MAKALAH IMMUNOLOGI

DANGGUI BUXUE TANG SEBUAH RAMUAN HERBAL CINA YANG MENGAKTIFKAN SINYAL EKSTRASELULER DIATUR DALAM KULTUR TLIMFOSIT

Oleh : EBRY RYANATA ERIQ HUSADA MUH. PRATAMA ARIEF RICO RINALDO SYLVAN S R (1100112) (1100149) (1100117) (1100106) (1100991)

1. PENDAHULUAN 1.1 Dasar teori

Danggui Buxue Tang (DBT) dibuat dari Radix Radix astragali dan Angelicae Sinensis. Ini rebusan herbal Cina telah ditunjukkan untuk merangsang proliferasi limfosit T-, namun, mekanisme aksi dari rangsangan ini belum terungkap. Dalam berbudaya T-limfosit, aplikasi DBT nyata diinduksi proliferasi sel, pelepasan interleukin-2, -6 dan -10, serta fosforilasi kinase sinyal-diatur ekstraseluler (ERK). Perlakuan pra-ERK inhibitor diblokir DBT-memicu tanggapan kekebalan tubuh. Selain itu, fraksi polisakarida-diperkaya DBT menunjukkan respon yang ditandai pada berbudaya T-limfosit menunjukkan peran penting dari polisakarida DBT dalam memicu respon imun tersebut. Di antara ribuan formula herbal dari obat tradisional Cina (TCM), Danggui Buxue Tang (DBT, sebuah ramuan herbal) adalah kombinasi sederhana dari hanya dua herbal.DBT pertama kali dijelaskan pada Neiwaishang Bianhuo Lun oleh Li Dongyuan di Cina pada tahun 1247.Li menggambarkan rumus DBT harus mencakup: 10 Qian dari Radix astragali (RA), akar Astragalus membranaceus (Fisch.) Bungo atau Astragalus membranaceus (Fisch.) Bungo var.mongholicus (Bungo) P.K.Hsiao, dan dua Qian dari Sinensis Angelicae Radix (RAS), Angelica sinensis akar (Oliv.) Diels.Satu qian sama dengan sekitar 3 g.Tumbuhan campuran direbus dalam dua mangkuk (~ 500 ml) air di atas api sedang sampai volume akhir dikurangi dengan setengahnya.Secara tradisional, DBT telah diresepkan untuk wanita di Cina sebagai obat untuk gejala menopause.Para wanita diarahkan untuk minum sehari-hari untuk meningkatkan DBT mereka Qi (energi vital) dan memelihara darah mereka (sirkulasi tubuh). RA telah terbukti menjadi imunostimulan, hepatoprotektif, anti-diabetes, analgesik, ekspektoran dan obat penenang. Di sisi lain, RAS digunakan untuk memperkuat sirkulasi darah dalam mengobati gangguan menstruasi dan untuk memodulasi sistem kekebalan tubuh dan. Meskipun kimia dan biologi analisis telah dilakukan pada individu herbal, alasan untuk memiliki dua herbal dalam DBT tidak pernah dijelaskan, ini akibatnya menghambat pengembangan multiramuan decoctions sebagai penyakit dan obat gangguan.

Dengan menentukan sifat kimia dan biologis dari DBT, kondisi dioptimalkan untuk ekstraksi telah ditetapkan, yang sesuai dengan perbandingan berat 5:01 untuk RA untuk RAS dalam persiapan kuno.Selain itu, standar DBT didirikan dengan mengungkapkan jumlah RA yang diturunkan calycosin dan formononetin, dan RAS yang diturunkan ferulic acid dan ligustilide dalam ramuan. Properti immuno (salah satu fungsi Qi) DBT ditentukan di sini. Studi sebelumnya menunjukkan bahwa proliferasi limfosit-T dapat dirangsang oleh perlakuan DBT, namun, acara molekuler yang bertanggung jawab untuk stimulasi ini belum ditentukan.Untuk mengungkap mekanisme aksi dari rebusan herbal kuno, kita diperlakukan berbudaya T-limfosit dengan DBT dan, selanjutnya, menganalisis rilis dari sepuluh sitokin termasuk interleukin, (IL) -2 IL-4, IL-5, IL6, IL-8, IL-10, IL-13, granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GMCSF), interferon- (IFN-), tumor nekrotik faktor- (TNF-) dan fosforilasi sinyal-diatur ekstraselulerkinase (ERK) 1 / 2.Selain itu, peran polisakarida DBT dan jalur yang sinyal untuk pelepasan sitokin yang diinduksi DBT dielusidasi.

