser le TSE dans le sachet stérile contenant 25 gr de produit
à analyser.
Broyer l’aliment 6 à 8 minutes.
Verser le contenu dans le flacon de TSE.

BROYEUR TSE
DE TYPE 225
ml
STOMACHER
(suspension mère)
10ˉ¹
La prise d’essai pour la recherche
des Salmonella et des Listéria.
Verser l’Eau Peptonée Tamponnée(Salmonella) et le bouillon
Fraser(Listéria) dans le sachet stérile contenant 25 gr de produit
à analyser.
Broyer l’aliment 6 à 8 minutes.
Verser le contenu dans les flacons respectives.

BROYEUR
225 225
DE TYPE ml ml
Eau Peptonée Bouillon
STOMACHER tamponnée Fraser
B – Cas de produit liquide:
Faire un mélanger de 3 à 5 unités
du produit à analyser.

Lait
pasteurisé Lait
pasteurisé
Lait
pasteurisé Lait
Lait pasteurisé
pasteurisé

+1
Suspension mère
La prise d’essai pour les recherches
des Salmonella et des Listéria.
Prélever
25 ml 25 ml
2×25 ml de la 5
ml

Suspension
mère.

+1 FRASER
Eau
peptonnée

tamponnée

Listéria Salmonella
PREPARATION
DES DILUTIONS
DECIMALES
a - cas de produit solide.
b - cas de produit liquide.
a - Cas de produit solide:
Introduire 1 ml de la suspension 10ˉ¹ dans 9 ml de TSE.
Mélanger,puis prélever 1 ml de la dilution 10ˉ² et
l’introduire ensuite dans 9 ml de TSE.
1 ml 1 ml
1 ml

10ˉ² 9 ml de TSE 10ˉ³

10ˉ¹
Suspension
mère
b - Cas de produit liquide:
Introduire 1 ml de la suspension +1 dans 9 ml de TSE.
Mélanger,puis prélever 1 ml de la dilution 10ˉ¹ et l’introduire ensuite dans
9 ml de TSE,mélanger, puis prélever 1 ml de la dilution 10ˉ² et
l’introduire ensuite dans 9 ml de TSE pour obtenir la dilution 10³.

1 ml 1 ml 1 ml

1 ml 9 ml de TSE 9 ml de TSE
10ˉ³
10ˉ¹ 10ˉ²

+1
suspension
Solution
mère mère AZIZI-IPA-2004
PARAMETRES RECHERCHES
• Recherche et dénombrement des microorganismes totaux
(Flore mésophile).
• Recherche et dénombrement des levures et moisissures.
• Recherche et dénombrement des Coliformes, Coliformes
thermo tolérants et EscherichiaColi.
• Recherche et dénombrement des Anaérobies Sulfito –
Réducteurs à 46°C.
• Recherche et dénombrement de Clostridium Perfringens à
37°C.
• Recherche et dénombrement des Staphylococcus aureus.
• Recherche des salmonelles.
• Recherche de Listéria.
RECHERCHE ET
DENOMREMENT DES
MICROORGANISMES PAR
COMPTAGE DES COLONIES
OBTENUES A 30 °C, DANS LES
LAITS ET PRODUITS
LAITIERS.
Milieu utilisé:
Gélose PCA
Références
• Norme NF 08 – 051 relative au dénombrement des micro–
organismes – méthode par comptage des colonies obtenues à
30°C.
• Norme XP V 08 – 102 relative aux règles générales pour le
comptage des colonies et l’expression des résultats.
• Norme NF V 08 – 002:Microbiologie alimentaire – Directives
générales pour les examens microbiologiques.
• Norme NF V- 057- 2 Microbiologie alimentaire - Directives
générales pour la préparation des dilutions en vue de l’examen
microbiologique.
• Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions générales
concernant la compétence des laboratoires d’étalonnage et
d’essais.
Inoculer les boites de pétri avec 1 ml
des différentes dilutions.

