SEL BERPINDAH DARI KONSTRIBUSI PUNCAK SARAF KE INERVASI TIANG JANTUNG VENA

Rahel Wahjuni S.
Abstrak - Sel yang berpindah dari puncak saraf diketahui keluar dari perkembangan saluran hati dan berkontribusi untuk pembentukan katup arteri, mendukung sinus, koroner arteri dan saraf jantung ganglia. Sel puncak neural juga telah disarankan untuk dikontribusikan dalam pengembangan kutub jantung vena, tetapi karena luas maka nasib sel tersebut tetap tidak jelas. Pada mouse, terlihat bahwa sel-sel dari puncak saraf berkontribusi kepada parasimpatis dan pada tingkat lebih rendah, pada persarafan simpatik dari tiang jantung vena. Saraf dalam tiang jantung vena diperlihatkan dicampur asal, dengan beberapa yang berasal dari puncak saraf, sementara yang lain memiliki asal alternatif, seperti placodal. Neuron innervating jaringan nodal, yang dapat memberi efek chronotropic pada jantung konduksi, tidak berasal dari puncak saraf. Secara khusus, tidak ada bukti yang ditemukan untuk mendukung bahwa sel-sel dari saraf puncak memberikan kontribusi langsung kepada konduksi sumbu miokard atrioventrikular, meskipun subset kecil sel-sel ini melakukan co-melokalisasi dengan cabang berkembang bundle kiri. Oleh karena itu dikonfirmasikan bahwa sel-sel dari puncak saraf bermigrasi ke kutub jantung vena dan peran utama mereka dalam pengembangan persarafan parasimpatis. Selain itu, dalam beberapa embrio, populasi sel yang berasal dari puncak saraf bertahan dari katup atrioventrikular, tetapi peran mereka dalam perkembangan selanjutnya masih belum diketahui. I. Pengantar Tidak adanya atau berkurangnya, dari puncak saraf sel memasuki saluran keluar dari hati berhubungan dengan berbagai cacat jantung, yang mencakup arteri pohon (truncus arteriosus persisten), dan kelainan di renovasi dari arteri yang berjalan melalui faring lengkungan. Lineage tracing sel tersebut dalam ayam dan tikus telah menunjukkan bahwa mereka juga berkontribusi pada ganglia jantung, pada proksimal daerah arteri koroner dan katup arteri, sementara ini menunjukkan kerja yang lebih baru bahwa mereka juga berkontribusi ke katup atrioventrikular. Retroviral pelabelan studi dalam mengembangkan embrio ayam telah menunjukkan bahwa sel-sel dari puncak saraf juga memasuki tiang jantung vena, dimana mayoritas dilaporkan sebagai co-melokalisasi dengan konduksi berkembang jaringan, dengan beberapa sel berlabel juga ditemukan dalam atrioventrikular bantal. Sel berlabel ini retroviral di kutub vena diperlihatkan diprogram untuk apoptosis, begitu juga sebagian besar puncak-sel saraf ditemukan berasal dari mempopulasikan proksimal saluran keluar. Seperti sel-sel yang masuk melalui kutub vena jantung tampaknya tidak membuat permanen kontribusi terhadap struktur jantung. Baru-baru ini, penulis yang sama menunjukkan bahwa puncak-sel saraf yang berasal bermigrasi ke kutub vena

