Для сигнал-специфичного связывания

и транспорта необходим белковый

комплекс

Вайдман Бриджит,
Сакаи Хидеаки, Дэвис
Терри и Вайдман
Мартин

Nature, 1994, Vol. 370, 11th

August, p. 434-440
Ключевые слова

 NAC (nascent-polypeptide-associated
complex)
 SRP (signal recognition particles)
 Signal peptide
 Nascent chain
 Cytosol-depleted
 Ribosome-associated nascent polypeptide
Методы

 Система трансляции in vitro у эукариот

 Получение стабильных комплексов
рибосома - растущий полипептид
 Обнаружение связывания растущего
полипептида с NAC и SRP
 Различение сигнал-специфичного и
неспецифичного связывания
 Локализация NAC относительно рибосомы
 Обнаружение транспорта в ЭР
Система трансляции in vitro у
эукариот

 Используеточищенные от мембранных
органелл клеточные экстракты,
обогащённые тРНК, рибосомами,
аминокислотами и факторами трансляции

В данной работе использована система

wheat-germ – экстракт из зародышей
пшеницы
Получение стабильных комплексов
рибосома - растущий полипептид

 сДНК, кодирующая необходимый белок

(урезанный с С-конца до нужного размера
и без стоп-кодона) встраивалась в
плазмиду и транскрибировалась РНК-
полимеразой E. coli
 Данный транскрипт транслировался в
бесклеточной системе экстракта
зародышей пшеницы
Различение сигнал-специфичного и
неспецифичного связывания

 fffLuc – пероксисомальная люцифераза

 pF1β – пре β субъединица митохондриальной
АТФазы
 САТ – хлорамфеникол ацетилтрансфераза
 pCOXIV – пре 4 субъединица митохондриальной
цитохромоксидазы
 pPL – бычий пре-пролактин
 pPl-M – не переносящийся SRP мутант пре-
пролактина
 Opsin

*Цифра вначале показывает длину полипептида

Обнаружение связывания растущего
полипептида с NAC и SRP

 Вместо лизина использовалось

фотоактивируемое производное лизина с
TDBA (3-фторметилдиазирин-4 –бензоат)
– при освещении ковалентно пришивается
к субстрату за счёт образования карбенов
(время полужизни 1 нс). Молекулярную
массу связанного комплекса (и его
наличие) определяли на денатурирующем
форезе в полиакриламидном геле.
Механизм
Локализация NAC относительно
рибосомы

 ЭкстракцияNAC ацетатом калия из

комплекса с растущим полипептидом
– L - 150mM
– M – 250mM
– H – 500mM
 Обработкапуромицином для отделения
растущего полипептида от рибосомы
Обнаружение транспорта в ЭР

 При добавлении фракции ЭР

– Появление полосы, соответствующей
гликозилированному производному
используемых пептидов
– Появление устойчивости к протеиназе К
Что связывается с комплексом
растущий пептид-рибосома?

Несколько белков экстракта, но

больше всего – белок с массой
около 33К
 * - флуоресцирующий
продукт массой от
массы полипептида до
33К
hxv – была ли
фотоактивация
Является ли этот белок коровым
белком рибосомы?
Является ли этот белок коровым
белком рибосомы?

 Нет,
так как экстрагируется 500mM
ацетатом калия

 Образование комплекса с растущим

полипептидом полностью обратимо, так
как восстанавливается при добавлении 3-
х разных бесклеточных экстрактов
(зародышей пшеницы, мозга коровы и
сабачьей поджелудочной железы)
Выделе
ние и
очистка
NAC
Выделение и очистка NAC

 Обнаружено 2 белка
– α субъединица – 33К. В человеческом геноме
обнаружен в виде 3-х перекрывающихся
фрагментов.
– β субъединица – 21К. В человеческом геноме
соответствует BTF3b – белку с неизвестной
функцией
 NAC представляет собой гетеродимер
этих белков
NAC предотвращает ошибочное
связывание SRP с пептидом
NAC предотвращает ошибочное
связывание SRP с пептидом
NAC предотвращает ошибочное
связывание SRP с пептидом
NAC предотвращает ошибочное
связывание SRP с пептидом и его
транспорт в ЭР
NAC предотвращает ошибочное
связывание SRP с пептидом и его
транспорт в ЭР