1 1 1
ml ml ml

1 ml 1 ml 1 ml

10ˉ¹ 10ˉ² 10ˉ³


Couler la gélose PCA ≈ 15 ml
refroidie ≈ 45°C.
Mélanger et laisser solidifier.

PCA PCA

10ˉ¹ 10ˉ² 10ˉ³


Couler une deuxième
couche de gélose blanche ≈ 5 ml.
Laisser solidifier.
GELOSE GELOSE
BLANCHE BLANCHE

10ˉ¹ 10ˉ² 10ˉ³


Incuber les boites couvercle en bas
72 ±3h à 30°C.

Incuber 72h à 30°C


RECHERCHE ET DENOMREMENT DES
MICROORGANISMES PAR COMPTAGE
DES COLONIES OBTENUES A 30 °C,
DANS LES LAITS ET PRODUITS
LAITIERS.

1ère Lecture après 24h


d’incubation
Dénombrer les colonies de formes lenticulaires
qui poussent en masse et noter les dilutions
correspondantes.
Tenir compte des boites ayant un nombre
compris entre 15 et 300.

Germes totaux Germes totaux


RECHERCHE ET DENOMREMENT DES
MICROORGANISMES PAR COMPTAGE
DES COLONIES OBTENUES A 30 °C,
DANS LES LAITS ET PRODUITS
LAITIERS.

2ème Lecture après 48h


d’incubation
Dénombrer les colonies de formes lenticulaires
qui poussent en masse et noter les dilutions
correspondantes.
Tenir compte des boites ayant un nombre
compris entre 15 et 300.

Germes totaux Germes totaux


RECHERCHE ET DENOMREMENT DES
MICROORGANISMES PAR COMPTAGE
DES COLONIES OBTENUES A 30 °C,
DANS LES LAITS ET PRODUITS
LAITIERS.

3ème Lecture après 72h


d’incubation
Dénombrer les colonies de formes lenticulaires
qui poussent en masse et noter les dilutions
correspondantes.
Tenir compte des boites ayant un nombre
compris entre 15 et 300.

Germes totaux Germes totaux


Lecture et interprétation:
Retenir 2 dilutions successives ( plus
fortes dilutions) oū le nombre de colonies
dénombrées soit : 15 ≤ c ≤ 300.
Appliquer cette formule:
∑c
N 1,1 x d
∑c : c + c (c = nombre de
1 ère 2 1
colonies de la 1 dilution et c = nombre
2
de colonies de la 2ème dilution ).
d : le taux de dilution de la 1ère boite
retenue.

N = nombre de
micro-organismes /gr ou ml
RECHERCHE ET
DENOMBREMENT DES
COLIFORMES,COLIFORMES
THERMOTOLERANTS ET
ESCERICHIA COLI DANS LES
LAITS ET PRODUITS LAITIERS.

A- En milieu liquide.
(VBL + Cloche)
a- Test de présomption.
Références
• Norme NF ISO 4831 relative au dénombrement des
coliformes – technique du nombre le plus probable
après incubation à 30°C.
• Norme NF V 08 - 050 relative au dénombrement des
coliformes – méthode par comptage des colonies
obtenues à 30°C.
• Norme NF V 08 – 017 relative au dénombrement des
coliformes fécaux et d’Escherichia coli (annexe à NF
V 08 – 015 et NF V 08 -016).
• Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions
générales concernant la compétence des
laboratoires d’étalonnage et d’essais.
Introduire 1ml des différentes dilutions dans chaque tube.
Chasser le gaz présent dans les cloches avant l’incubation.

1 ml 1 ml 1 ml

10ˉ¹ 10ˉ¹ 10ˉ¹ 10ˉ² 10ˉ² 10ˉ² 10ˉ³ 10ˉ³ 10ˉ³

VBL VBL VBL VBL VBL VBL VBL VBL VBL

Incuber 24 - 48h à 37°C


Lecture des coliformes totaux
à 37°C:
Aspect d’ un tube de milieu VBL + cloche positif.