berkembang mouse, dengan ini sel tampaknya bersama melokalisasi dengan berkembangnya sistem konduksi jantung. Sebaliknya, analisis rinci dari perkembangan persarafan tiang vena dari jantung tikus belum dilaporkan. Dalam studi ini telah digunakan garis Wnt1Cre, disilangkan dengan strain reporter ROSA 26R, untuk menelusuri garis keturunan sel bermigrasi dari puncak saraf ke tiang dari jantung vena. Studi kami menunjukkan bahwa, seperti pada embrio ayam, sebagian besar sel bermigrasi ke ruang atrium melalui koneksi punggung mesocardial yang menjadi saraf otonom dan ganglia. II. Bahan dan metode Mouse strain dan koleksi embrio Tikus jantan dan betina dikawinkan semalam untuk menghasilkan waktunya kehamilan. Tengah hari di mana plug kopulasi telah diidentifikasi di pagi hari adalah ditunjuk E0.5. Wnt1-Cre (Danielian et al 1998), ROSA 26R (Soriano, 1999) dan Sp 2H (Epstein et al. 1991) disilangkan untuk menghasilkan tandu di mana sel-sel yang berasal dari puncak saraf biru bernoda setelah reaksi dengan X-gal (Jiang et al. 2000). Embrio dibedah, tetap dan dipersiapkan baik untuk X-gal staining atau untuk embedding dalam lilin parafin. Setidaknya tiga embrio dari setiap genotype diperiksa pada setiap umur kehamilan. Galaktosidase pewarnaan Wnt1-Cre/ROSA 26R embrio Embrio Wnt1-Cre/R26R telah dibedah menjadi 1% es-dingin fosfat-buffer salin, dan kemudian tetap di 4 C dalam larutan yang mengandung 0,1 M buffer fosfat, paraformaldehyde 2% (PFA), 5 MEGTA, 0,2% glutaraldehid dan 2 M MgCl 2. E9.5 embrio yang tetap untuk 5 menit, E10.5E12.5 embrio selama 15 menit dan embrio yang lebih tua selama 20 menit. Setelah fiksasi, embrio dilakukan dicuci pada suhu kamar dalam mencuci buffer (0,1 M buffer fosfat, 0,01% Na-deoksikolat, 0,02% NonidetP40 dan 2 m M MgCl 2). Pada tahap dan kali dijelaskan di atas. Setelah pencucian, embrio dilakukan ditempatkan di pewarnaan larutan buffer yang mengandung mencuci dilengkapi dengan 1 mg mL -1 -Gal di formamida dimetil X, 10 m M Kferricyanide dan 10 m M K-ferrocyanide. Embrio dibiarkan untuk noda dalam kegelapan di 37 C semalam. Setelah pewarnaan, embrio dicuci dalam buffer cuci, kemudian tetap dalam 4 PFA% pada 4 C (E9.5 dan embrio E10.5 selama 24 jam, yang lebih tua embrio selama 48 jam). Embrio tertanam di lilin parafin, belah dan counterstained dengan eosin berair 1%. Imunohistokimia Semua imunohistokimia dilakukan pada PFA-tetap, parafin-embedded, bagian jaringan yang menggunakan protokol standar. Dalam beberapa kasus, antibodi pewarnaan dilakukan berikutnya untuk X-gal pewarnaan. Antibodi divisualisasikan dengan memperlakukan bagian dengan avidin- kompleks biotin terkonjugasi ntuk horseradish peroxidase (ABComplex, DAKO), kemudian pewarnaan dengan diaminobenzidine (Sigma). Pertumbuhan P75 faktor saraf reseptor antibodi (Chemicon Internasional) mensyaratkan standar peroxidase, perlakuan yang dijelaskan di atas, sedangkan 160D neurofilamen antibodi (NN18 klon,

Sigma), antibodi hidroksilase tirosin (Klon TH-2, Sigma) dan penanda miokard Jantung Troponin (Hytest) yang diperlukan temu antigen tambahan dengan microwave di Declere (Cell Marque). Kambing anti-mouse IgG FITC (Sigma) digunakan sebagai antibodi sekunder untuk miokard penanda MF20 (Studi Pembangunan hibridoma Bank, Iowa kota). Antibodi Islet1 (40.2D6, Pembangunan Studi hibridoma Bank) yang dibutuhkan retreival antigen oleh microwave dalam buffer sitrat (pH 6). III. Hasil masukkan sel puncak neural kutub vena mouse embrio lebih dari kutub arteri Sebagai tanda P75 NTR berkembang neuron otonom dari semua garis keturunan, ini menunjukkan bahwa sel saraf dari sumber selain