MTODOS DE FIJACIN Existen diferentes formas de fijar los tejidos, dependiendo del tipo de fijador, de la estructura a fijar y de lo queramos

observar. Los mtodos de fijacin se pueden clasificar en dos tipos: fsicos y qumicos. Los fijadores fsicos estn basados en una congelacin muy rpida del tejido, en la aplicacin de calor o microondas. Se utilizan cuando el tipo de muestra lo requiere, cuando los fijadores qumicos alteran la estructuras que queremos observar, o cuando necesitamos una fijacin muy rpida. La congelacin rpida es un buen mtodo de preservacin de las caratersticas moleculares y es conveniente que sea rpida puesto que as se impide la formacin de grandes cristales de hielo que nos destrozaran la estructura del tejido. Existen variantes de esta tcnica como son la criodesecacin o liofilizacin y la criosustitucin. La criodesecacin parte de tejido previamente congelado, pero posteriormente se realiza una sublimacin del hielo, es decir, el agua pasa de estado slido a gaseoso sin pasar por estado lquido. Al eliminar el agua se impide que se den reacciones qumicas por lo que adems de la fijacin preserva el tejido en el tiempo. La criosustitucin tambin parte de tejido congelado pero en este caso se produce una sustitucin lenta del hielo por una solucin fijadora. Con ello se posibilita una fijacin qumica sobre un material que no ha sufrido deterioro puesto que est congelado. Los mtodos de fijacin por calor de fijacin no son frecuentemente usados, excepto para observar microorganismos. Los mtodos qumicos utilizan soluciones acuosas compuestas por molculas fijadoras que establecen puentes entre las molculas celulares, mantenindolas en sus lugares originales e impidiendo su degradacin. Hay dos mtodos de fijacin con fijadores lquidos: inmersin y perfusin. En cualquier caso el fijador debe entrar en contacto con el tejido lo ms rpidamente posible. Inmersin. Por el mtodo de inmersin las piezas de tejido se sumergen en la solucin fijadora. Tenemos que tener en cuenta algunas precauciones. 1) Las piezas de tejido no deberan superar los 0.5 cm de espesor para que el fijador alcance el interior de la pieza antes de que sta comience a deteriorarse. Esto depende de la velocidad de penetracin del fijador y de las caractersticas del tejido, por ejemplo, si tiene cavidades por donde penetre la solucin fijadora. Fijacin por inmersin. 2) El volumen recomendado de fijador debe ser 20 veces superior al volumen de la pieza. 3) La osmolaridad entre tejido y solucin fijadora deben estar equilibradas. 4) El pH del fijador debe ser prximo al fisiolgico. 5) El tiempo de fijacin depende de cada tipo de fijador, pero generalmente existe un tiempo mximo para cada uno de ellos que no debe ser excedido.

Fijacin por perfusin de un rgano. Mediante perfusin se consigue que la solucin fijadora llegue a todas las clulas del rgano a travs del sistema sanguneo. Mediante una bomba peristltica se introduce la solucin fijadora a travs de la arteria que irriga el rgano. Se obturan todos aquellos vasos arteriales que no conducen al rgano. Perfusin. Por este procedimiento la solucin fijadora se introduce a travs del sistema circulatorio mediante el cual accede a todas las clulas del tejido gracias a la red de capilares. Mediante este mtodo se puede fijar un animal completo introduciendo la solucin fijadora a travs del ventrculo cardiaco, con lo que el fijador llegar a todas las clulas irriegadas por la sangre bombeada por dicho ventrculo (circuito pulmonar o corporal). Tambin podemos fijar un nico rgano en el caso de que podamos aislar e introducir la solucin fijadora en la arteria principal que irriga dicho rgano. La perfusin no siempre es posible llevarla a cabo, como es el caso de biopsias o tejidos vegetales. Este mtodo es mucho ms efectivo que el de inmersin, ya que la solucin fijadora llega a escasa distancia de todas las clulas de la estructura perfundida. Por tanto, la velocidad de penetracin del fijador no es una condicin limitante. El volumen de fijador necesario tambin es menor puesto que la solucin fijadora se va renovando constantemente y por tanto no se diluye con el medio acuoso del tejido y no pierde potencial fijador. Antes de introducir el fijador en el sistema de vasos sanguneos hay eliminar previamente la sangre con una solucin de lavado oxigenada, de otra manera su interaccin con el fijador produce trombos que impediran la fijacin de determinadas zonas del animal o del rgano. Respecto a las precauciones mencionadas anteriormente en el mtodo de inmersin debemos cuidar aqu tambin la osmolaridad, el pH y el tiempo de fijacin.