Acidification
du
milieu
Gaz +
Noter le nombre de tubes positifs à
37°C et se référer à la table de NPP.

10ˉ¹ 10ˉ¹ 10ˉ¹ 10ˉ² 10ˉ² 10ˉ² 10ˉ³ 10ˉ³ 10ˉ³

VBL VBL VBL VBL VBL VBL VBL VBL VBL

++ + + ++ +
2 2 3
RECHERCHE ET
DENOMBREMENT DES
COLIFORMES
THERMO TOLERANTS
ET ESCHERICHIA COLI DANS
LES LAITS ET PRODUITS
LAITIERS.

b- Test de confirmation:
Repiquer chaque tube de milieu VBL + sur un
autre tube de VBL et un tube d’Eau Peptonée
Exempt d’Indole.
2 gouttes 2 gouttes

VBL
Eau Peptonée
Exempt
D’Indole VBL
Chasser le gaz présent dans la cloche
avant l’incubation.
Incuber 24h à 44°C.

Eau Peptonée
VBL Exempt
D’Indole
-voir acidification du milieu VBL et le dégagement de gaz dans la
cloche.
-Ajouter le milieu Kovacs au tube d’Eau Peptonée Exempt d’Indole
et voir la formation d’un anneau rouge.

Anneau
2 gouttes rouge
Gaz +
de Kovacs Eau Peptonée
Exempt
D’Indole
VBL Acidification
du milieu
Noter le nombre de tubes positifs
pour chaque série de dilutions et se
référer à la table de NPP.

10ˉ¹ 10ˉ¹ 10ˉ¹ 10ˉ¹ 10ˉ¹ 10ˉ¹ 10ˉ²10ˉ² 10ˉ² 10ˉ² 10ˉ² 10ˉ² 10ˉ³ 10ˉ³10ˉ³ 10ˉ³ 10ˉ³ 10ˉ³

EAU EAU EAU EAU EAU EAU EAU EAU EAU


PEPTO- PEPTO- PEPTO- PEPTO- PEPTO- PEPTO- PEPTO- PEPTO- PEPTO-
NEE NEE NEE NEE NEE NEE NEE NEE NEE

VBL VBL VBL VBL VBL VBL VBL VBL VBL

+ + + + +
2 1 2
RECHERCHE ET
DENOMBREMENT DES
COLIFORMES,COLIFORMES
THERMOTOLERANTS DANS
LES LAITS ET PRODUITS
LAITIERS.

B – En milieu solide :
Désoxycholate 1 ‰.
Inoculer les 2 séries de boites avec
1 ml des différentes dilutions.
1ml 1ml 1ml
1 ml 1 ml 1 ml

10ˉ¹ 10ˉ² 10ˉ³

10ˉ¹ 10ˉ² 10ˉ³


Couler une couche de gélose de
désoxycholatee 1‰ ≈ 15 ml, refroidie
à la température ≈ 45±1 °C.
Mélanger et laisser solidifier.
DESOXY- DESOXY-
Cholate Cholate
1‰ 1‰
Incuber une série de boites 24-48 h à 37°C
pour la recherche des coliformes totaux.
Incuber l’autre série à 44 °C pour la recherche
des coliformes thermo tolérants et Escherichia
coli.

24-48h à 37°C 24-48h à 37°C 24-48h à 37°C

24-48h à 44°C 24-48h à 44°C 24-48h à 44°C


Test de confirmation
en milieu solide:

1 – Dénombrement des coliformes


totaux à 37°C.
2 - Dénombrement des coliformes
Thermo tolérants et Escherichia coli
à 44 °C.
Dénombrer les colonies fluorescentes qui
poussent en masse , noter les dilutions et les
températures correspondantes.
Tenir compte des boites ayant un nombre
compris entre 15 et 300.

