Anda di halaman 1dari 54

1. UJI AKTIVITAS DAYA HAMBAT METABOLIT BAKTERI ENDOFIT PADI TERHADAP CENDAWAN PATOGEN TANAMAN 2.

IDENTIFIKASI GEN KETAHANAN PADI TERHADAP TUNGRO DENGAN METODE POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

Laporan Praktik Lapangan Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian Jl. Tentara Pelajar No. 3A Bogor

RIAN TRIANA

DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2011

1. UJI AKTIVITAS DAYA HAMBAT METABOLIT BAKTERI ENDOFIT PADI TERHADAP CENDAWAN PATOGEN TANAMAN 2. IDENTIFIKASI GEN KETAHANAN PADI TERHADAP TUNGRO DENGAN METODE POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

RIAN TRIANA

Laporan Praktik Lapangan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biokimia

DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2011

Judul : 1. Uji Aktivitas Daya hambat Metabolit Bakteri Endofit Padi Terhadap Cendawan Patogen Tanaman 2. Identifikasi Gen Ketahanan Padi Terhadap Tungro dengan Metode Polymerase Chain Reaction (PCR) Nama : Rian Triana NIM : G84080004

Disetujui

Prof. Dr. drh. Maria Bintang, M.Sc Pembimbing Utama

Dr. Tri Puji Prijatno Pembimbing Lapangan

Diketahui Ketua Departemen Biokimia

Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc NIP 19630117 198903 1000

Tanggal lulus:

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala limpahan nikmat dan karunia-Nya sehingga kegiatan praktik lapangan dan penulisan laporan ini dapat terselesaikan. Kegiatan praktik lapangan ini dilaksanakan selama 2 bulan dari tanggal 5 Juli sampai dengan Agustus 2011 di Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian (BB-Biogen). Kegiatan yang dilakukan yaitu penelitian yang berjudul Uji Aktivitas Daya hambat Metabolit Bakteri Endofit Padi Terhadap Cendawan Patogen Tanaman dan Identifikasi Gen Penyandi Ketahanan Padi Terhadap Tungro dengan Metode Polymerase Chain Reaction (PCR). Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada semua pihak yang telah membantu selama kegiatan praktik lapangan dan penyusunan laporan ini, antara lain Prof. Dr. drh. Maria Bintang, M.Sc selaku pembimbing utama, Dr. Tri Puji Prijatno selaku pembimbing praktik lapangan, dan semua pihak yang telah membantu selama pelaksanaan dan pembuatan laporan praktik lapangan ini. Penulis menyadari tentang kekurangan dalam penulisan laporan praktik lapangan ini. Oleh karena itu, penulis mengharapkan saran dan kritik yang dapat membuat penulisan berikutnya dengan hasil yang lebih baik. Akhir kata penulis berharap tulisan ini dapat berguna bagi penulis sendiri maupun semua pihak demi kemajuan ilmu pengetahuan.

Bogor, September 2011

Rian Triana

DAFTAR ISI
DAFTAR ISI ....................................................................................................... v DAFTAR TABEL .............................................................................................. vi DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... vi DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... vi PENDAHULUAN ............................................................................................... 1 KEADAAN UMUM BALAI BESAR PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN BIOTEKNOLOGI DAN SUMBER DAYA GENETIK PERTANIAN ................. 5 Sejarah Lembaga dan Perkembangannya ......................................................... 5 Visi dan Misi ................................................................................................... 6 Organisasi dan Sumber Daya Manusia ............................................................. 7 Fasilitas dan Kerja Sama .................................................................................. 7 Program Penelitian dan Pembiayaan .............................................................. 10 TINJAUAN PUSTAKA .................................................................................... 12 Mikroba Endofit ............................................................................................ 12 Bakteri Endofit .............................................................................................. 13 Pengendalian Hayati ...................................................................................... 13 Mekanisme Antagonis Dalam Pengendalian Penyakit Tumbuhan................... 14 Mikroba Patogen Uji ...................................................................................... 15 Tanaman Padi ................................................................................................ 16 Penyakit Tungro ............................................................................................ 17 Polymerase Chain Reaction (PCR) ................................................................ 18 Elektroforesis ................................................................................................. 20 BAHAN DAN METODE .................................................................................. 22 Bahan dan Alat .............................................................................................. 22 Metode .......................................................................................................... 23 Pembuatan Media Luria Bertani (LB)......................................................... 23 Pembuatan Media Potato Dextrose Broth ................................................... 23 Pembuatan Media Potato Dextrose Agar (PDA)......................................... 23 Pembuatan Media Produksi Antibiotik (Hsu & Lockwood 1969) ............... 23 Kultur Cendawan ....................................................................................... 23 Uji Antagonisme Bakteri Endofit ............................................................... 24 Produksi Antibiotik .................................................................................... 24 Ekstraksi Protein dan Antiobiotik Bakteri Endofit ...................................... 25 Uji Aktivitas Daya Hambat Ekstrak Protein dan Ekstrak Etil Asetat ........... 25 Penanaman Padi ......................................................................................... 26 Isolasi DNA Padi ....................................................................................... 26 Amplifikasi DNA dengan PCR .................................................................. 27 Elektroforesis produk PCR ......................................................................... 27

HASIL DAN PEMBAHASAN .......................................................................... 29 Uji Antagonisme Bakteri Endofit ................................................................... 29 Produksi dan Ekstraksi Metabolit serta Uji Aktivitas Daya Hambatnya .......... 30 Isolasi DNA Padi ........................................................................................... 34 Amplifikasi DNA dengan PCR ...................................................................... 36 SIMPULAN DAN SARAN ............................................................................... 38 Simpulan ....................................................................................................... 38 Saran ............................................................................................................. 38 DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 39 LAMPIRAN ...................................................................................................... 44

DAFTAR TABEL
1. Hasil uji daya hambat metabolit bakteri endofit terhadap kedua cendawan ... 32 2. Hasil uji aktivitas glukanase ekstrak protein ................................................. 34

DAFTAR GAMBAR
1. 2. 3. 4. Tanaman kelapa sawit yang terserang busuk pangkal batang ........................ 16 Proses umum PCR ....................................................................................... 19 Skema uji antagonisme bakteri endofit terhadap cendawan .......................... 24 Skema uji aktivitas daya hambat ekstrak terhadap pertumbuhan miselia cendawan ..................................................................................................... 26 5. Hasil uji antagonisme bakteri endofit: (a) E65 vs Rs; (b) E65 vs Po; ............ 30 6. Hasil uji daya hambat metabolit bakteri E94: (a) EA vs Po; (b) P vs Po;....... 32 7. Hasil uji daya hambat metabolit bakteri E65: (a) EA vs Po; (b) P vs Po;....... 33 8. Hasil uji ekstrak protein E94 dan E65 pada media glukan ............................ 34 9. Elektroforegram hasil PCR dengan primer R-marker ................................... 37 10. Elektroforegram hasil PCR dengan primer S-marker .................................... 37 11. Elektroforegram hasil PCR dengan primer UR-marker ................................. 37

DAFTAR LAMPIRAN
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Struktur organisasi BB-Biogen ..................................................................... 45 Komposisi larutan EDTA 0.5 M................................................................... 46 Komposisi DNA Loading buffer (loading dye) ............................................. 46 Komposisi buffer TAE 50X (per liter larutan) .............................................. 46 Komposisi larutan KOAc 5 M, pH 5.5 ......................................................... 46 Komposisi buffer ekstraksi DNA ................................................................. 46 Komposisi buffer TE .................................................................................... 46 Komposisi larutan PBS (Phosphate Buffered Saline) 1X .............................. 47 Komposisi larutan PVP (Polivinilpirolidon) ................................................. 47 10. Komposisi DNA marker .............................................................................. 48

PENDAHULUAN
1. Uji Aktivitas Daya hambat Metabolit Bakteri Endofit Padi Terhadap Cendawan Patogen Tanaman Praktik lapangan (PL) merupakan salah satu kegiatan yang diadakan oleh Institut Pertanian Bogor, khususnya Departemen Biokimia, FMIPA, untuk menghasilkan lulusan sarjana biokimia yang mampu berpikir sistematis dan analisis, memahami kaidah ilmiah, memiliki landasan keilmuan yang kuat, terampil, serta kreatif dalam memecahkan berbagai macam permasalahan dalam kehidupan yang berkaitan dengan biokimia untuk kesejahteraan manusia. Program praktik lapangan ini diharapkan dapat memperluas wawasan dan membekali mahasiswa dengan pengalaman yang cukup memadai serta memperoleh gambaran dunia kerja yang sesungguhnya di instansi maupun isdutri terkait. Selain itu, mahasiswa dapat meningkatkan kompetensi ilmu biokimia yang telah diperoleh selama kuliah agar mampu mengaplikasikan ilmu tersebut untuk mengobservasi, menganalisis, dan memecahkan masalah yang terkait dengan bidang keilmuan biokimia dan aplikasinya, serta mampu untuk ikut berperan serta dalam pengembangan disiplin biokimia di bidang biologi molekuler, bioteknologi, fermentasi, biomedis, toksikologi, nutrisi, pengolahan pangan dan bioproses lain yang berkaitan dengan kehidupan dalam rangka memajukan lingkungan hidup. Praktik lapangan dapat dilakukan pada instansi di bidang industri ataupun lembaga penelitian yang terkait dengan disiplin ilmu biokimia. Salah satu ilmu biokimia yang tengah berkembang adalah bioteknologi tanaman. lembaga penelitian yang terkait bidang tersebut adalah Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian (BB-Biogen). Salah satu topik penelitian yang dilakukan di BB-Biogen adalah mengenai senyawa-senyawa bioaktif dari mikroba endofit yang berpotensi untuk mengatasi perrmasalahan penyakit yang menyerang tanaman pertanian yang diakibatkan oleh mikroba patogen. Indonesia adalah salah satu negara dengan mega biodiversitas yang kaya dengan sumber plasma nutfah yang tidak ternilai. Beberapa tahun terakhir ini penggalian sumber daya mikroba yang terdapat di dalam jaringan tanaman mulai

banyak mendapat perhatian. Mikroba tersebut mulai dipelajari untuk berbagai tujuan, seperti mikroba endofit yang berasal dari rumput telah diaplikasikan untuk keperluan industri dan pertanian (Clay 1988). Mikroba endofit dapat menghasilkan berbagai macam senyawa bioaktif yang berkaitan dengan tanaman inangnya (Strobel 1996; Cacabuono & Pomilio 1997; Rizzo et al. 1997; Fabry et al. 1998). Bakteri endofit dapat berpengaruh pada kesehatan tanaman dalam hal
antagonisme langsung, menginduksi ketahanan sistematik, dan meningkatkan toleransi tanaman terhadap tekanan biotic dan abiotik lingkungan (Hallman et al. 2001). Menurut Strobel (2003), beberapa mikroba endofit dapat menghasilkan senyawa - senyawa bioaktif sebagai senyawa metabolit sekunder yang memiliki daya antimikroba, antimalaria, antikanker dan sebagainya. Penelitian mengenai pemanfaatan senyawa bioaktif dari berbagai macam mikroba endofit sebagai agen biokontrol terhadap cendawan patogen tanaman telah banyak dilakukan. Salah satu kelompok mikroba endofit yang banyak diteliti adalah kelompok bakteri endofit. Bakteri sebagai agen biokontrol mempunyai beberapa kelebihan, yaitu bakteri merupakan mikroorganisme yang banyak terdapat di tanah, produksi massa bakteri juga lebih mudah dan lebih cepat daripada mikroorganisme lain seperti jamur. Bakteri sebagai agen biokontrol yang pernah dilaporkan adalah Agrobacterium, Pseudomonas, Bacillus, Alcaligenes, Streptomyces (Shoda 2000). Menurut Bacon et al. (2001), Bacillus mojavensis berpotensi sebagai biokontrol terhadap cendawan patogen Fusarium verticilloides. Beberapa kelompok

Streptomyces dapat menekan laju pertumbuhan Fusarium oxysporum f.sp. cubense (Foc) pada tanaman pisang (Sariyanto 2006). Selain itu, Pseudomonas aeruginosa 7NSK2 dilaporkan dapat menginduksi tanaman padi dalam melawan serangan Pyricularia grisea dengan menghasilkan pyocianin (De Vleesschauwer et al. 2006 dalam buku Bioaugmentation, Biostimulation, and Biocontrol)

Penelitian yang dilakukan selama praktek lapangan ini bertujuan untuk mengisolasi senyawa bioaktif dari beberapa bakteri endofit tanaman padi dan menguji aktivitas daya hambatnya terhadap beberapa isolat cendawan patogen yang menyerang berbagai macam tanaman. Senyawa bioaktif yang diperoleh nantinya diharapkan dapat digunakan dan dikembangkan lebih lanjut untuk mengatasi berbagai macam masalah pertanian terkait penyakit yang diakibatkan oleh cendawan patogen.