2. BAHAN DAN METODE 2.1. Persiapan dan standarisasi DBT Tiga tahun A. membranaceus var.mongholicus akar dari Provinsi Shanxi [8] dan dua tahun akar sinensis A. dari Minxian di Provinsi Gansu [3] dikumpulkan pada tahun 2002.Dalam mempersiapkan DBT, jumlah yang tepat dari RAS dan RA ditimbang menurut rasio 5:1 dan kemudian dicampur dengan baik dalam pusaran.Campuran direbus dalam 8 vol air (v / w) selama 2 jam dan diekstraksi dua kali; ekstraksi ini diikuti resep kuno yang telah terbukti memiliki kondisi ekstraksi terbaik [4] dan [6].Sampel terpisah dari RAS dan RA diekstraksi dengan metode yang sama.DBT polisakarida polisakarida dipisahkan menjadi fraksidiperkaya dan polisakarida-habis fraksi dengan pengendapan ekstrak DBT dengan etanol 70%.Kedua fraksi dipisahkan setelah sentrifugasi pada 4000 g selama 20 menit.Fraksi polisakarida-diperkaya account untuk ~ 18% dari berat kering total. Semua fraksi dikeringkan oleh lyophilization dan disimpan pada -80 C. Standardisasi DBT dilakukan oleh profil HPLC dan isi ferulic acid, calycosin, formononetin dan ligustilide (z-isoform).AR-dan HPLC-grade reagen dari Merck (Darmstadt, Jerman).Sebuah Waters (Milford, MA) HPLC sistem yang terdiri dari, pompa 600 sebuah auto-717 sampler dan Photodiode Array UV / VIS Detector 2996 digunakan untuk semua analisis.Pemisahan kromatografi dilakukan pada kolom DELTA-PAK C18 (ukuran partikel 4,6 m, 3,9 mm x 150 mm) dengan asetonitril (sebagai pelarut A) dan: asam fosfat 0,01% (sebagai B pelarut) dalam fase bergerak pada laju alirandari 1,0 ml / menit pada suhu kamar.

2.2. Budaya T-Limfosit dengan uji poliferasi T-limfosit yang diisolasi dari darah segar yang dikumpulkan dari donor sehat dengan Ficoll-Hypaque. T-limfosit dimurnikan lalu dicuci dua kali dengan RPMI1640 menengah (Invitrogen, Carlsbad, CA) dan unggulan pada kepadatan 1 x 105 sel / baik dalam piring budaya 96-baik. Enam kepadatan dari T-limfosit (1 1041 106 sel / baik) adalah unggulan untuk membuat kurva standar uji XTT. Cultured T-limfosit diobati dengan DBT, RA, RAS, campuran RA dan RAS, atau phytohaemagglutinin (PHA) selama 3 hari. Kemudian, 1 ml larutan XTT (1 mg / ml; Sigma, St Louis, MO) dicampur dengan 5 ml methosulfate phenazine pada 5 mM. Dua puluh lima mikroliter larutan dicampur XTT ditambahkan ke masing-