puncak neural sudah ada dalam sambungan punggung mesocardial sebelum kedatangan sel-sel yang berasal dari puncak saraf. Sel yang berasal dari puncak saraf berkontribusi pada posterior pleksus jantung dan ganglia. Pada embrio ayam, lambang-sel saraf telah diturunkan laporan untuk bermigrasi ke arah kutub pembuluh darah jantung melalui saraf vagal, dan untuk membentuk sel-sel ganglion di posterior jantung pleksus (Verberne et al 1988, 2000). Tidak seperti neurofilamentous pewarnaan terlihat di E9.5, baik di saluran keluar atau di daerah dari koneksi punggung mesocardial (data tidak ditampilkan). Dengan E10.5, bagaimanapun, NF160D pewarnaan ditemukan di sambungan punggung mesocardial (data tidak ditampilkan), mirip dengan yang dilihat untuk P75 NTR (Gambar 1F), sehingga mengkonfirmasi kehadiran neuron di mesocardium dorsal pada tahap awal. Ada kontribusi lebih kecil puncak sel saraf saraf yang diturunkan (double berlabel; panah hitam) dan sel-sel puncak neural nasib non-syaraf (sel biru; panah biru). Dengan ini panggung jantung pleksus juga bisa dilihat. Ini juga terdiri dari sel-sel asal campuran, meskipun dalam kasus ini sebagian berasal dari sel-sel dari puncak saraf (biru patri). Pada tahap ini, sel biru dari puncak neural ditemukan bersama dengan yang NF160D-positif sel, meskipun jumlah relatif mereka berkurang dibandingkan dengan 1 hari sebelumnya. Pada tahap ini kemudian, sel-sel di dalam mengembangkan saraf vagus yang terbukti memiliki asal campuran. Sebagian sel terletak di pusat di dalam saraf batang diwarnai hanya cokelat, menunjukkan mereka untuk menjadi neuron yang berasal dari sumber selain dari puncak saraf, agaknya placode vagal. Beberapa badan sel yang terletak di pinggiran saraf secara eksklusif berwarna biru, yang mengindikasikan bahwa mereka tidak neuronal, meskipun mereka berasal dari saraf puncak. Namun populasi ketiga adalah double bernoda, dengan populasi terakhir juga melokalisir ke pinggiran saraf vagal, menunjukkan mereka untuk menjadi neuron berasal dari puncak saraf. Dengan E12.5, pleksus saraf jantung posterior bisa mudah diidentifikasi di kutub pembuluh darah jantung. Berbeda dengan saraf vagal, sel-sel dari jantung pleksus terutama adalah biru, menunjukkan asal mereka dari puncak saraf, meskipun beberapa sel yang hadir bahwa noda semata-mata dengan penanda neurofilamen NF160D. Sekali lagi, banyak sel tubuh, terutama di wilayah tengah dari pleksus jantung posterior, yang positif

untuk kedua spidol, menunjukkan bahwa sel-sel yang berasal dari puncak neural telah dibedakan menjadi neuron. Campuran jenis sel ini dalam pleksus jantung posterior adalah dipertahankan selama kehamilan. Sel-sel yang bernoda secara eksklusif dengan NF160D, dan maka coklat, harus sel neuron yang tidak berasal dari puncak saraf. Seperti saraf vagal, mereka mungkin asal placodal. Sel-sel yang hanya bernoda biru baik dibedakan sel pial neural atau yang lain non-sel saraf asal puncak saraf, misalnya satelit sel atau glia. Analisis Wnt1-Cre/R26R embrio di E12.5 mengungkapkan sel biru diatur dalam baris, mengingatkan kita pada saluran saraf dalam tiang vena hati. Pada E12.5, sebagian besar sel-sel di saraf vagal dan pleksus jantung posterior yang neuron kolinergik