TINCIONES

1. Introduccin:
La tincin de Gram es uno de los mtodos de tincin ms importantes en el laboratorio bacteriolgico y con el que el estudiante debe estar perfectamente familiarizado. Su utilidad prctica es indiscutible y en el trabajo microscpico de rutina del Laboratorio de microbiologa las referencias a la morfologa celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos, negativos, etc.) Se basan justamente en la tincin de GRAM Las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas tien de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la clula Gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de peptidoglicano as como algo de cido teicoico; generalmente, 80%-90% de la pared de la clula Gram-positiva es peptidoglicano La pared de la clula Gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho ms delgada, nicamente de peptidoglicano y est rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolpidos, lipopolisacridos, y lipoprotenas. Slo 10% - 20% de la pared de la clula Gram-negativa es peptidoglicano. Debido a su importancia en taxonoma bacteriana y a que indica diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias, describiremos aqu con algn detalle la tincin de Gram y las interpretaciones que actualmente se hacen sobre el porqu de su Funcionamiento.

2. Objetivo:
Mostrar la importancia de una tincin para la diferenciacin de bacterias basndose en las propiedades estructurales de la pared celular, aplicando el mecanismo de la coloracin de Gram, con microorganismos conocidos y desconocidos.

3. Materiales:
Laminas portaobjetos Cubreobjetos Ansa microbiolgica Microscopio ptico Mechero de Bunsen Puente para tinciones Goteros Leche fermentada Queso manipulado

4. Reactivos:
Solucin de cristal violeta Solucin de agua-acetona Solucin de lugol Solucin de Safranina Aceite de inmersin

5. Procedimientos:
Primero en dos laminas porta objetos con ayuda del ansa microbiolgica se coloca un mnimo de la muestra a analizar (leche y queso), si es necesario echamos una gota de agua. Siempre esterilizando con el mechero el ansa para cada muestra. En la leche echamos una gota de cristal violeta por dos minutos. Una vez pasado el tiempo lavamos con agua la muestra y secamos a temperatura de ambiente; echando despus una gota de lugol para poder fijar la muestra por un minuto. Pasado el tiempo lavamos con agua y secamos a temperatura ambiente En la muestra en queso echamos una gota de safranina por dos minutos. Una vez pasado el tiempo lavamos con agua la muestra y secamos a temperatura de ambiente; echando despus una gota de acetona para fijar la muestra por un minuto. Pasado el tiempo lavamos con agua y secamos a temperatura ambiente De all llevamos las muestras al microscopio echando una gota de aceite de inmersin para poder observarlo

Bacteria gram +

Bacteria gram -

LECHE:

QUESO:

VISTA EN EL MICROSCOPIO:

GRAM + (LECHE): Bacterias Clostridium perfringens

(Gram positivas).

GRAM (QUESO): Bacterias Escherichia coli (Gram

negativas) vistas al microscopio tras ser teidas con la tincin de Gram

6. Fundamentos:
La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglucano, adems de dos clases de cidos teicoicos: Anclado en la cara interna de la pared celular y unido a la membrana plasmtica, se encuentra el cido lipoteicoico, y ms en la superficie, el cido teicoico que est anclado solamente en el peptidoglucano Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmtica exterior (de composicin distinta a la interna) por medio de lipoprotenas. Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoprotenas. La membrana exterior est hecha de protena, fosfolpido y lipopolisacrido. Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tien diferencialmente debido a estas diferencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que ese material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporcin que las Gram negativas.

La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloracin, se debe a que la membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgnicos, como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglicano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se form previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdindose la coloracin azul-violcea. Pero por el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular ms resistente y con mayor proporcin de peptidoglicanos, no son susceptibles a la accin del solvente orgnico, sino que este acta deshidratando los poros cerrndolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloracin azulviolcea.

7. Conclusin:
La tincin de Gram es un tipo de tincin diferencial empleado en microbiologa para la visualizacin de bacterias, sobre todo en muestras clnicas. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfologa celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximacin a la diferenciacin bacteriana, considerndose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color violeta y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa

 AGUA ESTANCADA

Con el ansa microbiana cogemos y echamos una gota a una lmina porta objetos para ser visto en el microscopio