Colonies fluorescentes Colonies fluorescentes


Lecture et interprétation:
Retenir 2 dilutions successives ( plus
fortes dilutions) oū le nombre de colonies
dénombrées soit : 15 ≤ c ≤ 300.
Appliquer cette formule:
∑c
N 1,1 x d
∑c : c + c (c = nombre de
1 ère 2 1
colonies de la 1 dilution et c = nombre
2
de colonies de la 2ème dilution ).
d : le taux de dilution de la 1ère boite
retenue.

N = nombre de
coliformes /gr ou ml
RECHERCHE DES
STREPTOCOQUES FECAUX
DANS LES LAITS CRUS ET
EN POUDRE

A - Test de présomption:
en milieu Rothe
Ensemencer la série de tubes du milieu
Rothe simple concentration.
Incuber les tubes 18- 24h à 37°C.
1 ml 1 ml 1 ml

ROTHE ROTHE ROTHE ROTHE ROTHE ROTHE ROTHE ROTHE ROTHE


S/C S/C S/C S/C S/C S/C S/C S/C S/C

Dilution 10ˉ¹ Dilution 10ˉ² Dilution 10ˉ³


RECHERCHE DES
STREPTOCOQUES FECAUX
DANS LES LAITS CRUS ET
EN POUDRE

B - Test de confirmation:
en milieu Eva Litsky
Repiquer 1 à 2 gouttes du milieu
Rothe sur le milieu Eva Litsky.
1 à 2 gouttes

Trouble
+
microbien

EVA
Rothe Litsky
s/c

Incuber à 37°c pendant 24h


LECTURE DU MILEU EVA LITSKY

Voir trouble microbien et un


dépôt au fond du tube

Pastille violette
ou blanchâtre
Noter le nombre de tubes positifs
pour chaque série de dilutions et se
référer à la table de NPP.

10ˉ¹ 10ˉ¹ 10ˉ¹ 10ˉ² 10ˉ² 10ˉ² 10ˉ³ 10ˉ³ 10ˉ³

EVA EVA EVA EVA EVA EVA EVA EVA EVA


LITSKY LITSKY LITSKY LITSKY LITSKY LITSKY LITSKY LITSKY LITSKY

+ + + + + +
3 1 2
RECHERCHE DES
SALMONELLA
DANS LES LAITS
ET PRODUITS LAITIERS
Références
• Norme NF V 08 6- 052 relative à la méthode
de routine pour la recherche des Salmonella.
• Norme EN 12824 relative à la recherche des
Salmonella.
• Norme NF ISO 17025 relative aux
prescriptions générales concernant la
compétence des laboratoires d’étalonnage et
d’essais.
A - Cas de produit solide:
Verser l’Eau Peptonée Tamponnée dans le sachet stérile
contenant 25 gr de produit.
Broyer l’aliment.
Verser le contenu dans le flacon d’E.P.Tamponnée.

Eau

BROYEUR peptonnée

tamponnée
DE TYPE
STOMACHER flacon
de
225 ml
B - Cas de produit liquide.

25 ml
1
ml Introduire dans
Prélever 225 ml d’Eau
25 ml de la Peptonée Tamponnée
Suspension
mère
Eau
(+1) peptonnée

tamponnée

+1
Étape de pré enrichissement:
Incuber la solution ensemencée
d’Eau Peptonée Tamponnée
16-20h à 37°C.

Eau
peptonnée
tamponnée

INCUBER 16- 20h à 37°C


Étape d’enrichissement:
Ensemencer les bouillons de Rappaport Vassiliadis et
de sélénite à partir de la solution pré enrichie.

0,1 ml 2 ml

Bouillon Bouillon
Rappaport sélénite
Vassiliadis RAPPA-
PORT
SFB
S/C

Eau
peptonnée
Incuber 18- 24h à 42°C tamponnée Incuber 18- 24h à 37°C

Solution pré enrichie


Étape d’isolement:

Milieux utilisés:
Gélose Hektoen
Gélose au Vert
Brillant et au Rouge
de Phénol.
Isoler par des stries :
a- Ensemencer une boite de gélose
Hektoen à partir du tube SFB.
b- Ensemencer une boite de gélose
au Vert Brillant et au rouge de phénol
à partir du tube de Rappaport Vassiliadis.

