STATUS PERKEMBANGAN PERBAIKAN SIFAT GENETIK PADI MENGGUNAKAN TRANSFORMASI AGROBACTERIUM

Syamsidah Rahmawati
Pusat Penelitian LIPI, jl. Raya Bogor Km 46, Cibinong

Dipresentasikan :

WIJIYONO
Mikrobiologi Mahasiswa Sekolah Pasca Sarjana Universitas Sumatera Utara

Latar belakang
Produktivitas beras rendah Tidak seimbang antara produksi beras dengan konsumen
Produks gen: -nutrisi padi
(golden rice) -tahan kering

Terobosan baru Perbaikan genetik padi Dengan menggunakan Agrobacterium tumifacien

Tehnik transfer gen langsung

Tehnik transfer gen Secara tak langsung

Peran mikroba tanah

Bakteri Agrobacterium tumifacien

Kemampuan menstranfer potongan DNA (T-DNA) ke genom tanaman Komponen genetik Gen virulen kromosom (kromosomal virulence (chv) Kelompok gen virulen (vir) yang terdapat pada plasmid Ti Daerah T-DNA dibatasi : LB (left border), RB (right border yang merupakan gen Bakteri Gen T-DNA : Gen ia aH, gen ia aM, dan ipt enzim

Mekanisme integrasi T-DNA dalam genom Tanaman (Inland (1996), Sheng dan Citovsky (1996), de la Riva et al.(1998)

Hoekema et al (1984) T-DNA dapat ditransfer meskipun terletak pada plasmid yang berbeda (plasmid ganda) binnary vektor.

Faktor yang mempengaruhi transformasi Agrobacterium Genotip dan jaringan tanaman/eksplan (Azhakanandam et al (2000) : keberhasilan transformasi agrobacterium sangat tergantung pada genotip tanaman. Jaringan yang baik : jaringan yang memberikan respon yang baik terhadap kultur jaringan.

Strain Agrobacterium dan Plasmid/vektor

Adanya penggunaan A. tumifaciens strain biasa (LBA) 4404) dikombinasikan dengan vektor super biner dengan gen ekstra gen virB, C dan G sangat efektif untuk menstranfer padi.

 Strain Agrobacterium dan Plasmid/vektor

- Adanya penggunaan A. tumifaciens strain

biassa (LBA) 4404) dikombinasikan dengan vektor super biner dengan gen ekstra gen virB, C dan G sangat efektif untuk menstranfer padi. - Berpengaruh terhadap efisiensi transformasi - Kelemahannya terbatas pada inang yang diinfeksi

Asetosiringon dan Ph
Senyawa fenolik yang berperanan dalam mekanisme transfer gen Kondisi Ph berpengaruh terhadap gen vir. Gen vir dapat diekspresiksn pada pH 5 -8 . Ph 5,2 adalah Ph yang paling baik untuk digunakan dalam transfer genetik.

Antibiotik untuk eliminasi Agrobakterium

Setelah diko-kultivasi kalus direndam dalam larutan antibiotik : untuk menghindari berkembangnya bakteri Agrobakterium Dilanjutkan penggunaan antibiotik pada media regenerasi ( Yara et al.2001 )

Kondisi infeksi dan kokultur

Bakteri yang digunakan untuk infeksi sel tanaman adalah bakteri yang sedang tumbuh aktif ( fase logaritma

Sebelum inokulasi bakteri ditumbuhkan pada media yang mengandung asetosiringon

Media induksi, Ko-kultivasi, regenerasi

Media induksi N6 sedangkan media regenerasi adalah MS ( hiei et al.1994;Rashid et al.1996;Toki 1997; Yara et al. 2001; cao et al.2004). Toki 1997 : Penambahan casamino acids dan prolin dapat meningkatkan kemampuan regenerasi tanaman dan dapat menghasilkan tanaman trasgenik dalam waktu 2 bulan sejak induksi.

Bahan Penyeleksi
Higromisin(hpt), fostinotrisin (bar) (Hiei et al.1994;rashid et al. 2003; Saharan et al. 2004; Jin et al, 2004). Kanamisin (nptII) atau G418 tapi penggunaannya sangat terbatas karena dapat menghambat pertumbuhan sel ( Azhakanandam et al. 2000)

Ekspresi dan Stabilitas Gen

Penyisipan gen ke genom tanaman harus dapat diekspresikan. Espresikan gen dapat ditingkatkan dengan penambahan enhancer dikombinasikan dengan penggunaan promoter yang kuat atau promoter spesifik.