2. Identifikasi Gen Ketahanan Padi Terhadap Tungro dengan Metode Polymerase Chain Reaction (PCR) Penyakit tungro merupakan salah satu penyakit virus penting pada tanaman padi di Asia Selatan dan Tenggara. Penyakit ini sudah ada di Indonesia sejak tahun 1859 (Semangun 1991). Epidemi sering terjadi di daerah Sulawesi Selatan, Bali, Jawa Barat, dan Jawa Tengah yang merupakan pusat penghasil beras di Indonesia bahkan hingga saat ini serangan tungro masih sering terjadi di daerah-daerah tersebut. Pada tahun 1975-1985 sempat terjadi serangan tungro yang menyebabkan puso hingga mencapai 180.000 ha atau senilai US$ 900 juta (Chancellor et al. 1996) dan pada tahun 1998-1999 terjadi serangan besar di Lombok Tengah dan Lombok Timur seluas 10.000-15.000 ha (Hasanuddin 1999). Tungro disebabkan oleh infeksi ganda dari dua jenis virus yang berbeda yaitu rice tungro bacilliform virus (RTBV) dan rice tungro spherical virus (RTSV) (Hibino et al. 1978). Penyakit ini ditularkan oleh lima spesies wereng hijau dengan efisiensi beragam. Nephotetix virescens (Distant) merupakan vektor yang memiliki efisiensi paling tinggi dalam menularkan virus tungro yaitu sebesar 80 % (Siwi et al. 1987; Hull 1996; Hibino & Cabunagan 1986). Spesies tersebut saat ini mendominasi populasi spesies wereng hijau di hampir seluruh ladang padi kecuali Kalimantan Selatan. Penyebaran imago dilaporkan sangat mempengaruhi dinamika populasi wereng hijau. Apabila sumber inokulum virus telah tersedia, aktivitas penyebaran imago tersebut diperkirakan sangat penyebaran tungro. Upaya pengendalian dan penanggulangan tungro telah banyak dilakukan. Salah satu cara yang dianggap mudah dan murah adalah dengan menggunakan varietas resisten. Penggunaan varietas resisten adalah komponen awal yang mempengaruhi

paling efektif dalam strategi pengendalian tungro (Sama 1985). Beberapa varietas tahan virus tungro dan wereng hijau telah dilepas untuk mengendalikan tungro antara lain Tukad Unda, Tukad Petanu, Tukad Balian, Kalimas dan Bondoyudo (Widiarta et al. 2003). Namun varietas-varietas ini tidak dianjurkan untuk

ditanam terus menerus untuk mencegah tekanan seleksi terhadap wereng hijau. Selain itu, ketahanannya juga bersifat spesifik lokasi yang berarti bahwa varietas tersebut tahan di suatu daerah, namun tidak tahan di daerah yang lain.

Usaha perbaikan dan perakitan varietas tahan tungro harus dilakukan secara terus menerus untuk mendukung pergiliran varietas dalam rangka memperpanjang durasi ketahanan varietas. Oleh sebab itu, perlu dilakukan penelitian berkelanjutan untuk menghasilkan galur-galur varietas unggul tipe baru agar petani memiliki banyak pilihan khususnya dalam pergiliran varietas dalam menanggulangi serangan penyakit tungro. Upaya perakitan varietas tahan perlu mempertimbangkan faktor kesesuaian virulensi virus dan informasi tentang keberadaan genetik sumber gen ketahanan terhadap virus tungro yaitu dengan melakukan hibridisasi interspesifik atau intergenetik antar plasma nutfah yang telah teridentifikasi memiliki karakter unggul tertentu (Daradjat et al. 2004). Perakitan varietas unggul Padi tipe baru diharapkan akan menjadi alternatif baru dalam penanggulangan penyakit tungro.

KEADAAN UMUM BALAI BESAR PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN BIOTEKNOLOGI DAN SUMBER DAYA GENETIK PERTANIAN

Sejarah Lembaga dan Perkembangannya Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian berkedudukan di Jalan Tentara Pelajar No. 3A, Cimanggu, Bogor. Lembaga ini dibentuk pada tanggal 30 Desember 2003 berdasarkan SK Mentan No. 631/Kpts/OT.140/12/2003. Lembaga ini pada awalnya bernama Algemeen Proefstation voor den Landbouw (Balai Besar Penyelidikan Pertanian) yang didirikan pada tahun 1918 dan kemudian mengalami perubahan menjadi Lembaga Pusat Penelitian Pertanian pada tahun 1966. Setelah itu lembaga ini mengalami beberapa reorganisasi, yaitu menjadi Balai Penelitian Tanaman Bogor (Balittan) pada tahun 1980-1994; Balai Penelitian Bioteknologi Tanaman Pangan (Balitbio) pada tahun 1994-2002; Balai Penelitian dan Sumberdaya Genetik Pertanian (Balitbiogen) pada tahun 2002-2003; dan akhirnya menjadi Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian (BB-Biogen) pada tahun 2003 hingga saat ini. Berdasarkan SK Mentan No. 631/Kpts/OT.140/12/2003, tugas pokok dan fungsi BB-Biogen adalah sebagai unit pelaksana teknis di bidang penelitian dan pengembangan yang bertanggung jawab kepada Kepala Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian. Selain itu, BB-Biogen mempunyai tugas dan mandat untuk melaksanakan, menyusun program, dan evaluasi kegiatan penelitian dan pengembangan bioteknologi dan sumberdaya genetik pertanian; melaksanakan penelitian konservasi dan karakterisasi yang meliputi fisik, kimia, biokimia, metabolisme biologis dan biomolekuler sumberdaya genetik pertanian;

melaksanakan penelitian bioteknologi sel, bioteknologi jaringan, rekayasa genetik, dan bioprospeksi sumberdaya genetik; melaksanakan penelitian keamanan hayati dan keamanan pangan produk bioteknologi; melaksanakan pengembangan komponen teknologi sistem dan usaha agribisnis produk bioteknologi pertanian, melaksanakan kerjasama dan pendayagunaan hasil penelitian bioteknologi dan

sumberdaya genetik pertanian; serta mengelola tata usaha dan rumah tangga BBBiogen. Institusi ini mengembangkan empat program utama, yaitu program penelitian pengayaan, pengelolaan, pemanfaatan, dan pelestarian sumber daya genetik pertanian, program penelitian rekayasa, pemanfaatan teknik biologi molekuler dan rekayasa genetik untuk perbaikan tanaman ternak, program penelitian pemanfaatan kultur in vitro untuk perbanyakan tanaman, perbaikan varietas, dan produksi senyawa metabolit sekunder, serta program penelitian dan pengembangan berbasis kemitraan dan keperluan pembangunan pertanian bidang bioteknologi berdasarkan permintaan. Visi dan Misi BB-Biogen memiliki visi, yaitu menjadi pusat unggulan dalam penelitian dan pengembangan bioteknologi dan sumberdaya genetik pertanian yang mampu mendukung ketahanan pangan yang berkelanjutan dan agribisnis yang berdaya saing tinggi berbasis sumberdaya lokal. Program BB-Biogen disusun dan dirumuskan berdasarkan pada permasalahan-permasalahan utama yang

penyelesaiannya secara konvensional sulit atau tidak mungkin dilakukan. Misi BB-Biogen untuk mewujudkan visi tersebut, yaitu meningkatkan kuantitas dan sumberdaya manusia (SDM) berkualitas di bidang bioteknologi dan sumberdaya genetik pertanian; mengelola dan memanfaatkan sumberdaya genetik pertanian untuk mendukung penelitian di bidang bioteknologi dan pemuliaan tanaman; mengembangkan suatu program penelitian yang kuat dalam perbaikan sifat genetik tanaman dan mikroba, serta komponen teknologi budidaya pertanian dengan pendekatan bioteknologi sehingga teknologi dan produk BB-Biogen berdaya saing tinggi; berkontribusi pada pengembangan pembangunan nasional pertanian dengan jalan mengembangkan dan mendiseminasikan teknologi yang sesuai untuk meningkatkan daya saing produk perttanian Indonesia di dalam pasar nasional dan global untuk mendukung program badan litbang menjadi lembaga penelitian dan pengembangan pertanian berkelas dunia dalam menghasilkan dan mengembangkan inovasi pertanian mendukung terwujudnya sistem pertanian industrial.

Organisasi dan Sumber Daya Manusia BB-Biogen merupakan salah satu unit kerja di bawah Badan Penelitian dan Pengembangan (Litbang) Pertanian, Kementerian Pertanian RI. Lembaga ini memiliki tiga unit kerja yang terdiri atas Eselon IVa sebagai kepala sub bagian dan kepala seksi, Eselon IIIb sebagai kepala bagian dan kepala bidang, serta Eselon IIb sebagai kepala (Lampiran 1). Selain jabatan struktural, di BB-Biogen juga terdapat jabatan fungsional yang terdiri atas peneliti, litkayasa, pustakawan, pranata komputer, dan ahli statistika. Lembaga ini juga memiliki beberapa sistem koordinasi dan kepanitiaan dalam upaya membantu pelaksanaan tugas pokok dan fungsi kepala balai yang antara lain koordinasi penelitiaan, unit komersialisasi teknologi (UKT), panitia evaluasi karya ilmiah (PEKI), dan panitia evaluasi teknisi litkayasa. BB-Biogen memiliki sumber daya manusia (SDM) sebanyak 260 orang, terdiri atas 65 orang peneliti aktif, 23 orang peneliti non klas, tiga orang peneliti non aktif karena berada pada struktural, 19 orang litkayasa, dan 21 orang tenaga litkayasa non klas, 127 orang tenaga administrasi dan penunjang. Berdasarkan jenjang pendidikannya, peneliti BB-Biogen, terdiri atas 32 orang doktor (S3), 40 orang master (S2), dan 19 orang sarjana (S1). Lembaga ini memiliki empat kelompok peneliti (Kelti), yaitu Kelti pengelolaan sumber daya genetik (PSDG), Kelti biologi molekuler (BM), Kelti biologi sel dan jaringan (BSJ), dan Kelti biokimia. Fasilitas dan Kerja Sama Sarana penelitian yang digunakan oleh BB-Biogen untuk melaksanakan tugas dan fungsinya meliputi laboratorium, rumah kaca, kebun percobaan, dan perpustakaan. BB-Biogen memiliki delapan jenis laboratorium, yaitu laboratorium biologi molekuler, laboratorium kultur jaringan, laboratorium bank gen, laboratorium mikrobiologi, laboratorium biokimia, laboratorium penelitian bahan pangan terpadu, fasilitas uji terbatas, dan laboratorium BB-Biogen (laboratorium uji). Kelompok peneliti biologi molekuler memiliki tiga laboratorium, yaitu laboratorium biologi molekuler, laboratorium terpadu, dan fasilitas uji terbatas. Laboratorium biologi molekuler bertugas melakukan kegiatan biologi molekuler

dengan alat pendukung utamanya yaitu PCR, ChemiDoc, dan elektroforesis. Laboratorium terpadu bertugas melakukan kegiatan penelitian biomolekuler dengan alat pendukung utamanya micro array, real time PCR, dan gene sequence. Laboratorium fasilitas uji terbatas bertugas melakukan kegiatan penelitian rekayasa genetik dan keamanan hayati tanaman hasil rekayasa genetik dengan alat pendukung utamanya fasilitas biosafety containment, gene gun, dan laser confocal microscope. Kelompok peneliti biologi sel dan jaringan hanya memiliki laboratorium kultur jaringan. Laboratorium ini bertugas melakukan kegiatan penelitian perbaikan dan perbanyakan tanaman in vitro, protoplas, seleksi in vitro, termasuk kultur haploid, fusi

dan produksi metabolit sekunder dengan alat

pendukung utamanya yaitu growth chamber dan inverted microscope. Kelompok peneliti pengembangan sumber daya genetik (PSDG) memiliki dua laboratorium, yaitu laboratorium bank gen dan mikrobiologi. Laboratorium bank gen bertugas melakukan kegiatan penelitian untuk pengelolaan SDG dengan alat pendukung utamanya yaitu deep freezer dan cool storage. Laboratorium mikrobiologi bertugas melakukan penelitioan di bidang mikrobiologi dengan alat pendukung utamanya liophilizer, ultracentrifuge, dan deep freezer. Kelompok peneliti biokimia memiliki satu laboratorium, yaitu

laboratorium biokimia. Laboratorium ini bertugas melakukan kegiatan penelitian identifikasi senyawa kimia dan pemanfaatan senyawa bioaktif dengan alat pendukung utamanya yaitu kromatografi gas (GC), aktapurifier, dan GC-MS. Lembaga BB-Biogen juga memiliki laboratorium uji diluar bagian dari kelompok peneliti. Laboratorium uji bertugas melakukan koordinasi dan pembinaan kepada laboratorium lingkup Biogen untuk mendukung tugas pokok dan fungsinya. Perpustakaan BB-Biogen pada saat ini mengelola aset koleksi sejumlah 3302 eksemplar, 803 judul majalah dalam dan luar negeri, dan 469 judul tesis dan disertasi. Aset tersebut ditata dalam dua jenis katalog, yaitu katalog elektronik untuk koleksi baru dan katalog manual untuk koleksi lama. Aset koleksi lama secara bertahap disusun dalam katalog elektronik. Hal ini dilakukan sejalan dengan arah pengembangan perpustakaan BB-Biogen yang menitikberatkan pada