Anse de platine

SFB RAPPA-
PORT
S/C

37°C 42°C
Incuber 24h à 37°C
Repiquer 5 colonies typiques de
Salmonella sur le milieu TSI.
Colonies ayant un contour régulier.
Colonies ayant la couleur du milieu ,parfois
avec ou sans centre noir sur la gélose Hektoen.
Colonies de couleur rose sur la gélose V.BR.RP

. .
.
Repiquer 5 colonies typiques de
Salmonella sur le milieu TSI.

Stries
Anse de platine

faire une
Isoler par
piqûre centrale.
des stries

Incuber 24h à 37°C


Aspect d’un TSI de Salmonella.

H2S + H2S
TSI TSI Gaz TSI Gaz +
H2S + Pente Pente Pente
Gaz + Rouge Rouge Rouge

Culot Culot Culot


Noir Jaune Jaune

Autres Salmonella S.Typhi S.Paratyphi A


Ensemencer une mini - galerie
biochimique.
CITRATE
DE
ONPG SIMMONS

UREE . GN

TEMOIN LDC
Lecture de la mini - galerie
biochimique.
CITRATE
ONPG - DE +
Pas de ONPG UREE TEMOIN LDC GN CITRATE
SIMMONS
virage.
. GN

UREE -
Pas de
virage.
TEMOIN LDC +
Lecture de l’indole et de la TDA.

1 goutte
UREE de réactif
TDA

2 gouttes
de réactif Pas de Pas de
KOVACS formation virage.
d’anneau
rouge.

INDOLE - TDA -
RECHERCHE ET
DENOMBREMENT DE
STAPHYLOCOCCUS AUREUS
DANS LES LAITS ET
PRODUITS LAITIERS.

Milieu utilisé:
Gélose Baird Parker
Références
• Norme NF ISO 6888 - 1 relative au dénombrement des
Staphylocoques à coagulase positive(S.aureus et autres
espèces) – Partie 1: technique utilisant le milieu gélosé de
Baird Parker.
• Norme NF V 08 – 057 – 1 relative au dénombrement des
Staphylocoques à coagulase positive par comptage des
colonies à 37°C – 1: technique avec confirmation des colonies.
• Norme NF V 08 – 057 –2 relative au dénombrement des
Staphylocoques à coagulase positive par comptage des
colonies à 37°C –2: technique sans confirmation des colonies.
• Norme NF ISO 6888 -2 relative au dénombrement des
Staphylocoques à coagulase positive(S.aureus et autres
espèces) – Partie 1: technique utilisant le milieu gélosé au
plasma de lapin et au fibrinogène.
• Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions générales
concernant la compétence des laboratoires d’étalonnage et
d’essais.
Préparation du milieu Baird Parker:
Ajouter au milieu de base Baird Parker
15 ml de la solution jaune d’œuf
au tellurite de potassium.
15 ml

MILIEU
de
JAUNE
D’OEUF Gélose
au BAIRD
TELLERUTE
de
POTASSIUM PARKER

Couler la gélose dans des boites de pétri


et conserver à +4°C.
Inoculer les boites avec 0,1 ml
des différentes dilutions.
1 1 1
ml ml ml

0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml

10ˉ¹ 10ˉ² 10ˉ³


Étaler les gouttes à l’aide
d’une pipette râteau.

10ˉ¹ 10ˉ² 10ˉ³


Incuber les boites de Baird Parker
couvercle en haut 48h ±2 à 37°C.

Incuber 48h ±2 à 37°C


1ére lecture 24h ±2
Dénombrer les colonies caractéristiques
et non caractéristiques et noter les
dilutions correspondantes.
Colonies Colonies non
caractéristiques caractéristiques

15 ≤ X ≥ 150 pour 2 dilutions successives.


Recherche de la catalase puis de
la coagulase.
COAGULASE

CATALASE
Réaction de la catalase:
Pipette Pasteur.
Déposer 1
goutte d’H2O2
20V.
Déposer une
partie de la
colonie. .