masing dengan baik, dan budaya diinkubasi selama 4 jam dalam suasana jenuh air udara 95% dan CO2 5%. Absorbansi pada 450 nm diukur. Jumlah sel ditentukan dari kurva standar. Dalam analisis memblokir, MEK inhibitor U0126 (20 M; Sigma), dilarutkan dalam dimetil sulfoxide (DMSO), diaplikasikan 3 jam sebelum penerapan obat lain. 12-O-Tetradecanoylphorbol 13-asetat (TPA; Sigma) pada 0,1 pM digunakan sebagai aktivator ERK. 2.3. Sitokin Antibody ARRAY dan ELLISA Sekresi sitokin yang berbeda dari T-limfosit dibiakkan diukur dengan menggunakan Quantibody Manusia Th1/Th2 Array dari Ray Biotech (Norcross, GA). Secara singkat, antibodi terhadap sitokin yang berbeda (IL-2, IL-4, IL-5, IL6, IL-8, IL-10, IL-13, GM-CSF, IFN- dan TNF-) yang terlihat ke array sitokin oleh produsen. T-limfosit diobati dengan DBT selama 3 hari. Jumlah sitokin dikeluarkan diukur dengan menambahkan 100 ml medium dikondisikan ke array selama 2 jam. Kemudian, biotin-terkonjugasi antibodi primer yang ditambahkan selama 1 jam Setelah mencuci, Alexa 555-terkonjugasi streptavidin ditambahkan selama 1 jam Chip-scan oleh GenePix profesional 4200A (Synnyvale, CA) pada eksitasi 555 nm dan emisi 565 nm. Gambar itu dianalisa oleh program perangkat lunak GenePix 5.0 Pro, dan jumlah sitokin dihitung sesuai dengan kurva standar dikalibrasi dari array yang sama. Yang disekresikan IL-2, IL-6 dan IL-10 dari Tlimfosit yang lebih diukur dengan menggunakan ELISA kit eBioscience (San Diego, CA). T-limfosit diobati dengan DBT selama 3 hari. Seratus mikroliter medium dikondisikan dalam setiap sumur dikumpulkan, dan jumlah IL-2, IL-6 dan IL-10 diukur dengan mengikuti protokol yang disediakan dari produsen kit ELISA tersebut. Akhirnya, piring absorbansi diukur pada 450 nm dan dikalibrasi. 2.4. Penentuan ERK Fosfolirasi Untuk meneliti efek inhibitor, Diberikan tanpa inhibitor selama 3 jam

sebelum aplikasi obat. Setelah terapi obat, budaya dikumpulkan segera dalam buffer lisis (125 mM Tris-HCl, 2% SDS, gliserol 10%, 200 mM 2mercaptoethanol, pH 6,8), dan protein menjadi sasaran analisis SDS-PAGE. Terfosforilasi ERK1 / 2 yang diakui oleh anti-phospho-ERK1 / 2 dan anti-total ERK1 / 2 antibodi (1:5000; your Signaling, Danvers, MA) pada 4 C selama 12 jam, dan horseradish peroxidase (HRP)-terkonjugasi antibodi selama 1 jam pada

suhu kamar.

Para immuno-kompleks divisualisasikan dengan metode (ECL)

chemiluminescence ditingkatkan (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Intensitas band, diakui oleh antibodi dalam film ECL, di kontrol dan agonis-merangsang sampel dijalankan pada gel yang sama dan dalam kondisi ECL ketat standar. Band ini dibandingkan pada analisa gambar, menggunakan dalam setiap kasus plot kalibrasi dibangun dari gel paralel dengan pengenceran serial salah satu contoh: ini adalah untuk memastikan saturasi sub-paparan gel.

2.5. Tes-Tes Lain Konsentrasi protein diukur dengan metode Bradford rutin dengan kit dari BioRad Laboratories (Hercules, CA). Tes statistik yang dibuat oleh program PRIMER, versi 1 (Primer biostatistik): perbedaan dari nilai-nilai basal atau kontrol yang diklasifikasikan sebagai signifikan di mana P <0,05,P <0,01 dan sangat signifikan P <0,001 diuji dengan Student t-test.