parasimpatis. (A) -Gal pewarnaan mengungkapkan aliran puncak saraf yang diturunkan sel (biru) dalam punggung mesocardial koneksi, yang mengingatkan pada saluran saraf. (B) NF160D menandai pewarnaan yang vagal saraf, jantung posterior pleksus dan menegaskan kehadiran neuronal pewarnaan dalam punggung mesocardium. (C) Neuron simpatik penanda tirosin hidroksilase tanda hanya subset dari sel-sel di saraf vagal dan pleksus jantung (Panah), tetapi noda saraf di dalam yang mesocardium punggung. (D) Sebaliknya, VAChT tampaknya noda mayoritas saraf vagal dan posterior pleksus jantung dan juga melokalisasi ke saraf di punggung mesocardium. (E) Dalam Sp2H / + embrio, yang menampilkan fenotipe sebanding dengan wild type embrio, aliran puncak saraf yang diturunkan menyerupai sel saraf saluran dapat dilihat memasuki jantung melalui dorsal mesocardium di E13.5. Neural crestderived sel juga diamati dalam vagal cabang dan pleksus jantung. (F) Dalam Sp2H/Sp2H embrio pada E13.5, pola serupa -gal pewarnaan diamati, menunjukkan bahwa vagus pleksus saraf dan jantung biasanya terbentuk dan bahwa persarafan jantung melalui terjadinya punggung mesocardium. Saluran sel ini tidak noda dengan salah satu dari spidol miokard MF20 atau Jantung Troponin 1, tetapi noda dengan penanda neuronal NF160D. Pewarnaan untuk hidroksilase tirosin, penanda neuron simpatik, mengungkapkan ekspresi kecil di batang vagal, dan hanya minimal ekspresi di daerah dorsal posterior jantung pleksus. Pewarnaan juga diamati, namun, dalam saraf dorsal yang ditemukan dalam koneksi mesocardial. Sebaliknya, pewarnaan untuk transporter asetilkolin vesikuler (VAChT), yang secara khusus parasimpatis noda neuron, mengungkapkan pewarnaan kuat di batang vagal, posterior jantung pleksus dan juga dalam sel-sel saraf bermigrasi ke tiang vena. Menariknya, analisis lambang saraf sel saraf yang diturunkan di mouse merupakan lambang-kekurangan saraf mutan. Percikan 2H ( Sp 2H ) Menunjukkan bahwa posterior jantung pleksus, saraf vagal dan saraf memasuki jantung melalui mesocardium punggung semua terbentuk biasanya dalam Sp 2H / Sp 2H janin, meskipun pengurangan dramatis dalam jumlah sel

pial neural pada tiang arteri hati (Epstein et al 2000). Ini mendukung gagasan bahwa puncak sel-sel saraf di tiang arteri dan vena hati memiliki asal-usul dan nasib yang berbeda. IV. Diskusi Sel yang berasal dari puncak saraf diketahui untuk menyerang perkembangan tiang jantung vena (Poelmann et al. 1998; Jiang et al. 2000; Pietri et l. 2003). Peran mereka dalam hal ini kurang dipahami dari pada tiang arteri, dimana mereka diketahui memainkan peran penting dalam pembentukan sekat, serta memberikan kontribusi ke akar arteri dan jantung ganglia (Kirby et al 1985; Besson et al 1986; Bockman et al. 1989). Dalam studi ini, kita telah menunjukkan bahwa, di mouse, sel-sel yang berasal dari masukkan puncak saraf tiang vena dan berkontribusi terhadap jantung posterior pleksus dan ganglia. Kami juga menunjukkan bahwa tidak semua saraf masuk jantung melalui vena tiang mengambil asal mereka dari puncak saraf, atau bahkan memiliki kontribusi dari ini sumber. Yang penting, kami juga menunjukkan bahwa sel-sel yang berasal dari puncak saraf tidak memiliki peran langsung dalam persarafan