Apparition de bulles d’air.

Observation à l’oeil nu ou
au microscope.
Réaction de la coagulase:
a- ensemencer un bouillon cœur cervelle.

BOUILLON
COEUR
CERVELLE

Incuber 20-24h à 37°C


b- recherche de la coagulase libre:
0,1 ml

Plasma de
BOUILLON
COEUR
CERVELLE lapin

0,3 ml

Incuber 24h à 37°C


1ére lecture après 6h d’incubation.
Le coagulum occupe + des ¾ du volume du
liquide initial.

Plasma de
lapin coagulé

Réaction +
Lecture et interprétation:
c c nc nc
a =b x c + b x c
FORMULE :a c + nc
AAAAAAAAAAA
• Ac = nombre de colonies caractéristiques
repiquées.
• Anc = nombre de colonies non caractéristiques
repiquées.
• bc = nombre de colonies caractéristiques
repiquées à coagulase +.
• b nc = nombre de colonies non caractéristiques
repiquées à coagulase +.
• cc = nombre total de colonies caractéristiques
par boite.
• c nc =nombre total de colonies non caracté-
• ristiques par boite.
Lecture et interprétation.
15≤ a ≤150
Calcul du nombre de
staphylocoques aureus:
formule: N= ∑a
N=
1,1 x d
∑ a = a1 + a 2 (a 1 = nombre de
staphylocoques à coagulase +
de la 1ère dilution retenue et a 2 =
nombre de staphylocoques à
coagulase + de la 2ème dilution
retenue.
Lecture et interprétation.

Calcul du nombre de
staphylocoques aureus:
formule: N = ∑
N=
F . V . 1,1
F = le taux de la 1ère dilution
retenue.
V = le volume inoculé.
N = nombre de staphylo-
coques / gr ou ml.
Exemple: c c nc nc
A=b
a= x c + b x c
c nc
AAAAAAAAAA
c c
A = 3; b = 2; c =56 10ˉ²
2 x 56 112
a= = = 37
3 3
c c
A = 3; b = 3; c = 3 10ˉ³
3x3
a= = 3
3
∑a 37 + 3 4
N= = = 363x100 = 3,6.10
1,1xVxF Staph./gr ou ml
1,1x0,1x0,01
RECHERCHE ET
DENOMBREMENT DES
ANAEROBIES SULFITO-
REDUCTEURS A 46°C DANS
LES LAITS ET PRODUITS
LAITIERS.

Milieu utilisé:
Tryptone Sulfite Cyclosérine
Références
• Norme XP V 08 – 061 relative au dénombrement en
anaérobiose des bactéries Sulfito – Réductrices par
comptage des colonies à 46 °C. Méthode de routine.
• Norme V 08- 056 relative au dénombrement des
Clostidium perfringens par comptage des colonies .
• Norme NF V 08 – 019 relative au dénombrement des
Clostidium perfringens par comptage des colonies .
• Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions
générales concernant la compétence des
laboratoires d’étalonnage et d’essais.
Régénérer le milieu de TSC
15’ à +100°C.

100°C
Prélever 1 ml de la dilution 10ˉ¹, l’introduire
dans le tube de TSC régénéré additionné
d’antibiotiques et refroidi à la T° ≈ 47 ±2°C.
1 ml 0,2 ml

D-
Cyclosérine

TSC 4%

TSE
225
ml

Gélose TSC régénérée


Mélanger doucement par retournement.
Laisser solidifier.
Incuber le tube 20h à 46° ±2°C.

TSC

Incuber 20h à 46 ±2°C


Dénombrer les colonies caractéristiques
de couleurs noires
et de 5 mm de diamètre.

ASR

colonie
Lecture et interprétation.
C=nombre de 15≤C≤30
colonies. 2 tubes retenus.
1) Formule: N = ∑ C
N= /gr ou ml
1,1 x d
1 ère
dilution retenue.

15≤C≤30
2) Solution mère ensemencée.