3. HASIL 3.1. Standardisasi DBT Dengan menemukan jumlah dari dua penanda kimia dalam RA (calycosin dan formononetin) dan dua lainnya di RAS (ferulic asam dan ligustilide), kami bisa membakukan DBT yang optimal. Para DBT standar harus mengandung 0,186 mg calycosin, 0,155 mg formononetin, 0,351 mg asam ferulat dan 0,204 mg per 1 ligustilide g berat kering dari DBT, yang sejalan dengan kalibrasi kami sebelumnya. Dari perhitungan efisiensi ekstraksi, kami menemukan bahwa hasil DBT dalam perbandingan berat adalah 32 3% (n = 5). Parameter ini menetapkan standar kimia dan campuran DBT optimal untuk percobaan biokimia yang tersisa. 3.2. DBT menginduksi Poliferasi T-Limfosit Dalam rangka untuk mengungkapkan fungsi kekebalan tubuh-peraturan kemungkinan DBT, air ekstrak DBT, RA, RAS, dan RA + RAS (direbus secara terpisah dan kemudian dicampur dalam rasio 5:01) diterapkan ke manusia berbudaya T-limfosit, dan proliferasi sel ditentukan. Semua kelompok menunjukkan efek stimulasi signifikan pada T-limfosit proliferasi (Gambar 1). Efek dari ekstrak herbal yang berbeda menunjukkan respon dosis-tergantung yang baik. Pada dosis 0,1 mg / ml, DBT menunjukkan efek sub-maksimal, yang secara signifikan lebih tinggi daripada kelompok lain. Jumlah yang lebih tinggi dari ekstrak tidak menunjukkan peningkatan yang signifikan dalam proliferasi sel, menunjukkan efek saturasi. Penambahan RA + RAS (direbus terpisah) menunjukkan efek aktivasi jauh lebih rendah pada proliferasi T-limfosit. 3.3. DBT menginduksi Sitokin di T-Limfosit T-limfosit dirawat selama 3 hari dengan ekstrak yang berasal dari DBT, RA, RAS, atau RA + RAS. Pelepasan sitokin (IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL13, GM-CSF, IFN- dan TNF-) dari obat-diperlakukan T-limfosit ditentukan oleh berbagai sitokin antibodi. Dengan membandingkan dengan budaya kontrol, melepaskan IL-2, IL-6, IL-8 dan IL-10 yang nyata disebabkan oleh DBT. Di antara empat sitokin, IL-2, IL-6 dan IL-10 menunjukkan spesifisitas untuk DBT, yaitu tidak disebabkan oleh RA, RAS atau RA + RAS, dan dengan demikian mereka dipilih untuk analisa lebih lanjut. Perlakuan DBT menyebabkan

peningkatan pelepasan IL-2 ke ~ 3-kali lipat, IL-6 untuk ~ 120-lipat dan IL-10 ke ~ 20-kali lipat. Menariknya, pengobatan RA, RAS atau campuran sederhana dari RA dan RAS tidak mengubah pelepasan sitokin menyarankan bahwa didih dua herbal bersama adalah penting. Tingkat IL-4, IL-5, IL-13, GM-CSF, IFN- dan TNF- tidak terpengaruh oleh perlakuan DBT, RA, RAS, dan RA + RAS. Rilis IL-2, IL-6 dan IL-10 dihitung dengan ELISA assay. Tanggapan dari tiga sitokin yang agak mirip, yaitu 0,1 mg / ml DBT dalam semua kasus disebabkan rilis untuk maksimum; induksi maksimal untuk IL-2 berada di ~ 4 kali lipat, IL-6 pada ~ 20-kali lipat, dan IL-10 pada ~ 8-lipat. Dengan membandingkan hasil dari analisis berbagai sitokin, hasil dari uji ELISA menunjukkan nilai yang lebih rendah, yang dapat dihitung dengan sensitivitas dari uji dua sistem yang berbeda. 3.4. DBT menginduksi Fosfolirasi ERK Aktivasi ERK, anggota mitogen-diaktifkan protein (MAP) kinase yang bertindak sebagai sinyal kunci untuk proliferasi limfosit T-, yang ditentukan dalam DBT-sel diobati. Dengan menggunakan antibodi spesifik untuk ERK ERK terfosforilasi dan total, phosphorylations dari ERK1 (~ 44 kDa) dan ERK2 (~ 42 kDa) dalam kultur T-limfosit yang terungkap: kedua phosphorylations meningkat oleh aplikasi DBT . Induksi maksimal dari ~ 10 kali lipat pada fosforilasi ERK itu terungkap setelah 30 menit dari aplikasi DBT. Aktivasi ERK adalah sementara, yang sepenuhnya kembali ke tingkat yang rendah setelah 60 menit dari pengobatan. Aplikasi TPA, menjabat sebagai kontrol, secara signifikan diinduksi ERK1 / 2 fosforilasi pada cara yang lebih berkelanjutan, yang lebih kuat daripada DBT. Para DBT-diinduksi ERK fosforilasi pada 30 menit sepenuhnya diblokir oleh pra-memperlakukan budaya dengan U0126 (20 M; inhibitor MEK). Untuk menyelidiki lebih lanjut apakah peraturan kekebalan tubuh-efek DBT yang terkait dengan fosforilasi ERK1 / 2, pelepasan sitokin dalam DBT-diobati T-limfosit dengan adanya U0126 diuji. Para DBT-diinduksi proliferasi limfosit Tsepenuhnya diblokir oleh U0126. Secara paralel, rilis IL-2, IL-6 dan IL-10, yang disebabkan oleh DBT, telah diblokir oleh perlakuan pra-U0126 (Gambar 4). Hasil ini sangat menunjukkan bahwa perawatan pra-MEK inhibitor dapat sepenuhnya meniadakan efek kekebalan-peraturan DBT pada T-limfosit, dan yang menyarankan peran penting ERK dalam menengahi respon imun DBT.