yang dari simpul-simpul sinus dan atrioventrikular. Lebih penting lagi, mereka tidak berkontribusi konduksi sumbu itu sendiri, walaupun pada tahap kemudian beberapa sel yang berasal dari puncak neural ditemukan di dekat cabang bundel kiri. Saraf sel puncak juga terlihat tersebar jarang. Saraf tumbuh menjadi kutub vena hati adalah campuran pial neural-dan non-saraf neuron yang diturunkan dari puncak. Dalam setiap kasus, tanda panah biru sel hanya -gal-bernoda (Biru), tanda panah merah hanya NF160D bernoda sel (coklat) dan panah hitam ditandai ganda sel berlabel (biru / coklat). (A, B) Neural crest sel mengekspresikan -gal (panah biru) pertama dapat dilihat pada mesocardium punggung di E11.5, colocalizing dengan neuronal pewarnaan (panah merah). Saraf dapat diidentifikasi dalam tiang vena dari hati seluruh kehamilan, dalam setiap kasus yang terdiri dari populasi campuran puncak saraf yang diturunkan dari neuron (panah hitam), saraf-saraf non sel puncak yang diturunkan (biru panah) dan lebih proksimal, non-saraf-puncak berasal neuron (panah merah). Saraf baik puncak saraf dan lambang non-saraf derivasi bisa dilihat di dinding atrium dan dalam sulkus atrio-ventrikular. Blue panah anda birubernoda yang diturunkan dari sel puncak neural, sedangkan tanda panah hitam sel pial neural asal (biru-patri) yang juga noda dengan penanda neuronal NF160D (coklat). (A,B) Pada E18.5, NF160D menunjukkan bahwa pewarnaan sinus node adalah diinervasi, walaupun hanya langsung oleh sel asal lambang non-saraf (coklat; panah merah). (C,D) Tidak ada neuron di dekat kedekatan dengan peningkatan atrioventrikular konduksi sumbu (bintang) di E14.5. (E,F) Dengan E17.5, badan sel saraf-saraf puncak non asal (panah merah) dapat dideteksi pada pinggiran sumbu konduksi atrioventrikular (Asterisk). Tidak, biru lambang yang diturunkan dari sel-sel saraf, terdeteksi. Mesenkim dari beberapa bantal atrioventrikular, tapi tidak semua, dari embrio diperiksa. Migrasi ke kutub vena Sel-sel yang bermigrasi dari puncak neural embrionik mencapai jantung melalui vena pada hari tiang 11,5, sedangkan mereka memasuki tiang arteri sehari penuh sebelumnya. Kami yakin bahwa ini lag temporal adalah nyata, dan bukan sebuah contoh dari model kita, mengingat bahwa peristiwa Cre-rekombinasi mengambil terjadi sebelum migrasi meninggalkan sel pial neural (Jiang et al. 2000). Wnt1

sendiri tidak dinyatakan dalam pengembangan jantung, sehingga dapat diasumsikan bahwa setiap sel dalam jantung yang mengekspresikan: Gal bermigrasi ada dari saraf puncak. Gal-mengekspresikan menunjukkan sel saraf kegiatan, atau co-pelokalan dengan elemen saraf, meskipun beberapa sel saraf yang sudah ditemukan di punggung yang mesocardium di kutub vena sebelum penampilan dari populasi yang bermigrasi. Hal ini mengejutkan bahwa posterior jantung pleksus di mouse, bukannya berasal eksklusif dari puncak saraf, hanya memiliki kontribusi dari sumber ini, dengan banyak sel ganglionic lain juga sedang ini, mungkin berasal dari placodes neurogenik, seperti saraf vagus itu sendiri. Dalam saluran keluar, banyak dari sel yang berasal dari puncak baik menghilang (Jiang et al 2000.) atau menjadi dibatasi ke lapisan subendothelial dalam kata lain dipisahkan dari aorta A.