D=taux de c
dilution de la N= /gr ou ml
suspension D
mère.
Lecture et interprétation.
3) 1≤C≤15 c
Formule: Ne = /gr ou ml
D

4) C = 0
Formule: 1
N = moins de /gr ou ml
D
RECHERCHE ET
DENOMBREMENT DE
CLOSTRIDIUM PERFRINGENS
PAR COMPTAGE DES COLONIES
A 37 °C DANS LES LAITS
ET PRODUITS LAITIERS

Milieu utilisée:
Tryptone Sulfite Cyclosérine
Références
• Norme XP V 08 – 061 relative au dénombrement en
anaérobiose des bactéries Sulfito – Réductrices par
comptage des colonies à 46 °C. Méthode de routine.
• Norme V 08- 056 relative au dénombrement des
Clostidium perfringens par comptage des colonies .
• Norme NF V 08 – 019 relative au dénombrement des
Clostidium perfringens par comptage des colonies .
• Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions
générales concernant la compétence des
laboratoires d’étalonnage et d’essais.
Inoculer les boites de pétri avec 1 ml
des différentes dilutions.

1
ml 1 1 1
ml ml ml
1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

10ˉ¹ 10ˉ² 10ˉ³ 10ˉ4


Couler la gélose TSC ≈ 15 ml.
Mélanger et laisser solidifier.

TSC TSC

10ˉ¹ 10ˉ² 10ˉ³ 10ˉ 4


Couler une deuxième couche de gélose
TSC ≈ 10 ml, refroidie ≈ 47 ±2°C.
Laisser solidifier.

TSC TSC

10ˉ¹ 10ˉ² 10ˉ³ 10ˉ 4


Incuber 20 ±2h à 37°C dans une
atmosphère riche en CO 2 .

Jarre
Dénombrer les colonies noires
caractéristiques qui poussent en
profondeur.
Ensemencer de 1 à 3 colonies suspectes
sur le bouillon Thioglycolate.

Couche de
paraffine
BOUILLON
THIO -
glycolate

Incuber 20 ± 2h en
anaérobiose à 37°C
Repiquer 5 gouttes sur le bouillon Lactose
Sulfite + cloche à partir du bouillon
Thioglycolate.
2 gouttes

LACTOSE
SULFITE

BOUILLON
THIO -
glycolate

Incuber 24 ± 2h en
anaérobiose
Voir un dégagement de gaz dans la
cloche et un précipité noir
au fond du tube.

Gaz Dépôt noir


LACTOSE
SULFITE
Lecture et interprétation.
b x c
Formule: a =
A
b : Nombre de colonies caractéristiques +

c : Nombre total de colonies caractéristiques


sur la boite.

A : Nombre de colonies caractéristiques


repiqués.
a : Nombre de Clostridium Perfringens identifiés.
Lecture et interprétation.
∑a
N = /gr ou ml
1,1 d

∑a = La somme des colonies +.


d : Le taux de dilution de la 1ère dilution
retenue.
NB: retenir 2 boites de dilutions successives
contenant entre 15 et 150 colonies caractéristiques.
RECHERCHE ET
DENOMBREMENT DES
LEVURES ET MOISISSURES
DANS LES LAITS ET
PRODUITS LAITIERS.

Milieu utilisé:
Sabouraud au Chloramphénicol
Références
• Norme XP V 08 – 059 relative au
dénombrement des levures et moisissures
par comptage des colonies à 25 °C.
• Norme NF ISO 7954 relative au
dénombrement des levures et moisissures
par comptage des colonies à 25 °C.
• Norme NF ISO 17025 relative aux
prescriptions générales concernant la
compétence des laboratoires d’étalonnage et
d’essais.
Ensemencer les boites comme l’indique le schéma.
1
ml

1 0,2 ml 1 1
ml ml
0,2 ml ml 0,2 ml 0,2 ml
TEMOIN TEMOIN
DILUANT MILIEU

10ˉ¹ 10ˉ² 10ˉ³

Ne pas ensemencer la boite témoin


Étaler les gouttes à l’aide
d’une pipette râteau.