Fijacin por perfusin de un organismos completo. Mediante este tipo de perfusin se introduce la solucin fijadora en el sistema sanguneo. La bomba peristltica aporta la presin suficiente permitiendo al fijador entrar a travs del ventrculo izquierdo (Vi) y pasar a la aorta, desde la cual se distribuye por todo el cuerpo (excepto por el circuito pulmonar). Tras pasar por la red capilar, la solucin fijadora pasa a los vasos venosos que terminan por verter su contenido en la aurcula derecha (Ad). A esta cavidad hay que hacerle una abertura para que la solucin fijadora, una vez realizada su funcin, salga del circuito. Ai: aurcula izquierda; Vd: ventrculo derecho. Este mtodo de fijacin requiere conocer la presin a la que se va a introducir la solucin fijadora en el animal o estructura, la cual debe ser similar a la que posee la presin sangunea normal en estado vivo. La presin que ejercer la solucin fijadora se puede regular mediante bombas peristlticas (ver figura) o por gravedad, es decir, variando la altura a la cual se coloca la solucin fijadora respecto a la del animal. Esto es importante porque una presin muy baja prodra impedir que la solucin fijadora alcanzara todas las partes de la estructura y un presin muy alta podra provocar roturas de los vasos sanguneos y de la propia estructura tisular.

Fijadores simples Alcohol etlico. Fija por deshidratacin y se usa entre el 70 y 90 %. Es un buen elemento para preservar molculas, como ciertas enzimas, propiedades antignicas, glucgeno, pigmentos y para las extensiones citolgicas. Debido a que deshidrata, a la vez que fija, se puede usar tambin como un conservante de las muestras. Tiene inconvenientes como el endurecimiento y la retraccin de los tejidos. Carece de efecto mordiente. cido actico. Su proceso de fijacin consiste en cambiar el estado coloidal de las protenas. Se utiliza a una concentracin que vara entre el 1 y el 5 %. Es el fijador ideal para cidos nucleicos y nucleoprotenas. Como inconvenientes cabe destacar la destruccin de las mitocondrias y mala fijacin de membranas y citoplasma. Se suele usar en combinacin con otros fijadores cido pcrico. La fijacin la produce porque sales del tipo picrato coagulan con las protenas de los tejidos. Se suele usar el 2 % de una solucin saturada de cido pcrico. Preserva bien la estructura celular, no produce retracciones cuando el tiempo de fijacin es ptimo, preserva bien glucgeno y lpidos. Es un buen fijador para tinciones generales puesto que favorece la unin de los colorantes. Hay que eliminarlo completamente antes de proceder a la inclusin en ceras como la parafina. Se suele usar combinado con otros fijadores. Formaldehdo. Acta mediante la formacin de puentes entre las molculas tisulares. Se utiliza a concentraciones prximas al 4 %. Es un fijador ampliamente usado por la buena preservacin del tejido, acta como conservante, produce poca retraccin tisular, es un buen fijador para lpidos, es compatible con la mayora de las tinciones histolgicas, incluidas las de inmunocitoqumica e hibridacin de cidos ribonucleicos. Normalmente se usa en solucin tamponada e isotonica. Glutaraldehdo. Forma puentes entre las molculas de los tejidos. Se usa a una proporcin de entre el 0,5 y el 3 %. Tiene una alta capacidad para preservar la estructura celular, por lo que es el fijador de referencia para observacin de ultraestructuras celulares con el microscopio electrnico. Pero hay que tener cuidado con su baja penetracin tisular y puede producir retracciones. Se usa en soluciones tamponadas isotonicas. Tetrxido de osmio. Forma puentes entre molculas. Se emplea al 1 % en soluciones tamponadas. Es buen fijador de la ultraestructura de la clula por lo que se emplea habitualmente para las observaciones con el microscopio electrnico. Es un buen fijador para grasas y membranas celulares. Por su fuerte carcter oxidante no se usa para tinciones convencionales, excepto para las impregnaciones argnticas como el mtodo de Golgi. Mezclas fijadoras La mayor parte de los procesos de fijacin usan distintas sustancias fijadoras, bien mezcladas en la solucin acuosa inicial o utilizadas sucesivamente en el tiempo. Con ello se aprovechan las ventajas de cada una de ellas y se pueden contrarrestar sus desventajas.