Stabilitas Gen
Gen yang telah terintegrasi pada genom tanaman, maka gen tersebut akan stabil diwariskan ke generasi berikutnya. Hiei dan Komari (1996) melaporkan trasgen stabil diwariskan hingga generasi ke 4. Wu et al.(2002) melaporkan trasgen stabil diwariskan hingga generasi ke 6. Rashid et al (1996) melaporkan kegagalan mengekspresikan gen disebabkan karena ada pebungkaman gen.

Prospek
Tanaman padi yang mengandung gen : Tahan penggerek batang Penyakit blas Hawar daun Kekeringan, salinitas dan herbisida Tanaman padi dengan daya hasil tinggi, kandungan zat besi dan vitamin A yang tinggi

Tabel1.

Beberapa gen yang telah diintroduksi ke dalam tanaman menggunakan transformasi Agrobacterium

Gen
crylAb,crylAc

Asal
B. Thuriengiensis

Promotor
Ubi,CaMV35S,Bras sicaBp10 GluB-1

S.Sasaran
Tahan PBK dan PBP Padi mengandung zat besi dan zink
Padi mengandung Pro Vitamin A

Varitas
Nipponbare(Japoni ca) Indica (IR68144)

Pustaka
Cheng et al.(1998)

Ferritin

Kedelai

Goto et al (1999); Vasconcelos et al.(2003)

Yeetal (2000)

Psy,lyc,crt1

Bunga daffodil Bakteri Erwinia uredovora Manusia

Gt1,35s CaMV

Japonica(TP309)

rhLF(lactoferrin)

Ubiquitin jagung

Padi mengandungg lactoferin Tahan Rhizoctonia solani dan magnaphore grisea Tahan pbk

Javanica(rojolele)

Rahmawati dan slamet ledin (2004) Mei et al.9200020

Ech42, nag 70,glue48

Trichoderma atriviride

Act1

Ishikarishiroge(japonica)

Crylb-crylaa hybrid

Bt

Ubiquiin jagung

Japonica(rojolele0

Rahmawati dan slamet Loedin (2004) Cao et al.(2004)

VHb dan EPsps

Bakteri vitreoscilla dan slmonella typhimurium

Pistilspesifik dari kentang da CaMV35S

Hasil tinggi dan tahan herbisida

Japonica(Xius 11,Qiufeng,youfeng, dan Hanfeng)

Chitinasel

Padi

CaMV

Tahan jamur penyebab blas Magnaporthe grisea dan Rhizoctonia Solani

Indica(vaidehi,tulsi)

Nishizawa et al.(2002)

Hva1

Barley

Promtor terinduksi ABA, promotor konstitutive actin 1 padi

Osmoprotektan

Indica(Basmati0

Rohila et al.(2002)

otsA-otsB

Bakteri E coli

Promotor terinduksi ABA dan stres,rbcS

Tahan salinitas dan kekeringan

indica9PB-1)

Gang et al.(2002)

Kesimpulan
Transformasi agrobacterium telah berhasl dilakukan pada berbagai kultivar padi japonica, indica dan javanica Keberhasilan trasformasi ditentukan oleh :pemilihan genotip, jaringan tanaman, umur eksplan, strain agrobacterium, vektor, konsentrasi asetosiringon dan Ph, kerapatan sel bakteri, lama dan suhu kokultivasi, antibiotik, bahan penyeleksi, komposisi media kultur .

 Peningkatan efisiensi transformasi disebabkan : penggunaan asetosiringon dan bahan pemadat yang tinggi, pengeringan kalus secara perlahan atau penambahan antinekrotik pasca ko kultivasi . Peningkatan ekspresi gen : pemilihan promoter, penggunaan kodon yang sesuai, penambahan enhancer

Gen tunggal dan poligenik telah berhasil diintroduksikan ke dalam tanaman padi dalam upaya perbaikan mutu genetik padi
Kemampuan transformasi Agrobakterium tanaman transgenik dengan salinan tunggal. menghasilkan