3.5. Polisakarida DBT merupakan Penggerak kekebalan Dalam rangka untuk mengidentifikasi komponen aktif dalam DBT dalam memicu aktivasi kekebalan tersebut, dua fraksi: polisakarida-diperkaya (18% dari berat kering) dan polisakarida-habis (82% dari berat kering) pecahan diperoleh. Fraksi polisakarida-diperkaya, bila diterapkan ke berbudaya T-limfosit,

menunjukkan peningkatan yang ditandai berlaku aktivasi kekebalan nya. Pada 50 pg / ml polisakarida-diperkaya fraksi, stimulasi proliferasi sel meningkat oleh lebih dari 50% yang 5 kali lipat lebih tinggi dari polisakarida-habis fraksi. Secara paralel, fraksi polisakarida-diperkaya menunjukkan efek aktivasi yang lebih tinggi dalam merangsang pelepasan sitokin. Pada 50 pg / ml polisakarida-diperkaya fraksi, rilis IL-2, IL-6 dan IL-10 meningkat oleh 4 kali lipat, 20-kali lipat dan 6 kali lipat, masing-masing. Sebagai perbandingan, fraksi polisakarida-habis bisa hanya sedikit menginduksi pelepasan sitokin. Phospolirasi dari ERK1 (44 kDa) dan ERK2 (42 kDa) dalam kultur T-limfosit meningkat oleh aplikasi dari fraksi polisakarida-diperkaya. Mirip dengan efek dari DBT, induksi maksimal dari 12-kali lipat pada fosforilasi ERK itu terungkap setelah 30 menit dari fraksi polisakarida aplikasi DBT. Efek dari polisakarida DBT juga sepenuhnya diblokir oleh U0126. Sebaliknya, fraksi polisakarida-habis dibuat dari DBT tidak menunjukkan aktivasi pada fosforilasi ERK. Jalur sinyal DBT adalah mirip dengan polisakarida, dan yang menunjukkan peran polisakarida dalam memicu respon imun.

4. DISKUSI

DBT, sebuah ramuan herbal kuno Cina memiliki kombinasi RA dan RAS dalam perbandingan berat 5:1, memiliki efek yang jauh lebih baik dalam merangsang kultur T-limfosit dibandingkan dengan yang dari ekstrak yang berasal dari RA, atau RAS, atau RA +RAS (direbus secara terpisah dan kemudian dicampur dalam rasio 5:01).Dalam sejajar dengan efek ini, sitokin analisis array yang mengungkapkan serangkaian tertentu sitokin termasuk IL-2, IL-6 dan IL-10 yang dirangsang untuk melepaskan dari biakan limfosit-T oleh DBT; rilis sitokin tidak dipicu oleh RA saja,atau RAS sendiri, atau RA + RAS.Selain itu, efek merangsang cukup RA + RAS dalam kultur T-limfosit menunjukkan bahwa didih dua herbal bersama adalah penting, ini metode persiapan DBT, memang, telah lama direkomendasikan oleh praktisi TCM.Selain efek di T-limfosit, peran rasio berat badan yang benar RA untuk RAS dalam membuat perumusan DBT juga telah dibuktikan dalam kanker payudara berbudaya, makrofag dan osteoblas.