Témoin diluant

10ˉ¹ 10ˉ² 10ˉ³


Incuber les boites de Sabouraud au
Chloramphénicol couvercle en haut
5 jours à 25°C.

Incuber 5 jours à 25°C


Lecture tous les jours.
Dénombrer les levures et moisissures et
noter la dilution correspondante.

LEVURES MOISISSURES
Lecture et interprétation.
C x 5
Formule : n =
1 d
n 1 = Nombre de levures ou moisissures

par dilution.
Calculer de la même manière n et n
2 3
pour les dilutions correspondantes.
n1 + n2 + n3
N = / gr ou ml
3
C: nombre de colonies par boite.
N:nombre de levures et de moisissures /gr ou ml.
RECHERCHE DES
LISTERIA
DANS LES LAITS ET
PRODUITS LAITIERS.
La prise d’essai pour la recherche
de Listéria.
a - cas de produit solide:
Verser le bouillon Fraser dans le sachet stérile contenant 25 gr de
produit à analyser.
Broyer l’aliment 6 à 8 minutes.
Verser le contenu dans le flacon.

BROYEUR
225
DE TYPE ml

STOMACHER Fraser
Bouillon ½
b – cas de produit liquide:

Prélever 25 ml
5
25 ml de la
ml

Solution mère.

+1 FRASER

½
Listéria
PREPARATION DU BOUILLON
FRASER ½.
a – Reconstituer le supplement Fraser ½:
11.25 ml 11.25 ml

SUPPLEMENT
EAU
FRASER DISTILLEE
ETHANOL
½ STERILE

Acriflavine+Acide nalidixique+citrate de fer ammoniacal


b- additionner le supplément.

0,1ml
2.25 ml

SUPPLEMENT BOUILLON
FRASER FRASER BOUILLON

½
FRASER

½
PREPARATION DE LA
GELOSE PALCAM.

5 ml 2,25 ml

EAU Supplément

DISTILLEE
PALCAM
STERILE
Gélose
PALCAM

Sulfate de polymyxine B + Ceftazine + Acriflavine


1ère étape:
Enrichissement primaire.
Incuber le bouillon ensemencé
FRASER ½
18-24h à 30°C.

BOUILLON
FRASER
½

INCUBER 18-24h à 30°C


2ème étape: Enrichissement secondaire
sur milieu Fraser ½ en tube.
1er Isolement sur gélose
0,1ml Palcam.

BOUILLON
FRASER BOUILLON
FRASER
½
Enrichissement I
Incuber 24h à 37°C Incuber 24-48h à 37°C
FRASER PALCAM 1
3ème étape:
2ème isolement sur la gélose Palcam.
Lecture de la boite Palcam 1.

BOUILLON
FRASER
½

Incuber 24-48h à 37°C


PALCAM 1 PALCAM 2
Colonies caractéristiques de
Listéria sur la gélose Palcam.
Identification du genre Listéria:
Coloration de gram.
Catalase.

Bacilles gram + Catalase +


Identification de l’espèce:
ensemencer une galerie biochimique.
• Mobilité.
• Oxydase.
• Nitrate réductase.
• Urée.
• Indole.
• TDA.
• VP.
• RM.
• ESCULINE.
• VF : voir type respiratoire (aéro-anaérobie facultatif).
• TSI : (voir glucose + H2S).
ENSEMENCER UNE GALERIE BIOCHIMIQUE.

Esculine VF

Mannitol Clark
Mobilité
Bouillon
Nitrate
et
Lubs
Urée TSI

Incuber 24h à 37°C.


Lecture de la galerie biochimique.
Mobilité +

Nitrate – Esculine
Glucose +

H2S –
Mannitol Clark Clark
Mobilité
Bouillon
Nitrate
et Urée TSI et
Lubs
Gaz-
Lubs

Esculine +

Urée –

Indole-

TDA –

VP +

RM +