perpustakaan sebenarnya. Penataan koleksi pustaka menggunakan sistem WINISIS yang kemudian ditampilkan secara langsung ke media situs melalui IGLOO. Rumah kaca merupakan sarana penunjang yang digunakan oleh para peneliti setellah penelitian di laboratorium. Jumlah rumah kaca yang dikelola sebanyak 38 unit menyebar di 3 lokasi, yaitu di Cimanggu (sekitar kantor dan gedung utama), Cikeumeuh, dan di sebelah gedung Kelti Biokimia. Pengguna rumah kaca yang dikelola tidak hanya digunakan oleh para peneliti di lingkungan BB-Biogen, tetapi juga digunakan oleh para peneliti dari instansi lain, seperti Balai Besar Padi, Balitro, dan mahasiswa yang melakukan kerja sama dengan BBBiogen. Kebun percobaan yang dikelola adalah kebun percobaan (KP) Cikeumeuh, KP Pacet, dan KP Citayam. KP Cikeumeuh yang berlokasi di Bogor memiliki luas lahan sebesar 116.155 m2 dan luas bangunan 1.846 m2. KP Citayam yang berlokasi di Citayam memiliki luas lahan sebesar 22.870 m2 dan luas banguanan 284 m2 sedangkan KP Pacet yang berlokasi di Cianjur memiliki luas lahan sebesar 13.848 m2 dan luas bangunan 1.326 m2. Lembaga BB-Biogen sejak lama memiliki kerjasama erat dengan Cornell University, The International Rice Research Institute (IRRI), dan Wageningen University, melalui kerjasama penelitian dan program pengembangan SDM. BBBiogen juga bekerjasama dengan Masyarakat Ekonomi Eropa (fusi protoplas terong), India (tomat), USA (keragaman genetik padi), ISAAA (padi), IRRI (funCT1342ional genomics), dan AMBIONET (keragaman genetik jagung). Lembaga ini juga menjadi pusat serta jejaring kerja bioteknologi dan plasma nutfah dengan balai-balai komoditas di lingkup Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian. Selain itu, BB-Biogen membina kerja sama dengan institusi pemerintah lain baik lembaga yang bukan departemen, pemerintah pusat maupun pemerintah daerah dan swasta. Lembaga BB-Biogen memadukan pengembangan bioteknologi dan pengelolaan sumber daya genetik. Pemaduan ini memberikan peluang untuk memfokuskan aktivitas penelitian pada karakterisasi keanekaragaman genetik tanaman, seperti penambanagan alel, peneltiian genetik komparatif, dan transfer gen untuk perbaikan tanaman. Penguatan dan perluasan kerjasama terus

10

diupayakan melalui penelitian kerjasama dengan kelompok baru termasuk institusi internasional, regional, dan nasional baik pemerintah maupun swasta. Program Penelitian dan Pembiayaan Progam penelitian pengelolaan sumber daya genetik melakukan penelitian dan pengembangan pada tingkat organisme dan interaksinya dengan faktor biotik dan abiotik. Program kerjasamanya meliputi eksplorasi, rejuvenasi, konservasi plasma nutfah, dan karakterisasi plasma nutfah secara fisik (morfologi dan

anatomi). Selain itu, dilakukan penelitian mengenai evaluasi plasma nutfah terhadap cekaman biotik dan abiotik serta mutu gizinya, pengembangan kumpulan data plasma nutfah pertanian, dan penelitian prospek manfaat plasma nutfah mikroba (dengan pendekatan interaksi biologi). Program penelitian biologi molekuler melakukan penelitian identifikasi dan aplikasi marka molekuler yang meliputi pemetan gen (untuk ketahanan terhadap penyakit blas, pengendalian terhadap produksi padi, pengendali kualitas benih padi dan ketahanan terhadap cekaman keracunan alumunium), markerassisted selection (MAS) untuk membantu dalam seleksi pembentukan galur tahan penyakit blas, sidik jari DNA, analisis keragaman genetik dan kekerabatan plasma nutfah pertanian (padi, ubijalar, dan kedelai), penelitian identifikasi, isolasi, kloning, dan karakterisasi gen Bacillus thuringiensis, penelitian rekayasa genetik yang meliputi konstruksi gen cryIA(b), transformasi (padi tahan hama penggerek batang, kedelai tahan ham penggerek polong, ubi jalar tahan hama boleng dan virus SPFMV, pepaya delay ripening, jagung tahan hama penggerek batang, kentang tahan leaf blight serta tomat tahan virus TYLCV dan CMV), dan studi ekspresi immunoblot, immunostrip, bioassay serangga. Program penelitian biologi sel dan jaringan melakukan penelitian dan pengembangan biologi sel dan jaringan. Program kerjanya yaitu penelitian dan pengembangan kultur in vitro yang meliputi metode regenerasi, perbanyakan mikro (protoplas, sel, jaringan, dan organ), serta perbaikan genetik tanaman melalui fusi protoplas, fertilisasi in vitro, kultur haploid, seleksi in vitro, keragaman somaklonal, dan penyelamatan embrio, penelitian tanaman bebas patogen melalui kultur in vitro, penelitian konservasi plasma nutfah tanaman

11

melalui kultur in vitro, dan penelitian peningkatan produksi metabolit sekunder melalui kultur in vitro. Program penelitian biokimia melakukan penelitian dan pengembangan kimia dan biokimia. Program kerjanya meliptui identifikasi, karakterisasi, elusidasi struktur, bioassay, dan rekayasa senyawa biaoktif dan enzim, penelitian struktur dan fungsi produk gen, deteksi dini patogen, karakterisasi biokimia produk rekayasa genetik (PRG) khususnya kesepadanan substansi (karbohidrat, protein, lemak, asan amino, asam lemak, dan lain-lain), analisis keragaman genetik, serta analisis kekerabatan organisme pengganggu tanaman dan mikrob lain secara biokimia, analisis dekomposisi atau degradasi senyawa organik. Anggaran dana yang dikelola oleh BB-Biogen meliputi dana APBN, dana penerimaan negara bukan pajak (PNPB), dan dana kerja sama penelitian. Realisasi dana APBN digunakan untuk alokasi belanja mengikat yang terdiri atas belanja pegawai dan belanja barang, belanja tidak mengikat atau pembangunan yang terdiri atas kegiatan penunjang, penelitian, penyuluhan dan penyebaran informasi, dan belanja modal. Sebagian dari alokasi belanja mengikat diguanakan untuk pemeliharaan sarana dan prasarana karena pembangunan kantor, gedung laboratorium, kendaraan dan sarana lainnya memerlukan perbaikan dengan biaya pemeliharaan yang cukup tinggi, sehingga perlu peningkatan anggaran setiap tahunnya. Alternatif pengurangan biaya pemeliharaan adalah dengan mengajukan penghapusan untuk kendaraan dan peralatan yang sudah tidak layak pakai karena dianggap sudah tidak efisien lagi. Realisasi penerimaan negara bukan pajak (PNPB) terdiri atas realisasi penerimaan umum dan realisasi penerimaan fungsional. Penerimaan umum berasal dari sewa rumah dinas, penerimaan kembali belanja pegawai tahun lalu, serta pengembalian belanja gaji pokok pegawai negeri sipil. Penerimaan fungsional terutama berasal dari pengguanaan gedung auditorium, pendapatan jasa tenaga atau informasi melalui kerja sama penelitian serta penjualan hasil pertanian.

12

TINJAUAN PUSTAKA
Mikroba Endofit Mikroba endofit adalah mikroba yang hidup di dalam jaringan tanaman dengan membentuk koloni di dalamnya tanpa membahayakan inangnya (Radji 2005). Hampir di dalam semua jaringan tanaman yang sehat ditemukan adanya mikroba endofit. Mikroba ini hidup bersimbiosis saling menguntungkan dengan inangnya. Mikroba endofit menyediakan derivat nutrisi dan senyawa aktif serta memproteksi tanaman inangnya dari herbivora, serangga atau jaringan yang patogen sedangkan mikroba itu sendiri mendapatkan nutrisi dari hasil metabolisme tanaman inangnya (Tanaka et al. 1999). Sebagian dari endofit mampu membuat kembali nutrisi dari tanaman dengan cara menghasilkan senyawa khusus, seperti metabolisme sekunder untuk melindungi inangnya dari serangan jamur dan hama (Taechowisan et al. 2005). Setiap tanaman tingkat tinggi dapat mengandung beberapa mikroba endofit yang mampu menghasilkan senyawa biologi atau metabolit sekunder yang diduga sebagai akibat koevolusi atau transfer genetik (genetic recombination) dari tanaman inangnya ke dalam mikroba endofit (Tan & Zou 2001 dalam Radji 2005). Mikroba endofit yang terdapat pada jaringan tanaman adalah bakteri, kapang, dan khamir. Mikroba endofit dapat diisolasi dari inangnya dan

ditumbuhkan pada media yang sesuai setelah dimurnikan, seperti media PDB yang digunakan untuk menumbuhkan kapang atau NA untuk menumbuhkan bakteri. Mikroba ini mempunyai arti ekonomis karena merupakan sumber yang kaya untuk mendapatkan bahan bioaktif dan senyawa bermanfaat yang berpotensi untuk dikembangkan dalam bidang medis, pertanian, dan industri (Prasetyoputri & Atmosukarto 2006). Manfaat lainnya yaitu dapat digunakan sebagai penghasil antibiotik, misalnya Crytocandin. Crytocandin adalah antifungi yang dihasilkan oleh mikroba endofit Cryptosporiopsis quercina dan Trichopyton (Strobel et al. 1999 dalam Radji 2005). Mikroba endofit juga dapat digunakan sebagai antivirus, misalnya jamur endofit Cytonaema sp. yang menghasilkan metabolit Cytonic acid A dan B. Kedua metabolit ini merupakan inhibitor protease dan dapat menghambat pertumbuhan cytomegalovirus pada manusia (Guo B et al. 2000 dalam Radji 2005).

13

Bakteri Endofit Bakteri endofit adalah bakteri yang berada dalam jaringan tanaman (Aini & Abadi 2004). Bakteri endofit maupun rizobakteri lainnya merupakan bagian dari mikroflora alamiah dari tanaman yang sehat sehingga dapat dikatakan sebagai kontributor penting bagi kesehatan tanaman (Kloepper et al. 1999 dalam Aini & Abadi 2004). Bakteri endofit dapat berpengaruh pada kesehatan tanaman dalam hal antagonisme langsung, menginduksi ketahanan sistematik dan meningkatkan toleransi tanaman terhadap tekanan lingkungan (Hallman et al. 2001). Bakteri endofit mungkin mengalami rekombinasi genetik dengan inangnya sehingga menghasilkan senyawa alami yang karakteristik bagi inangnya (Tan & Zou 2001 dalam Sugijanto et al. 2004). Bakteri endofit menjadi perhatian utama sebagai agen biokontrol, misalnya bakteri dari beberapa spesies tanaman dapat menghambat berbagai macam mikroba patogen. Menurut Dwidjoseputro (1989), Bacillus sp. dapat menghasilkan zat antibiotik berupa basitrasin, subtilin, polimixin, tritosin, bulbivormin dan juga menghasilkan senyawa volatil. Bakteri dari genus Bacillus sp. diketahui telah banyak digunakan sebagai biokontrol pada beberapa spesies tanaman dan terbukti mampu menjadi penghambat perkembangan beberapa penyakit tanaman (Cook & Baker 1989 dalam Aini & Abadi 2004). Pengendalian Hayati Pengendalian hayati secara teknis lebih unggul dibandingkan pengendalian secara kimiawi karena selain efektif dan efisien juga ramah lingkungan. Penyakit yang disebabkan oleh jamur merupakan perhatian utama dalam produksi pertanian (Gohel et al. 2006). Jamur patogen merupakan penyebab kerugian yang besar pada produksi hasil panen. Pengaturan fitopatogen yang baik adalah persoalan yang penting bagi semua sistem pertanian. Biologi kontrol bagi patogen tanaman ini merupakan pendekatan alternatif untuk mengurangi ketergantungan kepada pertanian modern dan penggunaan obat pembasmi jamur yang mengandung zat kimia berbahaya sehingga dapat menyebabkan polusi lingkungan dan

berkembangnya keresistenan patogen (Widyastuti et al. 2001).