Hay multitud de formas de usar los diferentes fijadores, tanto en sus componentes como en las proporciones de stos, dependiendo de las necesidades posteriores, es decir, qu tipo de tejido queremos fijar y qu queremos ver de dicho tejido. A continuacin vamos a mencionar algunas combinaciones usadas frecuentemente porque tienen unas propiedades de fijacin que las hace apropiadas para las observacin de una gran variedad de tejidos y de tcnicas de tincin. Lquido de BOUIN: Est formado por cido pcrico, formaldehdo y cido actico glacial. Es una solucin muy utilizada para el procesamiento de tejidos que se incluirn en parafina (ver captulo de inclusin) y a cuyas secciones se le pueden aplicar un amplio espectro de tinciones. Es muy til para tejidos blandos y embriones, y preserva bien el ncleo y el glucgeno. Hay que tener cuidado con el tiempo de fijacin, que no debe exceder de 48 h en el caso de fijaciones por inmersin. Tras la fijacin las muestras de tejido se pueden conservar en alcohol de 70. No est recomendado para el rin ni para el estudio de mitocondrias. Antes de la inclusin en parafina es conveniente eliminar el cido pcrico mediante lavados en alcohol de 70 porque puede hacer que no se produzca una buena inclusin o que las tinciones no sean adecuadas. Karnoy: Es un buen fijador para el glucgeno, para los hidratos de carbono simples y para las protenas fibrosas. Es bueno para visualizar los cidos nucleicos, aunque no la morfologa nuclear, y para los grumos de Nissl del sistema nervioso. Puede producir retracciones tisulares. Est formado por etanol absoluto 60 %, cloroformo 30 % y cido actico glacial 10 %. Mezclas con formaldehdo: El formaldehdo es quiz el fijador ms usado hoy en da, tanto para tcnicas histolgicas rutinarias como para otras como la inmunocitoqumica o la hibridacin de cidos nucleicos. Lo ms frecuente es utilizarlo en solucin al 4 % junto con otros fijadores. Por ejemplo, el Bouin. Se suelen disolver en soluciones tamponadas que tienen una osmolaridad similar a la del tejido que se pretende fijar. Para fijaciones de tejidos destinados a microscopa electrnica se suelen utilizar soluciones fijadoras que contienen formaldehdo y glutaraldehdo. La funcin del formaldehdo es iniciar una fijacin rpida, por su mayo capacidad de penetracin, mientras que el glutaraldehdo realizar una fijacin ms poderosa, pero ms lenta que afectaria la estructura tisular puesto que el formaldehdo ya ha realizado una fijacin previa. Glutaraldehdo-tetrxido de osmio:Los fijadores en combinacin no tienen necesariamente que usarse al mismo tiempo. Es habitual que los tejidos destinados a microscopa electrnica sean inicialmente fijados en glutaraldehdo (1 al 3 %) y paraformaldehdo (2 al 4 %), para posteriormente ser postfijados en tetrxido de osmio al 1 % en solucin tamponada. Este ltimo es un buen preservador de la ultraestructura celular, sobre todo membranas, en cooperacin con los aldhedos. Esto es importante porque el proceso para microscopa electrnica supone incubar el tejido en solventes orgnicos y polimerizacin de resinas a 60 C, durante las cuales el tejido debe ser preservado

La inclusin es el mtodo ms comn de endurecer el tejido y consiste en infiltrar la muestra con sustancias lquidas que tras un proceso de polimerizacin o enfriamiento se solidifican, sin afectar a las caractersticas del tejido. Con ello se consigue obtener cortes delgados (desde decenas de m a nm segn el medio de inclusin) sin que el tejido se rompa o se deteriore. Adems son un buen mtodo de preservar las muestras durante largos periodos de tiempo. Existen diferentes sustancias o medios de inclusin dependiendo del grosor del corte y de la tcnica que necesitemos realizar. Cuando se quieren hacer secciones para su observacin con el microscopio ptico los medios de inclusin ms frecuentemente usados son la parafina o la celoidina, mientras que si vamos a realizar observaciones con el microscopio electrnico la inclusin se realiza con resinas, principalmente de tipo acrclicas o epoxy. La mayora de los medios de inclusin no son hidrosolubles, es decir, no miscibles con el agua, luego si queremos que la sustancia en la que vamos a incluir ocupe todo el tejido tenemos que eliminar el agua y sustituirla por un lquido miscible con nuestro medio de inclusin. Si una muestra no est completamente embebida en el medio de inclusin se deteriorar y la obtencin de secciones homogneas ser imposible.