Dua hipotesis yang mungkin bisa menjelaskan fungsi biologis yang unik DBT.Pertama, DBT mungkin mengandung bahan kimia baru atau jumlah yang lebih besar daripada konstituen aktif dalam ekstrak RA atau RAS saja.Mendidih RA dan RAS bersama-sama dapat meningkatkan kelarutan bahan kimia baru, dan bahan kimia baru hanya larut dalam DBT.Bahan kimia tambahan dapat bertanggung jawab atas DBT-efek khusus.Di sisi lain, rasio dioptimalkan dari dua herbal dalam menghasilkan lebih banyak bahan aktif dapat penjelasan lain yang baik untuk DBT-efek khusus.Hasil ini menunjukkan bahwa fraksi polisakarida harus berisi salah satu bahan aktif dari DBT.Sejalan dengan itu, analisis kimia menunjukkan bahwa kandungan polisakarida dalam DBT jauh lebih tinggi dari sekedar menambahkan RA dan RAS bersama-sama [4].Selain itu, jumlah yang lebih tinggi RA yang diturunkan calycosin, formononetin dan RAS yang diturunkan ferulic acid juga ditemukan dalam rebusan DBT [4].Kedua, mungkin ada efek sinergis dari berbagai komponen dalam DBT, ini efek sinergis tidak hadir dalam ekstrak herbal tunggal.Hipotesis ini didukung oleh fakta bahwa fraksi polisakarida-diperkaya tidak bisa sepenuhnya memperhitungkan aktivitas DBT, khususnya pengayaan kegiatan dalam fraksi polisakarida-diperkaya tidak bisa

diungkapkan di sini.Saat ini, kita masih tidak memiliki bukti langsung untuk menjelaskan mengapa DBTdiperlukan dua herbal yang berbeda.

DBT memiliki dampak yang signifikan pada T-limfosit proliferasi, dan efek, kemungkinan, bisa menjadi hasil dari rilis peningkatan IL-2, IL-6 dan IL10.Gagasan ini sangat didukung oleh efek inhibitor MEK yang diblokir pelepasan sitokin serta proliferasi limfosit T-.Sitokin adalah protein larut set yang memainkan peran kunci dalam immuno-regulasi di kedua respon imun bawaan dan adaptif dan . Di antara sitokin spesifik DBT-diaktifkan, IL-2 merupakan faktor pertumbuhan yang penting untuk T-limfosit, yang bisa memperkuat respon limfosit secara in vivo. Peraturan dari IL-2 oleh DBT mungkin menjadi salah satu mekanisme penting untuk efek DBT pada T-limfosit proliferasi.IL-10 adalah faktor pertumbuhan untuk limfosit B dan bertanggung jawab untuk diferensiasi mereka, yang dapat menginduksi sekresi imunoglobulin oleh B-limfosit dan.

Selain itu, IL-10 adalah stimulator poten dari sel NK, fungsi yang terlibat dalam peradangan yang mungkin berkontribusi terhadap pembersihan patogen dan memfasilitasi akuisisi antigen dari sel-sel mati. IL-6 merupakan sitokin multifungsi yang memainkan peran penting tidak hanya dalam sistem kekebalan tubuh, tetapi juga di hematopoiesis, dan reaksi fase akut T. Yamamoto, T. Matsuda, A. Muraguchi, K. Miyazono dan M. Kawabata,cross-talk antara IL-6 dan TGF-beta sinyal dalam sel hepatoma. Efek dari DBT juga telah teruji dan terbukti dalam studi hewan sebelumnya. Dalam DBT-diberikan tikus, formulasi dengan RA dan RAS pada rasio 5 : 01 rebusan paling efektif dalam memicu respon imun; tanggapan ini termasuk jumlah limfosit, makrofag dan pelepasan IL-2.