14

Mikroorganisme antagonistik memegang peranan sangat penting dan cukup berkembang dalam pengendalian hayati penyakit tanaman. Organisme antagonis merupakan organisme yang menimbulkan efek kerusakan pada organisme lain dengan memproduksi enzim lisis, antibiotik atau persaingan (Vasudevan et al. 2002). Contohnya seperti enzim kitinase yang berperan penting dalam kontrol fungi patogen tanaman secara mikoparasitisme (Nugroho et al. 2003). Kitin (homopolimer ikatan -1,4 dari N-asetilglukosamin) merupakan komponen struktural dari sebagian besar dinding sel cendawan patogen (Yanai et al. 1994 dalam Wijaya 2002). Pengendalian hayati terhadap patogen pada umumnya dapat melalui antibiosis dan kompetisi, kadang-kadang melalui hiperparasitisme (Sitepu 1993). Menurut Friendlender et al. (1989) dalam Susanto et al. (2002) bakteri Bacillus sp. dapat mengeluarkan enzim litik berupa kitinase dan -1-3 glukanase yang dapat mendegradasi masing-masing kitin dan glukan yang terdapat dalam sel jamur. Hal ini menunjukkan bahwa Bacillus sp. memiliki kemampuan menghambat berbagai golongan mikroba termasuk bakteri dan jamur. Mekanisme Antagonis Dalam Pengendalian Penyakit Tumbuhan Ada banyak cara bagi organisme antagonis bekerja antara lain mendahului laju kolonisasi patogen dengan kompetisi, menghasilkan antibiotik, dengan mikoparasit atau lisisnya patogen (Campbell 1989). Mekanisme umum kontrol biologis dapat dibagi menjadi efek langsung dan tidak langsung agen biokontrol pada patogen tanaman. Efek langsung termasuk kompetisi untuk nutrisi atau tempat tumbuh, produksi antibiotik dan enzim litik, inaktivasi enzim patogen, dan parasitisme. Yang termasuk efek tidak langsung yaitu semua aspek morfologi dan perubahan biokimia pada tanaman inang, seperti toleran terhadap tekanan hingga pemanjangan akar dan perkembangan tanaman, penyerapan nutrisi anorganik, dan penyebab resisten (Viterbo et al. 2002 dalam Gohel et al. 2006). Parasitisme dan produksi enzim ekstraselular penting pada mekanisme biokontrol untuk pengendalian penyakit tanaman. Contoh bakteri penghasil enzim kitinase antara lain Bacillus cereus (Chang et al. 2003 dalam Aini & Abadi 2004) dan Pantoea agglomerans yang diperlukan sebagai biokontrol jamur patogen (Bonatera et al. 2003 dalam Gohel et al. 2006) dan Bacillus sp. (Frindlender et al.

15

1989 dalam Aini & Abadi 2004). Filamen jamur Trichoderma spp. bersifat mikoparasit bagi patogen tanaman dan merupakan salah satu agen yang digunakan untuk biokontrol terhadap penyakit busuk akar (Papavizas 1985 dalam Harjono & Widyastuti 2001). Walaupun mekanisme mikoparasit belum dimengerti secara lengkap, namun pada proses ini ekspresi ekstraseluler dinding sel melibatkan enzim, yaitu termasuk enzim kitinolitik dan glukanolitik. Mekanisme

penghambatan agen biokontrol pada bakteri tidak melalui hiperparasitik, tetapi melalui antibiosis dengan mengeluarkan antibiotik. Hifa G. boninense yang mengalami kontak langsung dengan antibiotik akan mengalami kerusakan dan membran hifa menjadi pecah sehingga cairan sel keluar (Susanto et al. 2002). Mekanisme penghambatan mikroorganisme oleh senyawa antimikrobial dapat disebabkan oleh beberapa faktor, antara lain penghambatan terhadap sintesis penyusun dinding sel, peningkatan permeabilitas membran sel yang dapat menyebabkan kehilangan komponen penyusun sel, menginaktivasi enzim, destruksi, penghambatan terhadap sintesis protein (penghambatan translasi dan transkripsi material genetik), dan penghambatan terhadap sintesis asam nukleat (Brooks et al. 2005). Mikroba Patogen Uji Rhizoctonia solani merupakan cendawan patogen yang mempunyai kisaran inang sangat luas, seperti menyebabkan penyakit rebah kecambah (dumping off) pada tanaman kacang-kacangan, menyerang tunas pada tanaman tomat (Solanum lycopersicon) (Asaka & Shoda 1996; Yu et al. 2002), dan menyebabkan penyakit sheath blight atau busuk pelepah pada tanaman padi (Gnanamanickam 2009). Pyricularia oryzae adalah cendawan penyebab penyakit blast. Cendawan ini dapat menyerang daun (leaf blast), buku (node blast), leher malai (neck blast), bulir padi (spikelet blast) (Chen 1993; Scardaci et al. 1997), dan kolar daun (collar rot) (Scardaci et al. 1997). Cendawan ini juga mengakibatkan kerusakan pada tanaman serealia lain seperti gandum dan sorgum (Kahmann & Basse 1997) serta 40 spesies gulma rumput-rumputan dan gulma lainnya (Ou 1985). P. oryzae menghasilkan toksin Pyricularian yang mendukung pertumbuhan tanaman dengan sangat lemah tetapi bersifat fitotoksik pada konsentrasi yang tinggi (Singh 2001).

16

Faktor pemicu serangan penyakit P. oryzae adalah pemupukan N yang terlalu tinggi serta curah hujan dan kelembaban yang tinggi. Gejala serangannya yaitu bercak seperti mata pada daun padi (Andoko 2002). Ganoderma boninense merupakan cendawan yang menyerang tanaman sawit. Cendawan ini mengakibatkan suatu penyakit yang disebut basal stem rot (BSR) atau busuk pangkal batang (Semangun 2000). Menurut Alexopoulos et al. (1996), G. boninense termasuk salah satu kelompok jamur kayu kelas

Basidiomycetes, ordo Polyporales, famili Polyporaceae, divisi Eumycophyta. Pada umumnya famili Polyporaceae memiliki tubuh buah berbentuk seperti kipas dan kertas, papan atau payung. Tubuh buah G. boninense dapat ditemukan di bagian batang kelapa sawit dan berwarna putih. Semakin tua badan buah akan bertambah besar ukurannya dan warnanya menjadi lebih gelap (Gambar 1). Gejala khas pada penyakit BSR adalah adanya pembusukan pada pangkal batang sebelum terbentuknya tubuh buah jamur. Ganoderma spp. menyebabkan kerusakan serius pada banyak perkebunan di Malaysia, India, Australia dan Indonesia. Hingga saat ini belum ditemukan cara untuk menyembuhkan penyakit ini. Oleh karena itu, penggunaan bakteri endofit sebagai agen biokontrol diharapkan mampu menekan perkembangan cendawan sehingga mengurangi dampak penyakit yang ditimbulkan. Tanaman Padi Padi termasuk dalam suku padi-apadian atau Poaceae. Padi memiliki akar serabur, daun berbentuk lanset atau sempit memanjang, urat daun sejajar, memiliki pelepah daun, bunga tersusun sebagai bunga majemuk dengan satuan bunga berupa floret atau spikelet, serta buah dan biji yang sulit dibedakan karena merupakan bulir atau kariopsis (Gardener et al. 1991).

Gambar 1 Tanaman kelapa sawit yang terserang busuk pangkal batang

17

Setiap bunga padi memiliki enam kepala sari (anther) dan kepala putik (stigma) bercabnag dua berbentuk sikat botol. Kedua organ seksual ini umumnya siap reproduksi dalam waktu yang bersamaan. Padi merupakan tanaman berpenyerbukan sendiri, karena 95% atau lebih serbuk sari membuahi sel telur tanaman yang sama. Satu set genom padi terdiri dari 12 kromosom. Padi merupakan tanaman diploid sehingga setiap sel padi memiliki 12 pasang kromosom kecuali sel seksual (Tjitrosoepomo 1987). Penyakit Tungro Penyakit tungro dapat disebabkan oleh infeksi dua jenis virus tungro, yaitu rice tungro bacilliform virus (RTBV) dan rice tungro spherical virus (RTSV). Infeksi keduanya mengakibatkan gejala yang serius sedangkan infeksi salah satu jenis virus menyebabkan gejala ringan atau tidak jelas, tergantung partikel yang menginfeksi (Hibino 1987). Secara umum, tanaman padi yang hanya terinfeksi RTSV tidak menampakkan gejala khas tungro melainkan kerdil ringan. Sementara itu infeksi oleh RTBV saja menampakkan gejala tungro ringan. Apabila tanaman padi terinfeksi keduanya bersamaan maka timbul gejala berupa kekerdilan, perubahan warna daun menjadi kuning atau kuning-orange, daun khususnya daun yang muda dapat menunjukkan belang (mottle) dan klorosis antar tulang daun, penurunan jumlah anakan dan tinggi tanaman berkurang karena jarak antar ruas (internode) memendek (Hibino 1987). Selain itu, pengisian gabah menjadi tidak sempurna sehingga berdampak pada penurunan hasil (Ling 1979). RTSV termasuk famili Sequiviridae, genus Waikavirus (van

Regenmortel et al. 2000). RTSV mempunyai genom poliadenil ssRNA dengan panjang 12 kb yang menyandikan poliprotein besar yaitu 390 kDa, unipartit, terbungkus dalam partikel isometrik dengan diameter 30 nm. Bagian genom RTSV terbesar berukuran 10,422 kb. Genom RTSV juga mengandung 2 open reading frames (ORFs) yang pendek pada ujung 3-end dan mempunyai lebih kurang 600-700 asam amino (aa) dari protein struktural dalam poliprotein besar (van Regenmortel et al. 2000; Hull 2004). Cabautan et al. (1995) melaporkan bahwa di Mindanao, Filipina ditemukan dua strain RTSV yaitu strain Vt6 dan strain A yang diisolasi dari tanaman yang terinfeksi virus tungro.

18

Padi Kultivar TKM6 yang terinfeksi RTBV dan strain Vt6 menyebabkan gejala agak kerdil dan perubahan warna daun. RTBV termasuk famili Caulimoviridae dan genus Badnavirus (van Regenmortel et al. 2000). Partikel RTBV berbentuk seperti basil dan tidak berselubung. Partikel ini berukuran lebar 30 nm dan panjang kira-kira 130 nm. Partikel berisi suatu genom DNA utas ganda (double stranded) sirkular, panjang 8 kb dengan dua bagian yang terputus (sitespecific discontinuitis) hasil dari proses replikasi oleh transkripsi balik. Protein P1, P2, P3, dan P4 disintesis oleh mekanisme translasi khusus dari suatu pregenomik RNA yang digunakan sebagai cetakan untuk replikasi virus dan juga disajikan sebagai suatu polisistronik mRNA. Peranan protein P1 dan P4 belum diketahui. Protein P3 berisi domain yang berhubungan dengan movement protein (MP), coat protein (CP), aspartic protease (PR), reverse transcriptase (RT), RNase H (RH), urutan dari N terminus sampai C terminus. Protease virus sebagian bertanggungjawab untuk prosesing P3. RTBV mengandung satu spesies coat protein 37 kDa. ORF 2 menyandi suatu protein 12-kDa (P2) dengan fungsi yang belum diketahui pasti (Herzog et al. 2000). Menurut Mokhopodhyay (1995), kedua jenis partikel virus tersebut tidak memiliki kekerabatan serologi. Kedua partikel virus tersebut dapat berada dalam suatu sel secara bersama-sama tanpa mengakibatkan terjadinya proteksi silang antara satu dengan yang lain. RTBV terdapat pada jaringan pembuluh (floem dan silem) dan RTSV hanya terdapat dalam jaringan floem. Dalam sel-sel terinfeksi, kedua partikel RTBV dan RTSV tersebar atau terkumpul dalam sitoplasma. Partikel RTSV juga terdapat dalam vakuola (Dahal et al. 1997).

Polymerase Chain Reaction (PCR) PCR adalah teknik cepat untuk mengamplifikasi fragmen DNA spesifik secara in vitro dengan menggunakan dua primer untai tunggal pendek (primer reverse dan forward). Sejumlah kecil fragmen DNA yang diinginkan dapat diamplifikasi secara eksponensial sampai jutaan kali dalam beberapa jam menggunakan teknik ini. Komponen-komponen yang dibutuhkan untuk PCR yaitu fragmen DNA yang akan diamplifikasi (DNA template), sepasang primer oligonukleotida sintetik, enzim DNA polymerase yang tahan panas (Taq

19

polymerase), semua macam nukleotida (dATP, dGTP, dCTP, dan dTTP), serta buffer reaksi yang mengandung MgCl2. Alat yang digunakan untuk proses PCR disebut thermocycler. Alat ini mampu secara cepat mengubah temperatur yang dibutuhkan untuk siklus berulang PCR (Sulistiyaningsih 2007). Perbanyakan fragmen DNA dilakukan secara selektif dan spesifik oleh sepasang oligonukleotida yang disebut primer. Enzim polimerase yang digunakan untuk mengatalisis penempelan dua buah primer pada proses PCR salah satu jenisnya adalah Taq polimerase. Enzim ini berasal dari Thermus aquatiqus.Taq polimerase memiliki stabilitas termal yang tinggi, aktivasinya pada saat siklus pemanasan pada suhu 95oC (Mikkelsen & Corton 2004). Tahap denaturasi merupakan tahap awal reaksi yang berlangsung pada suhu tinggi, yaitu 94 oC hingga 96 oC. Umumnya dilakukan sampai 5 menit untuk memastikan semua utas DNA terpisah. Tahap denaturasi bertujuan untuk memisahkan utas ganda DNA menjadi utas tunggal dengan memutuskan ikatan hidrogen antar pasangan basa. Chakrabarti (2004) menyebutkan bahwa peran energi panas dapat menggantikan fungsi enzim helikase, girase, dab protein pelindung utas tunggal (PPUT) sekaligus pada proses replikasi DNA secara in vitro.

Gambar 2 Proses umum PCR

20

Tahap kedua adalah penempelan primer atau annealing pada suhu sekitar 42 oC hingga 65 oC. Suhu penempelan ini bersifat spesifik yang merupakan ratarata dari nilai Tm (temperature melting) yang dimiliki masing-masing primer, yaitu forward (5-end) dan reverse (3-end). Primer menempel pada bagian DNA cetakan yang memiliki urutan basa komplementer dengan urutan basa primer. Tahap ini di dalam replikasi sel berfungsi sebagai inisiasi sintesis DNA oleh primase untuk membentuk RNA primer pada situs ori (Chakrabakti 2004). Tahap ketiga adalah perpanjangan primer atau primer extention yang bertujuan memberikan kondisi optimum bagi kerja enzim Taq polimerase dalam memanjangkan primer guna membentuk utas DNA baru. Chakrabakti (2004) menyebutkan bahwa peran Taq polimerase dapat menggantikan fungsi enzim DNA polimerase III, DNA polimerase I, dan ligase di dalam replikasi sel. Amplifikasi DNA dilakukan dengan pengulangan tahapan PCR dalam 30-40 siklus. Proses umum PCR ditunjukkan pada Gambar 2. Elektroforesis Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk mengetahui keberadaan dan membedakan jenis asam nukleat yang didapat dari hasil ekstraksi serta digunakan untuk menganalisis produk hasil pemotongan dengan enzim retriksi. Gel agarosa umumnya digunakan untuk menganalisis fragmen-fragmen berukuran besar (lebih dari 200 bp). Konsentrasi dari agarosa di dalam gel menentukan ukuran pori-pori rata-rata. Ukuran pori-porinya lebih besar dari pori-pori pada gel poliakrilamid sehingga asam nukleat dan protein yang terlalu besar untuk dipisahkan oleh gel poliakrilamid dapat dipisahkan menggunakan gel ini. Gel agarosa mengandung gugus-gugus bermuatan terutama sulfat dan beberapa gugus karboksilat. Gugusgugus ini berinteraksi dengan gugus-gugus bermuatan pada protein sehingga menimbulkan efek pertukaran ion (Mikkelsen & Corton 2004). Bahan-bahan yang digunakan untuk membuat gel agarosa yaitu agarosa 1%, larutan 1 x Tris-AsetatEDTA (TAE) buffer, dan Etidium Bromida (Et-Br) 1 l/30 mL. Pita-pita (band) yang terbentuk pada lajur-lajur (lane) menunjukkan DNA yang bermigrasi. Pita-pita yang berjarak sama dari sumur gel pada akhir elektroforesis mengandung molekul-molekul yang bergerak di dalam gel kecepatan yang sama. Hal ini menunjukkan bahwa molekul-molekul tersebut

21

berukuran relatif sama. "Marka" atau penanda (marker) merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda yang digunakan untuk menentukan ukuran molekul dalam pita sampel. Pita-pita pada lajur marka tersebut dapat dibandingkan dengan pita sampel untuk menentukan ukurannya. Jarak pita dari sumur gel berbanding lurus terhadap logaritma ukuran molekul.

22

BAHAN DAN METODE


Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan untuk uji aktivitas daya hambat metabolit bakteri endofit, yaitu isolat bakteri endofit E65 dan E94, biakan Pyricularia oryzae, biakan Ganoderma boninense, ekstrak daging sapi, pepton, dekstrosa, ekstrak khamir, bakto agar, triptosa, NaCl, kentang, ZnSO 4.7H2O, CaCO3, akuades, ammonium sulfat, PBS (Phospate Buffered Saline), etil asetat, agarosa, congo red, dan larutan NaCl 2 M. Alat-alat yang digunakan, yaitu cawan petri, tabung reaksi, Erlenmeyer, gelas ukur, gelas piala, otoklaf, laminar, jarum ose, bunsen, pisau, cork borrer, corong pisah, sentrifuse, rotavapor, mikropipet, tip, tabung mikrosentrifuse, kertas alumunium, kain kasa, corong, milipore (0.2 m), dan neraca analitik. Bahan-bahan yang digunakan untuk identifikasi gen ketahanan terhadap Tungro, yaitu benih padi (TN1, TW5, TW16, dan Utri Merah), DNA padi Utri Rajapan, tanah sawah, etanol 70%, buffer ekstraksi DNA, buffer TE (TrisEDTA), SDS (Sodium Dodesil Sulfat), PVP (Polyvinylpyrrolidon) 20%, KOAc 5 M, kloroform:isoamil alkohol 24:1, fenol, NAOAc 3 M, isopropanol, dH2O, loading dye, 1 x buffer TAE (Tris-Asetat EDTA), agarosa, marker 1 kb DNA Ladder (0.2 mg/ml), etidium bromida, 5 x buffer GC (7.5 mM MgCl2), dNTP mix 10 mM/500 mL, Taq polimerase (2 U/L), primer UR-marker (RS-SF/RS-SR: 5'GGCCGGAAAGTCTTAGGC-3' / 5'-TCGTGGATTCCTCATAACTCC-3'),

primer S-marker (SF/SR2: 5'-ATTGGTGCCTCAGAGAGTCTTG-3 / 5'GGACTTGGGTGATCAACAACTT-3'), dan primer R-marker (RS-A2_F1/RSA2_R1:5'-TTTGGCCGGAAAGTCTTGGGC-3' / 5'-TGGCAGTGCACCAGCCA AATGG - 3'). Komposisi tiap larutan ditunjukkan pada Lampiran. Alat-alat yang digunakan untuk identifikasi gen ketahanan terhadap Tungro, yaitu bak plastik, gunting, mortar, microfuge, mikropipet, vortex, UV Illuminator Chemidoc EQ Biorad, elektroforesis, tip, Erlenmeyer, tabung mikro, neraca analitik, kertas alumunium, penangas air, termos es, microwave, gelas ukur, baki gel agarosa, dan mesin PCR.

23

Metode Pembuatan Media Luria Bertani (LB) Sebanyak 2 g triptosa, 5 g ekstrak khamir, dan 2 g NaCl dilarutkan dalam 200 ml akuades. Media tersebut dibagi menjadi empat bagian dan dimasukkan ke dalam lima Erlenmeyer berbeda lalu disterilkan dengan menggunakan otoklaf selama 10 menit pada tekanan 1 atm. Pembuatan Media Potato Dextrose Broth Sebanyak 100 g kentang dipotong menjadi potongan kecil lalu direbus dalam 400 ml akuades hingga mendidih. Air rebusan kentang tersebut lalu disaring menggunakan kain kasa dan volumenya ditepatkan menjadi 400 ml menggunakan akuades. Sebanyak 8 g dekstrosa dilarutkan ke dalam air rebusan kentang. Media tersebut dibagi menjadi empat bagian dan dimasukkan ke dalam empat Erlenmeyer berbeda lalu disterilkan menggunakan otoklaf selama 15 menit pada tekanan 1 atm. Pembuatan Media Potato Dextrose Agar (PDA) Pembuatan media PDA dilakukan dengan cara menambahkan 1.5% agar pada media Potato Dextrose Broth. Media disterilkan dan dimasukkan ke dalam cawan petri secara steril di dalam laminar lalu didiamkan hingga menjadi padat. Pembuatan Media Produksi Antibiotik (Hsu & Lockwood 1969) Media produksi metabolit terdiri atas 1.5 g ekstrak daging sapi, 2.5 g ekstrak khamir, 2.5 g pepton, 5 g glukosa, 5 g NaCl, 0.01 g ZnSO 4.7H2O, 3.5 g dan CaCO3 3.5 g. Semua bahan dilarutkan dalam 1 L akuades lalu dibagi menjadi empat bagian dan dimasukkan ke dalam empat Erlenmeyer berbeda. Media tersebut lalu disterilkan dalam otoklaf selama 10 menit pada tekanan 1 atm. Kultur Cendawan Kultur cendawan dilakukan pada media PDA. Potongan miselia P. oryzae dan G. boninense diletakkan pada media PDA secara steril. Media tersebut lalu diinkubasikan pada suhu ruang selama 5-7 hari.

24

Uji Antagonisme Bakteri Endofit Kedua isolat bakteri endofit diuji sifat antagonisnya terhadap P. oryzae dan Rhizoctonia solani. Kedua cendawan diinokulasikan pada bagian tengah cawan petri berbeda yang berisi PDA, ukuran miselia yang diinokulasikan berdiameter 5 mm. Bakteri uji digoreskan pada media berjarak 3 cm dari miselia dengan panjang 4 cm lalu diinkubasi selama 5-7 hari pada suhu ruang. Skema uji ditunjukkan pada Gambar 3. Produksi Antibiotik G. boninense ditumbuhkan pada empat erlenmeyer berisi 100 mL media PDB dengan cara memasukkan potongan miselia ke dalam media. Cendawan terebut di inkubasi selama 3 hari. Hari ke-2 inkubasi, isolat E65 dan E94 ditumbuhkan masing-masing pada dua Erlenmeyer yang berisi 50 mL media LB dan diinkubasi selama 24 jam. Hari ke-3 inkubasi, miselia cendawan yang terbentuk disaring menggunakan kain kasa steril lalu masing-masing dimasukkan ke dalam empat Erlenmeyer berisi 250 mL media produksi antibiotik. Dua Erlenmeyer dicampur dengan biakan isolat E65 dan sisanya dengan biakan isolat E94. Campuran biakan tersebut diinkubasi selama 3 hari. Semua proses inkubasi dilakukan pada suhu ruang.

Gambar 3 Skema uji antagonisme bakteri endofit terhadap cendawan

25

Ekstraksi Protein dan Antiobiotik Bakteri Endofit a. Ekstraksi Protein Campuran biakan yang sudah diinkubasi selama 3 hari disaring untuk memisahkan miselia cendawan lalu disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 20 menit pada suhu 4 oC. Ekstraksi protein dari media biakan dilakukan dengan menambahkan ammonium sulfat sebanyak 70% pada supernatan. Larutan tersebut distirrer bersamaan dengan penambahan ammonium sulfat sedikit demi sedikit hingga semua ammonium sulfat terlarut. Larutan tersebut lalu didiamkan semalam pada suhu 4 oC agar endapan protein yang terbentuk semakin banyak. Endapan protein yang terbentuk dipisahkan dengan cara disentrifugasi 12000 rpm selama 15 menit pada suhu 4 oC. Pelet yang terbentuk dilarutkan dalam 4 ml buffer fosfat lalu disaring menggunakan mikrofilter steril. Ekstrak disimpan pada suhu 4oC dan digunakan untuk uji selanjutnya. b. Ekstraksi Antibiotik Campuran biakan yang sudah diinkubasi selama 3 hari disaring untuk memisahkan miselia cendawan lalu disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 20 menit pada suhu 4 oC. Antibiotik bakteri diekstrak dari supernatan dengan menggunakan 150 mL etil asetat. Campuran dihomogenkan menggunakan magnetic stirrer selama dua jam. Setelah dua jam, pelarut dipisahkan dari media biakan menggunakan corong pisah. Antibiotik yang terlarut dalam etil asetat dipekatkan dengan evaporator hinggs volume yang tersisa 5 mL. Ekstrak tersebut disimpan pada suhu 4 oC dan digunakan untuk uji selanjutnya. Uji Aktivitas Daya Hambat Ekstrak Protein dan Ekstrak Etil Asetat Potongan miselia cendawan P. oryzae dan G. boninense dengan diameter 5 mm masing-masing diletakkan di bagian tengah cawan petri berisi PDA. Kemudian 1.5 cm dari miselia tersebut dibuat dua lubang yang berseberangan dengan menggunakan cork borrer berdiameter 5 mm. Salah satu lubang diisi dengan ekstrak yang akan diuji sedangkan lubang yang lain digunakan sebagai kontrol. Cendawan tersebut lalu diinkubasi selama 3 hari pada suhu ruang.

26

Gambar 4 Skema uji aktivitas daya hambat ekstrak terhadap pertumbuhan miselia cendawan

Persen penghambatan dihitung dengan menggunakan rumus berikut: % penghambatan cendawan: Keterangan: RK = jari-jari miselia cendawan ke arah kontrol RI = jari-jari miselia cendawan ke arah ekstrak Penanaman Padi Benih padi dari beberapa varietas ditanam pada bak berisi tanah sawah. Padi yang digunakan, yaitu padi TN1, TW5, TW16, dan UM. Setiap varietas padi ditanam 10 benih lalu dibiarkan tumbuh hingga muncul daun kedua ( 2 minggu). Daun padi tersebut lalu digunakan untuk isolasi DNA padi. Isolasi DNA Padi Padi berumur 2 minggu dipotong bagian daunnya. Daun tersebut lalu dipotong kecil-kecil dan dihaluskan dengan menggunakan mortar steril yang didinginkan dalam freezer sebelumnya. Sebanyak 1 ml buffer ekstraksi DNA ditambahkan dan digerus hingga benar-benar halus dan tercampur. Suspensi ditambah dengan larutan SDS 1/10 volume dan 100 L PVP dan dikocok perlahan lalu diinkubasi selama 15 menit pada suhu 50-65 oC. Larutan KOAc sebanyak 1/10 volume suspensi ditambahkan lalu diinkubasi dalam es selama 30 RK RI 100% RI

27

menit. Suspensi selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm (900 g) selama 10 menit. Supernatan diambil dan ditambah dengan 200 L kloroform dan 200 L fenol, lalu disentrifugasi kembali pada kecepatan 12000 rpm selama 10 menit. Supernatan ditambah dengan NAOAc 1/10 volume total lalu isopropanol 1x volume total. Suspensi diinkubasi kembali dalam es selama 15 menit kemudian disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm selama 10 menit. Pelet yang terbentuk dicuci dengan larutan etanol 70% 500 L lalu disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm selama 10 menit. Pelet yang didapat dikeringkan lalu diresuspensi dengan 15-20 L buffer TE (Tris-EDTA). Amplifikasi DNA dengan PCR DNA padi yang telah diisolasi lalu diamplifikasi dengan menggunakan 3 jenis primer, yaitu primer UR-marker, primer S-marker, dan primer R-marker. Selain menggunakan DNA padi yang sebelumnya ditanam, digunakan juga DNA padi dari varietas Utri Rajapan. Reaksi PCR dibuat dengan total reaksi 21 L, yang mengandung 12 L dH2O, 4 L 5 x buffer GC, 0.5 L dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dan dTTP) 10 mM, 2 L primer (F+R) 20 M, 0.5 L enzim Taq polimerase, dan 2 L DNA sampel. Campuran reaksi dibuat pada tabung mikro 200 L yang akan diletakkan pada mesin PCR. Mesin PCR dijalankan dengan program sebagai berikut: denaturasi I pada suhu 94 oC selama 5 menit, denaturasi II pada suhu 94 oC selama 1 menit 30 detik, annealing pada suhu 55 oC selama 45 detik, dan extention pada suhu 72 oC selama 1 menit 30 detik. Keempat tahap ini dilakukan sebanyak 29 siklus yang dilanjutkan dengan tahap extention akhir yang dilakukan pada suhu 72 oC selama 1 menit. Tahapan terakhir (end) dilakukan pada suhu 15 oC. Elektroforesis produk PCR Pembuatan gel dilakukan dengan cara melarutkan 1% agarosa dalam larutan 1 x buffer TAE lalu dipanaskan hingga mendidih dan semua agarosa terlarut. Setelah dipanaskan, agarosa didinginkan beberapa saat lalu ditambahkan etidium bromida, selanjutnya dimasukkan dalam cetakan gel dan dibiarkan hingga memadat. Gel yang sudah terbentuk lalu direndam dengan larutan 1 x TAE buffer dalam alat elektroforesis. Kemudian sampel yang telah ditambah loading dye 2

28

L dimasukkan ke dalam sumur gel, terlebih dahulu sampel dicampur dengan 2 L loading dye. Sampel dielektroforesis bersamaan dengan 2 L marker 1 kb yang telah dicampur dengan loading dye. Elektroforesis dijalankan dengan tegangan 90 V selama 30 menit. Visualisasi DNA dilakukan dengan menggunakan UV Illuminator ChemiDoc Biorad.

29

HASIL DAN PEMBAHASAN


Uji Antagonisme Bakteri Endofit Uji antagonisme bakteri endofit dilakukan terhadap cendawan R. solani dan P. oryzae. Bakteri yang diuji yaitu isolat E65 dan E94. Isolat E65 merupakan bakteri Bacillus firmus sedangkan isolat E94 diduga juga masih dalam kelompok Bacillus. Kedua bakteri ini merupakan bakteri endofit yang diisolasi dari tanaman padi. Hasil pengujian secara in vitro menunjukkan bahwa kedua isolat bakteri tersebut mampu menghambat pertumbuhan R. solani dan P. oryzae. Daya hambat isolat E94 terhadap kedua cendawan lebih besar dibandingkan dengan daya hambat isolat E65. Hal ini terlihat dari luas zona bening yang terbentuk (Gambar 5). Luas koloni isolat E94 lebih kecil dibandingkan isolat E65 namun memiliki luas zona bening yang lebih besar. R. solani merupakan cendawan patogen yang mempunyai kisaran inang sangat luas, seperti pada tanaman kacang-kacangan menyebabkan penyakit rebah kecambah (dumping off), menyerang tunas pada tanaman tomat (Solanum lycopersicon) (Asaka and Shoda 1996; Yu et al. 2002), dan menyebabkan penyakit sheath blight atau busuk pelepah pada tanaman padi (Gnanamanickam 2009). P. oryzae (anomorph dari Magnaporte grisea) adalah cendawan penyebab penyakit blast. Cendawan ini dapat menyerang daun (leaf blast), buku (node blast), leher malai (neck blast), bulir padi (spikelet blast) (Chen 1993; Scardaci et al. 1997), dan kolar daun (collar rot) (Scardaci et al. 1997). P. oryzae menghasilkan toksin Pyricularian yang mendukung pertumbuhan tanaman dengan sangat lemah tetapi bersifat fitotoksik pada konsentrasi yang tinggi (Singh 2001). Faktor pemicu serangan penyakit P. oryzae adalah pemupukan N yang terlalu tinggi serta curah hujan dan kelembaban yang tinggi. Gejala serangannya yaitu bercak seperti mata pada daun padi (Andoko 2002). Bakteri dari kelompok Bacillus dan Pseudomonas telah dilaporkan efektif menghambat pertumbuhan dan perkembangan P. oryzae dan R. solani (Yuliar 2008; Gnanamanickam 2009). B. pantotheinticus dan B. brevis dapat

menghambat pertumbuhan R. solani dengan cara menghasilkan suatu senyawa antibiotik yang disebut surfaktin. Surfaktin yang memiliki kerja sebagai suatu biosurfaktan dapat merusak permeabilitas membran sel dengan cara menurunkan

30

Gambar 5 Hasil uji antagonisme bakteri endofit: (a) E65 vs Rs; (b) E65 vs Po; (c) E94 vs Rs; (d) E94 vs Po

tegangan permukaan (Huang et al. 1993). Surfaktin dapat berperan sebagai anti jamur dengan cara membentuk misel dengan komponen membran sel jamur. Bacillus akan menghasilkan metabolit sekunder surfaktin yang tinggi setelah pertumbuhannya mencapai fase stasioner. Genus Bacillus, umumnya merupakan kooproduser senyawa antibiotik polipeptida (Feignier et al. 1996). Selain surfaktin, Nishijima et al. (2005) mengatakan bahwa spesies Bacillus menghasilkan sedikitnya 66 jenis antibiotik dan strain tertentu dari Bacillus merupakan agen biokontrol. Mekanisme daya hambat isolat E65 dan E94 belum diketahui secara pasti bersifat antibiotik atau enzimatis. Produksi dan Ekstraksi Metabolit serta Uji Aktivitas Daya Hambatnya Produksi metabolit dilakukan dengan cara menginduksi bakteri endofit menggunakan miselia G. boninense. Cendawan ini digunakan karena

pertumbuhan miselia yang relatif lebih cepat. Penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa kedua bakteri endofit yang diuji juga mampu menghambat

31

pertumbuhan cendawan ini. Miselia dicampurkan bersama biakan bakteri lalu ditumbuhkan dalam media produksi antibiotik dan diinkubasi selama tiga hari pada suhu ruang. Media ini didasarkan pada penelitian Hsu & Lockwood (1969) yang meneliti tentang produksi antibiotik dari Streptomycetes. Ekstraksi senyawa inhibitor dilakukan terhadap protein dan metabolit sekunder yang dihasilkan oleh kedua bakteri uji. Ekstraksi protein dilakukan menggunakan ammonium sulfat. Ekstrak protein yang diperoleh lalu disaring menggunakan milipore (0.2 m) steril sehingga diperoleh ekstrak yang steril. Ammonium sulfat yang ditambahkan berfungsi untuk mengendapkan protein yang ada dalam media. Penambahan garam berlebih akan menyebabkan penurunan kelarutan protein yang disebut salting out. Saat terjadi salting out, terjadi kompetisi di antara protein dan garam dalam menarik molekul air untuk proses pelarutan, maka interaksi protein dengan protein akan cenderung lebih diutamakan. Ammonium sulfat banyak digunakan untuk fraksinasi protein. Garam ini memiliki kelarutan yang sangat tinggi (Bintang 2010). Ekstaksi antibiotik dilakukan menggunakan pelarut etil asetat. Pelarut ini banyak digunakan pada proses ekstraksi senyawa metabolit dari mikroba. Metode ini didasarkan pada distribusi zat terlarut dengan perbandingan tertentu antara dua pelarut yang tidak saling bercampur (Khopkar 2003). Ekstrak dipekatkan dengan cara menguapkan etil asetat menggunakan rotavapor. Kedua ekstrak yang diperoleh diuji aktivitas daya hambatnya terhadap pertumbuhan P. oryzae dan G. boninense. G. boninense merupakan cendawan yang menyerang tanaman sawit. Cendawan ini mengakibatkan suatu penyakit yang disebut basal stem rot (BSR) atau busuk pangkal batang. Hingga saat ini belum ditemukan cara untuk menyembuhkan penyakit ini. Oleh karena itu, penggunaan bakteri endofit sebagai agen biokontrol diharapkan mampu menekan perkembangan cendawan sehingga mengurangi dampak penyakit yang

ditimbulkan. Berdasarkan penelitian Sapak et al. (2008), Pseudomonas aeruginosa dan Burkholderia cepacia yang diisolasi dari jaringan akar kelapa sawit diketahui memiliki potensi sebagai agen biokontrol terhadap cendawan ini. Hasil uji aktivitas daya hambat ekstrak protein dan ekstrak etil asetat menunjukkan bahwa kedua jenis ekstrak dari isolat E94 dapat menghambat

32

pertumbuhan P. oryzae. Hal ini ditunjukkan dengan adanya zona penghambatan terhadap pertumbuhan miselia (Gambar 6). Akan tertapi, kedua ekstrak tersebut tidak menunjukkan adanya daya hambat terhadap pertumbuhan G. boninense. Hal ini menjadi suatu dugaan bahwa antibiotik yang dihasilkan mungkin tidak membutuhkan induksi dari luar. Terbukti dengan tidak adanya aktivitas penghambatan terhadap G. boninense meskipun pada saat proses produksi antibiotik ditambahkan dengan miselianya.

Tabel 1 Hasil uji daya hambat metabolit bakteri endofit terhadap kedua cendawan Bakteri endofit Cendawan patogen % penghambatan Po 48 Ekstrak etil asetat Go E94 Po 52.67 Ekstrak protein Go Po Ekstrak etil asetat Go E65 Po Ekstrak protein Go -

(a)

(b)

(c)

(d)

Gambar 6 Hasil uji daya hambat metabolit bakteri E94: (a) EA vs Po; (b) P vs Po; (c) EA vs Go; (d) P vs Go

33

(a)

(b)

(c)

(d)

Gambar 7 Hasil uji daya hambat metabolit bakteri E65: (a) EA vs Po; (b) P vs Po; (c) P vs Go; (d) EA vs Go

Dugaan berikutnya adalah senyawa antibiotik yang terekstrak tidak cukup efektif untuk menghambat pertumbuhannya. Kedua jenis ekstrak dari isolat E65 tidak menunjukkan aktivitas daya hambat terhadap pertumbuhan kedua cendawan (Gambar 7). Tidak adanya aktivitas daya hambat yang terlihat mungkin dikarenakan pelarut yang kurang sesuai sehingga senyawa antibiotik yang terekstrak belum cukup efektif untuk menghambat kedua cendawan atau media yang d igunakan masih belum optimum untuk memproduksi senyawa antibiotik. Ekstrak protein dari kedua bakteri diuji lebih lanjut aktivitas glukanasenya. Kedua ekstrak protein yang diuji pada agarosa yang dicampur dengan glukan menunjukkan bahwa kedua ekstrak protein dapat mendegradasi glukan. Ekstrak protein isolat E94 memiliki aktivitas yang lebih tinggi. Hal ini terlihat dari diameter zona bening yang dihasilkan lebih besar (Gambar 8). Ekstrak protein isolat E65 pada uji sebelumnya tidak menunjukkan aktivitas daya hambat pada kedua cendawan meskipun positif memiliki aktivitas glukanase. Hal ini mungkin diakibatkan aktivitas glukanase ekstrak ini tidak cukup efektif untuk menghambat pertumbuhan kedua cendawan dibandingkan dengan aktivitas glukanase ekstrak

34

protein isolat E94. Begitu pula hal yang sama terjadi pada ekstrak protein isolat E94 ketika diujikan pada G. boninense. Glukan dihidrolisis oleh enzim yang Tabel 2 Hasil uji aktivitas glukanase ekstrak protein Diameter zona bening Ekstrak protein (cm) 3.60 E94 3.70 2.70 E65 2.60

Rata-rata diameter zona bening (cm) 3.65 2.65

E94

E65

E65

E94

Gambar 8 Hasil uji ekstrak protein E94 dan E65 pada media glukan

terdapat pada ekstrak protein menghasilkan molekul-molekul glukosa bebas. Glukan yang terhidrolisis ini tidak terwarnai oleh pewarna Congo red sehingga menunjukkan zona bening. Isolasi DNA Padi Padi yang digunakan dalam penelitian ini adalah padi varietas TN1 (Taichung Native 1), TW5, TW16, Utri Merah, dan Utri Rajapan. Padi varietas TN1 merupakan padi yang memiliki gen resesif yang rentan terhadap penyakit Tungro sedangkan varietas Utri Merah dan Utri Rajapan memiliki gen ketahanan terhadap Tungro. Varietas Utri Merah dan Utri Rajapan merupakan salah satu sumber ketahanan terhadap RTSV dan RTBV (Choi 2004). Utri Merah memilik sejumlah gen yang mampu menghambat perkembangan partikel RTBV dan dua gen resesif yang mengendalikan ketahanan terhadap RTSV. Salah satu gen

35

resesif dari Utri Merah bersifat alelik dengan gen ketahanan yang bersifat resesif pada Utri Rajapan (Shahjahan et al. 1990). Hasil persilangan antara varietas TN1 dan Utri Merah menghasilkan padi TW5 sedangkan padi TW16 merupakan hasil persilangan antara varietas TN1 dengan Utri Rajapan. Padi TW5 dan TW16 diidentifikasi secara molekuler untuk mengetahui adanya gen resisten yang bersifat homozigot atau heterozigot. Hasil persilangan yang telah memiliki gen resisten yang homozigot dapat dijadikan sebagai varietas padi baru yang resisten terhadap Tungro. Tahap identifikasi diawali dengan isolasi DNA dari daun padi yang dihaluskan dengan menggunakan mortar dingin untuk menjaga agar DNA tidak rusak. Homogenisasi dengan cara ini merupakan salah satu metode lisis sel secara mekanik. Proses lisis dibantu dengan menggunakan larutan buffer ekstraksi DNA yang melisis membran sel dan membran fosfolipid bilayer. Larutan SDS kemudian digunakan untuk menarik molekul-molekul lipid penyusun membran, sehingga mengakibatkan kerusakan membran sedangkan penambahan larutan PVP berfungsi untuk menarik senyawa fenolik dari sampel. Proses lisis dilakukan pada suhu inkubasi 65 oC selama 15 menit untuk optimalisasi kerja larutan lisis. Dellaporta et al. (1983) menggunakan kalsium asetat (KOAc) 5 M untuk menurunkan kelarutan protein (salting out) dengan adanya penambahan larutan SDS sebelumnya. Garam ini berikatan dengan protein membentuk senyawa baru yang memiliki kelarutan yang lebih rendah sehingga menyebabkan protein mengendap. Suspensi tersebut lalu disentrifugasi untuk mengendapkan membran dan dinding sel serta protein yang diendapkan oleh KOAc. Pemurnian DNA dilanjutkan dengan menambahkan pelarut fenol:kloroform:isoamilalkohol

(25:24:1) untuk menghilangkan sisa-sisa protein. Gumpalan putih yang terbentuk diantara kedua fasa tersebut merupakan protein yang telah terdenaturasi (Saunders 1999). Selain melarutkan protein, fenol juga dapat melarutkan lipid dan polisakarida sehingga diharapkan supernatan berisi DNA murni. DNA dan RNA tidak terdenaturasi karena molekul ini tidak larut di dalam pelarut organik seperti fenol. Kloroform:isoamilalkohol (24:1) berperan juga dalam menghilangkan kontaminasi senyawa fenolik dan pigmen tanaman (Tel-Zu Sentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm setelah et al. 1999). penambahan

36

fenol:kloroform:isoamilalkohol

(25:24:1)

dilakukan

untuk

optimalisasi

homogenasi sehingga protein, lipid, dan polisakarida dapat larut dalam pelarut tersebut. DNA akan berada pada lapisan air yang berada pada lapisan paling atas. Penambahan natrium asetat (NaOAc) 3 M berfungsi untuk menghilangkan sisa-sisa protein yang tidak larut sebelumnya. Penambahan isopropanol yang dilanjutkan dengan inkubasi dalam es akan menyebabkan terjadinya presipitasi DNA. Proses presipitasi ini bertujuan untuk menghilangkan fenol-kloroform sehingga tidak akan menghambat kerja enzim-enzim restriksi atau enzim lain yang digunakan untuk analisis molekuler. DNA diendapakan dengan sentrifugasi pada kecepatan tinggi lalu di cuci dengan etanol 70% untuk menghilangkan sisasisa reagen yang sebelumnya digunakan. DNA yang telah dicuci tersebut lalu diendapkan kembali dan diresuspensi dalam buffer TE untuk menghambat nuklease dengan cara mengkelat ion Mg dan Ca oleh EDTA. Amplifikasi DNA dengan PCR Analisis DNA hasil isolasi dengan PCR dilakukan untuk mengetahui keberadaan gen ketahanan terhadap tungro pada padi hasil persilangan, yaitu padi varietas TW5 dan TW16. Persilangan ini diarahkan untuk menghasilkan suatu varietas baru dengan spektrum ketahanan yang lebih luas dan sifat ketahanan yang lebih lama dibandingkan dengan varietas yang telah ada. Varietas TN1 digunakan sebagai kontrol negatif sedangkan Utri Merah dan Utri Rajapan digunakan sebagai kontrol positif gen resisten. Proses identifikasi ini dilakukan dengan menggunakan tiga buah primer yaitu primer S-marker, primer R-marker, dan primer UR-marker. Primer S-marker akan mengamplifikasi gen sensitif tungro dan Primer R-marker akan mengamplifikasi gen ketahanan terhadap tungro sedangkan primer UR-marker akan mengamplifikasi gen keduanya. Gambar 1, 2, dan 3 menunjukkan hasil elektroforesis produk PCR menggunakan ketiga primer. Hasil PCR dengan primer R-marker menunjukkan bahwa padi TW5-1, TW16-5, dan Utri Rajapan mengandung gen ketahanan terhadap Tungro. Ukuran molul amplikon yang diperoleh yaitu sekitar 400 bp. Hasil PCR dengan menggunakan primer S-marker menunjukkan bahwa hampir semua padi memiliki gen sensitif tungro dengan ukuran molekul amplikon sekitar 290-300 bp, kecuali padi TW16-2, TW16-3, dan UM-2. Sedangkan dengan primer

37

UR-marker diperoleh amplikon pada semua padi dengan ukuran sekitar 225 bp. Padi TW5 dan TW16 yang diuji positif memiliki gen ketahanan terhadap tungro namun dalam bentuk heterozigot karena masih diperoleh amplikon gen sensitif tungro.

Gambar 9 Elektroforegram hasil PCR dengan primer R-marker

Gambar 10 Elektroforegram hasil PCR dengan primer S-marker

Gambar 11 Elektroforegram hasil PCR dengan primer UR-marker

38

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan Praktik lapangan yang telah dilakukan banyak memberikan pengalaman dan wawasan baru di bidang pengembangan bioteknologi tanaman padi sehingga dapat memberikan gambaran yang lebih jelas mengenai berbagai hal yang telah didapat selama kuliah dan praktik laboratorium di Departemen Biokimia FMIPA IPB. Isolat E65 dan E94 yang diuji memiliki potensi sebagai agen biokontrol terhadap cendawan R. solani, G. boninensis, dan P. oryzae. Diduga mekanisme antagonis keduanya yaitu melalui produksi senyawa antiobiotik dan secara enzimatis dengan menghasilkan enzim glukanase. Senyawa antibiotik dan glukanase isolat E94 lebih besar daya hambatnya terhadap pertumbuhan cendawan patogen uji. Beberapa padi TW5 dan TW16 yang dihasilkan positif memiliki gen ketahanan terhadap Tungro namun masih heterozigot.

Saran Perlu adanya optimasi terhadap produksi senyawa metabolit dan enzim glukanase yang dihasilkan oleh kedua isolat sehingga lebih efektif dalam menghambat pertumbuhan cendawan patogen. Perlu adanya seleksi kembali galur galur ketahanan TW5 dan TW16 untuk mendapatkan galur padi yang memiliki gen ketahanan tungro yang bersifat heterozigot.

39

DAFTAR PUSTAKA
Aini LQ, Abadi AL. 2004. Keragaman Bakteri Endofit Dalam Jaringan Akar Tanaman Pisang Serta Potensi Antagonistiknya Terhadap Bakteri Patogen Penyebab Penyakit Layu Pada Tanaman Pisang. Jurnal Ilmu-Ilmu Hayati. 16(2): 113-121. Andoko A. 2002. Budidaya Padi Secara Organik. Penebar Swadaya: Jakarta. Alexopoulos CJ, Mims CW, Blackwell M. 1996. Introductory Mycology. Fourth Edition. New York: John Wiley & Son Inc. Asaka O, Shoda M. 1996. Biocontrol of Rhizoctonia solani dumping-off of tomato with Bacillus subtilis RB14. Applied and Environmental Microbiology 62 (11): 4081-4085. Bonaterra A, Mari M, Casalini L, Montesinos E. 2003. Biological control of Monilinia laxa and Rhizopus stolonifer in postharvest of stone fruit by Pantoea agglomerans EPS125 and putative mechanisms of antagonism. Int. J. Food Microbiol. 84: 93-104. Brooks GF, Butel JS, Morse SA. 2005. Mikrobiologi Kedokteran. Jilid 1. Edisi Pertama. Jakarta: Salemba Medika. Campbell R. 1989. Biological Control of Microbial Plant Pathogens. Cambridge: Cambridge University Press. Cabauatan PQ, Cabunagan RC, Koganezawa H. 1995. Biological variants of rice tungro viruses in the Philippines. Phytopathology 85(1): 77-81. Cacabuono AC, Pomilio AB. 1997. Alkaloids from endophyte-infected Festua argentina. Journal of Ethnopharmacology 57:1-9. Chakrabarti R. 2004. PCR Technology: Current Innovation. Boca Raton: CRC Pr. Chancellor TCB, Teng PS, Heong KL. 1996. Rice Tungro Disease Epidemiology and Vector Ecology. IRRI Discussion Paper Series No. 19. Los Banos: Int Rice Res. Inst. Chang R, Yeager AR, Finney NS. 2003. Probing the mechanism of a fungal glycosyltransferase essential for cell wall biosynthesis. UDP- chitobiose is not a substrate for chitin synthase. Org. Biomol. Chem. 1: 39-41. Chen D. 1993. Population structure of Pyricularia grisea (Cooke) Sacc. in two screening sites and quantitative characterization of major and minor resistance genes. [tesis]. Los Banos: University of the Philippines. Clay K. 1988. Fungal endophytes of grasses, and a defensive mutualism between plants ad fungi. Ecology 69:10-16. Cook RJ, Baker KF. 1989. The Nature and Practice of Biological Control of Plant Pathogens. St Paul: American Phytopathological Society Pr. Dahal G, Hibino H, Aguiero VM. 1997. Population characteristic and tungro transmission by Nephotettix virescens (Hemiptera: Cicadellidae) on

40

selected resistant rice kultivars. Bulletin of Entomological Research 87: 387-395. Daradjat AA, Widiarta IN, Jumanto. 2004. Prospek perbaikan varietas padi tahan virus tungro dan serangga wereng hijau. Prosiding Seminar Nasional Status Program Penelitian Tungro Mendukung Keberlanjutan Produksi Padi Nasional. Makassar, 7-8 September 2004. Dellaporta SL, Wood J, Hicks JB . 1983. A plant DNA miniprepration: version II. Plant. Mol Biol. Rep. 1: 19-21. De Vleesschauwer D, Cornelis P, Heofte M. 2006. Redox-active pyocyanin secreted by Pseudomonas aeruginosa 7NSK2 triggers systemic resistance to Magnaporthe grisea but enhances Rhizoctonia solani susceptibility in rice. Mol Plant Microbe Interact 19: 14061419. Dunn MJ. 1989. Determination of Total Protein Concentration. diacu dalam: Protein Methods. Harris ELV dan S Angal. Editor. Oxford: IRL Pr. Dwidjoseputro D. 1989. Dasar-dasar Mikrobiologi. Jakarta: Penerbit Djambatan. Fabry W, Okemo PO, Ansorg R. 1998. Antibacterial activity of East African medicinal plants. Journal of Ethnopharmacology 60: 79-84. Feignier C, Besson F, Michel G. 1996. Characterization of iturin synthetase in the wild-type Bacillus subtilis strain producing iturin and an iturin deficient mutant. FEMS Microbiolgy Letters 136: 117-122. Gardener FP, Pearce RB, Michell RL. 1991. Fisiologi Tanaman Budidaya. Jakarta: UI Pr. Gnanamanickam, SS. 2009. Biological Control of Rice Diseases. Dallas: Springer. Gohel V, Singh A, Virnal M, Ashwini P, Chhatpar HS. 2006. Bioprospecting and Antifungal Potential of Chitinolytic Microorganisms. Africans Journal of Biotechnology 5(2): 54-72. Guo et al. 2000. Cytonic acid A and B, novel tridepside inhibitor of hCMV protease from the endophytic fungus Cytonaena sp. J. Nat. Prod. 63: 602604. Hallmann JA, Hallmann Q, Miller WG, Sikora RA, Lindow SE. 2001. Endophytic Colonization of Plants by the Biocontrol Agent Rhizobium etli G12 in Relation to Meloidogyne incognita Infection. The American Phytopathological Society. 91(4): 415-422. Harjono SM, Widyastuti. 2001. Antifungal Activity of Purified Endochitinase Produced by Biocontrol Agent Trichoderma reesei Against Ganoderma philippii. Pakistan Journal of Biological Sciences. 4(10): 1232-1234. Hasanuddin A. 1999. Monitoring dan Serangan Penyakit Tungro di Nusa Tenggara Barat. Sukamandi: Balai Penelitian Tanaman Padi. Hibino H, Roechan M, Sudarisman S. 1978. Association of two types of virus particles with penyakit habang (tungro disease) of rice in Indonesia. Phytopathology 68:1412-1416.

41

Hibino H, Cabunagan RC. 1986. Rice tungro associated viruses and their relation to host plants and vector leafhopper. Trop. Agr. Res. Ser. 19:173-182. Hibino H. 1987. Rice tungro virus disease: current research and prospects. Proc. of the Workshop on Rice Tungro Virus. Maros Research Institute for Food Crops. hlm 2-6. Huang CH, Ano T, Shoda M. 1993. Nucleotide sequence and characteristics of the gene, lpa-14, responsible for biosynthesis of the lipopeptide antibiotics iturin A and surfactin from Bacillus subtilis RB14. Journal of Fermentation and Bioengineering 76: 445-450. Hull R. 1996. Molecular biology of rice tungro viruses. Ann. Rev. Phytopathol. 34:275-297. Hull R. 2004. Deskription plant viruses: Rice Tungro Bacilliform Virus [terhubung berkala] http://www.dpvweb.net/dpv/showdpv.php?dpvno=407 [5 September 2011]. Kahmann R, Basse C. 1997. Signaling and development in pathogenic fungi, new strategis for plant protection. Trend Plant Sciences 2: 366-368. Kloepper et al. 1999. Plant root-bacterial interactions in biological control of soilborne diseases and potential extension to systemic and foliar diseases. Australasian Plant Pathology 28: 27-33. Ling KC. 1979. Rice viruse disease. Los Banos: IRRI. Mikkelsen SR, Corton E. 2004. Bioanalytical Chemistry. New Jersey: John Wiley & Sons. Mukhopadhyay AN. 1995. Rice Tungro. dalam: Sing US, Mukhopadhyay AN, Kumar J, Chaube HS. Editor. Plant disease of international importance. Vol. 1. Disease of Cereals and Pulse. New Jersey: Prentice may. Nishijima T, Toyota K, Mochizuki M. 2005. Predominant culturable Bacillus species in Japanese arable soils and their potential as biocontrol agents. Microbes and Environments 20 (1): 61-68. Nugroho et al. 2003. Isolasi dan Karakterisasi Sebagian Kitinase Trichoderma viride TNJ63. Jurnal Natur Indonesia 5(2): 101-106. Ou SH. 1985. Rice Disease. Ed ke-2. Surrey: Mycol 1st. Papavizas GC. 1985. Trichoderma and Gliocladium - biology, ecology, and potential for biocontrol. Annual Review of Phytopathology 23: 23-54. Prasetyoputri A, Atmosukarto I. 2006. Mikroba endofit. Bio Trends 1(2): 13-15. Radji M. 2005. Peranan Bioteknologi dan Mikroba Endofit dalam Pengembangan Obat Herbal. Majalah Ilmu Kefarmasian 2 (3): 113- 126. Rizzo I, Varsavky E, Haiduhososki M, Frade H. 1997. Macrocyclic trichothecence in Barcharis coridifolia plants and endophytes and Baccharis artemisioides plants. Toxicon 35: 753-757.

42

Sama S. 1985. Penerapan konsep pergiliran varietas dalam pengelolaan penyakit tungro. Makalah temu lapang pengendalian penyakit tungro. Bayumas, 18-19 September 1985. Sapak Z, Meon S, Ahmad ZAM. 2008. Effect of endophytic bacteria on growth and suppression of Ganoderma infection in oil palm. Int. J. Agri. Biol. 10: 12732. Sariyanto N. 2006. Eksplorasi agen antagonis yang berpotensi menekan penyakit layu fusarium pada pisang. [skripsi]. Bogor: Program Studi Hama dan Penyakit Tumbuhan, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Saunders GC. 1999. DNA extraction. Di dalam: Saunders, Pakers, editor. Analytical Molecular Biology Quality and Validation. Cambridge: UC Pr. hlm 234-246. Scardaci SC et al. 1997. Rice blast: a new disease in California. Agronomy Fact 197: 1-4. Semangun H. 1991. Penyakit-penyakit Tanaman Pangan di Indonesia. Yogyakarta: Gadjah Mada Univ. Pr. Shoda M. 2000. Bacterial control of plant disease. Journal of Bioscience and Bioengineering 89 (6): 515-521. Singh R. 2001. Plant Diseases. New Delhi: Oxford & IBH Pub. CO. Sitepu D. 1993. Konsep Pengendalian Hayati Penyakit Tanaman. Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat Bogor. Kongres Nasional XII dan seminar ilmiah Perhimpunan Fitopatologi Indonesia. Yogyakarta: 66-74. Siwi SS, Kartoharjono A, Hartono S, Diratmaja A. 1987. The green leafhopper genus Nepthotettix Matsumura. Proceedings of the Workshop on Rice Tungro. AARD-Maros Research Institute for Food crops. hlm 114. Strobel GA, Hess WM, Ford EJ, Sidhu RS, Yang X. 1996. Taxol from fungal endophytes and the issue of biodiversity. Journal of Industry Microbiology 17: 417-423. Strobel GA. 2003. Endophytes as sources of bioactive products. Microbes and Infection. 5: 535- 544. Strobel et al. 1999. Cryptocandin, apotent antimycotic from endophytic fungus Cryptosporiopsis quercina. Microbiology 145: 1919-1926. Sugijanto et al. 2004. Isolasi dan Determinasi Berbagai Jamur Endofit dari Tanaman Aglaia elliptica, Aglaia eusideroxylon, Aglaia odorata dan Aglaia odoratissima. Jurnal Penelitian Medika Eksakta 5 (2): 131-141. Susanto A, Sudharto D, Tambajong. 2002. Hiperparasitisme beberapa agen biokontrol terhadap Ganoderma boninense penyebab penyakit busuk pangkal batang kelapa sawit. Jurnal Penelitian Kelapa Sawit 10 (2-3): 6368. Taechowisan T, Lu C, Shen Y, Lumyong S. 2005. 4-Arylcoumarins from endophytic Streptomyces aureofaciens CMUAc130 and their antifungal activity. Ann Microbiol 55: 63-66.

43

Tan RX, Zou WX. 2001. Endophytes : a rich source of functional metabolites. Nat. Prod. Rep. 18: 448-459. Tanaka et al. 1999. Isolation, screening, and phylogenetic identification of endophytes from plants in Hokaido Japan and Java Indonesia. Microbes and Environment 14 (4): 237-241 Tjitrosoepomo SS. 1987. Botani umum. Bandung: Angkasa. Vasudevan P, Kavitha S, Priyadarisini VB, Babujee L, Gnanamanickam SS. 2002. Biological control of rice diseases. Pp. 11-32 dalam: Gnanamanickam SS (ed.) Biological Control of Crop Diseases. New York: Marcel Dekker Inc. Van Regenmortel MH et al. 2000. Virus Taxonomy, Classification and Nomenclature of Viruses. San Diego : Academic Pr. Viterbo A, Landau U, Kim S, Chernin L, Chet I. 2010. Characterization of ACC deaminase from the biocontrol and plant growth-promoting agent Trichoderma asperellum T203. FEMS Microbiology Letters 305: 42-48. Widiarta IN, Yulianto, Hasanuddin A. 2003. Pengendalian terpadu penyakit tungro dengan strategi eliminasi peranan virus bulat. Kebijakan Perberasan dan Inovasi Teknologi Padi. Balitpa. Sukamandi. hlm 513527. Widyastuti SM, Sumardi, Sumantoro P. 2001. Efektivitas Trichoderma spp. Sebagai pengendali hayati terhadap tiga patogen tular tanah pada beberapa jenis tanaman kehutanan. Indo. J. Pl. Protect 7. In Pr. Wijaya S. 2002. Isolasi Kitinase dari Scleroderma columnare dan Trichoderma harzianum. Jurnal Ilmu Dasar 3(1): 30-35. Yanai et al. 1994. Isolation and characterization of two chitin synthase genes from Aspergillus nidulans. Biosci Biotechnol Biochem 58: 18281835. Yu GY, Sinclair JB, Hartman GL, Bertagnolli BL. 2002. Production of iturin A by Bacillus amyloliquefaciens suppressing Rhizoctonia solani. Soil Biology and Biochemistry 34: 955-963.

44

LAMPIRAN

45

Lampiran 1 Struktur organisasi BB-Biogen

46

Lampiran 2 Komposisi larutan EDTA 0.5 M Bahan kimia EDTA Akuades Jumlah 18.6 g 100 mL

Lampiran 3 Komposisi DNA Loading buffer (loading dye) Bahan kimia Bromofenol biru Sukrosa Akuades Jumlah 0.15% (b/v) 40.0% (b/v) 100 mL

Lampiran 4 Komposisi buffer TAE 50X (per liter larutan) Bahan kimia Tris-Base Asam asetat glasial EDTA 0.5 M, pH 8 Akuades Lampiran 5 Komposisi larutan KOAc 5 M, pH 5.5 Bahan kimia KOAc 5 M Asam asetat glasial Akuades Lampiran 6 Komposisi buffer ekstraksi DNA Bahan kimia Tris-HCl, pH 8.0 EDTA NaCl -mercaptoethanol Lampiran 7 Komposisi buffer TE Bahan kimia Tris-HCl 1 M, pH 7.5 EDTA 500 mM, pH 8.0 Akuades Jumlah 100 mL 20 mL 880 mL Jumlah 0.05 M 0.05 M 0.5 M 1% (v/v) Jumlah 240 mL 46 mL 114 mL Jumlah 242 g 57.1 mL 100 mL

47

Lampiran 8 Komposisi larutan PBS (Phosphate Buffered Saline) 1X Bahan kimia Jumlah NaCl 80 g KCl 2g Na2HPO4 14.4 g KH2PO4 2.4 g Akuades 800 mL *pH larutan ditera menjadi 7.4 dengan HCl, volumenya ditera menjadi 1L

Lampiran 9 Komposisi larutan PVP (Polivinilpirolidon) Bahan kimia PVP Jumlah 20% (b/v)

48

Lampiran 10 Komposisi DNA marker BIORON 1 kb DNA Ladder (0.05 mg) - Konsentrasi: 0.2 mg/mL - Semua fragmen blund end - Buffer untuk menyimpan: Tris HCl 10 mM (pH 7.8), NaCl 10 mM, EDTA 1 MM - Suhu penyimpanan: -20 oC

Ukuran (pb) 10000 8000 6000 5000 4000 3000 x 2 2500 2000 1500 1000 x 2 750 500 250

Kuantitas (ng) 64 66 79 94 79 224 94 74 56 113 28 19 10