VALIDASI METODA ANALISIS Validasi metoda analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu, berdasarkan percobaan

laboratorium, untuk membuktikan bahwa ebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya. Validasi metode dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis akurat, spesifik, reprodusibel, dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis (Harmita, 2004). Validasi adalah suatu pembuktian terhadap suatu parameter berdasarkan hasil laboratorium bahwa parameter tersebut memenuhi syarat untuk penggunaannya (Gandjar dan Rohman, 2007). Validasi metode ini mengunakan beberapa parameter yaitu ketepatan (akurasi), presisi antara, ripitabilitas, linieritas, robustness, LOD (Limit of Detection), serta LOQ (Limit of Quantitation) (Harmita, 2004). Tujuan dilakukan validasi adalah sebagai verifikasi bahwa parameterparameter kinerja metode analisis cukup mampu untuk mengatasi problem analisis. Metode analisis harus selalu divalidasi, ketika (1) metode baru dikembangkan untuk mengatasi masalah analisis tertentu. (2) metode yang sudah baku direvisi untuk menyesuaikan perkembangan atau karena terjadi suatu masalah yang mengarahkan agar metode tersebut harus direvisi. (3) penjaminan mutu yang mengindikasikan bahwa metode baku telah berubah. (4) metode baku yang dilakukan di laboratorium yang berbeda, di kerjakan oleh analisis yang berbeda, atau dikerjakan dengan alat yang berbeda. (5) untuk mendemonstrasikan kesetaraan antar 2 metode seperti metode baru dan metode baku (Gandjar dan Rohman, 2007). Metode analisis yang mengalami perubahan seperti perubahan pada proses sintesis obat, perubahan pada komposisi produk akhir, serta perubahan pada prosedur analisis harus dilakukan revalidasi atau validasi kembali. Laboratorium harus memvalidasi: a. metode tidak baku b. metode yang didesain/dikembangkan lab c. metode baku yang digunakan diluar lingkup yang dimaksud

d. metode baku yang dimodifikasi e. metode baku untuk menegaskan dan mengkonfirmasi bahwa metode itu sesuai untuk penggunaan yang dimaksudkan. PARAMETER-PARAMETER DALAM VALIDASI METODE ANALISIS Beberapa parameter analisis yang harus dipertimbangkan dalam validasi metode analisis diuraikan dan didefinisikan sebagaimana cara penentuannya. a. Kecermatan (accuracy) Kecermatan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analis dengan kadar analit yang sebenarnya. Kecermatan dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan. Kecermatan hasil analis sangat tergantung kepada sebaran galat sistematik di dalam keseluruhan tahapan analisis. Oleh karena itu untuk mencapai kecermatan yang tinggi hanya dapat dilakukan dengan cara mengurangi galat sistematik tersebut seperti menggunakan peralatan yang telah dikalibrasi, menggunakan pereaksi dan pelarut yang baik, pengontrolan suhu, dan pelaksanaannya yang cermat, taat asas sesuai prosedur. Akurasi ditentukan dengan dua cara yaitu metode simulasi (spikedplacebo recovery) dan metode penambahan baku (standard addition method). Dalam metode simulasi, sejumlah analit bahan murni ditambahkan ke dalam campuran bahan pembawa sediaan farmasi (plasebo) lalu campuran tersebut dianalisis dan hasilnya dibandingkan dengan kadar sebenarnya dari analit yang ditambahkan. Dalam metode penambahan baku, sampel dianalisis kemudian sejumlah tertentu analit yang diperiksa ditambahkan ke dalam sampel dicampur dan dianalisis lagi. Selisih kedua hasil dibandingkan dengan kadar yang sebenarnya (Harmita, 2004).
Akurasi diukur sebagai banyaknya analit yang diperoleh kembali atau sebagai persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan pada suatu pengukuran dengan melakukan spiking pada suatu sampel. Biasanya persyaratan untuk recovery adalah tidak boleh lebih dari 5%. Parameter ini dilakukan dengan pengumpulan data dari 9 kali penetapan kadar dengan 3 konsentrasi yang berbeda seperti 3 konsentrasi dengan 3 kali replikasi. Data dilaporkan sebagai persentase

perolehan kembali (ICH, 2005). Rata-rata perolehan kembali (recovery) analit

harus antara 99-101 % pada tiap level. Kriteria kecermatan sangat tergantung kepada konsentrasi analit dalam matriks sampel dan pada keseksamaan metode (RSD). Vanderwielen, dkk menyatakan bahwa selisih kadar pada berbagai penentuan (Xd) harus 5% atau kurang pada setiap konsentrasi analit pada mana prosedur dilakukan. Harga rata-rata selisih secara statistik harus 1,5% atau kurang (Harmita, 2004). Persen perolehan kembali seharusnya tidak melebihi nilai presisi RSD. Rentang kesalahan yang diijinkan pada setiap konsentrasi analit pada matriks dapat dilihat pada tabel di bawah ini: Analit pd matrik sampel, % 100 > 10 >1 > 0,1 0,01 0,001 0,000.1 (1 ppm) 0,000.01 (100 ppb) 0,000.001 (10 ppb) 0,000.000.1(1 ppb)
(Harmita, 2004)

Rata-rata yg diperoleh , % 98-102 98-102 97-103 95-105 90-107 90-107 80-110 80-110 60-115 40-120

b. Keseksamaan (precision)

Keseksamaan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari campuran yang homogeny (Harmita, 2004) atau metode yang menyatakan variasi dari laboratorium seperti perbedaan hari,

perbedaan analis, perbedaan peralatan (ICH, 2005). Sumber lain menyebutkan bahwa presisi merupakan ukuran keterulangan metode analisis dan diekspresikan sebagai simpangan baku relatif dari sejumlah sampel yang berbeda signifikan secara statistik (Gandjar dan Rohman, 2007). Keseksamaan diukur sebagai simpangan baku atau simpangan baku relatif (koefisien variasi). Keseksamaan dapat dinyatakan sebagai keterulangan (repeatability) atau ketertiruan (reproducibility). Keterulangan adalah keseksamaan metode jika dilakukan berulang kali oleh analis yang sama pada kondisi sama dan dalam interval waktu yang pendek. Keterulangan dinilai melalui pelaksanaan penetapan terpisah lengkap terhadap sampel-sampel identik yang terpisah dari batch yang sama, jadi memberikan ukuran keseksamaan pada kondisi yang normal. Ketertiruan adalah keseksamaan metode jika dikerjakan pada kondisi yang berbeda. Biasanya analisis dilakukan dalam laboratorium-laboratorium yang berbeda menggunakan peralatan, pereaksi, pelarut, dan analis yang berbeda pula. Analis dilakukan terhadap sampel-sampel yang diduga identik yang dicuplik dari batch yang sama. Ketertiruan dapat juga dilakukan dalam laboratorium yang sama dengan menggunakan peralatan, pereaksi, dan analis yang berbeda. Kriteria seksama diberikan jika metode memberikan simpangan baku relatif atau koefisien variasi 2% atau kurang. Akan tetapi kriteria ini sangat fleksibel tergantung pada konsentrasi analit yang diperiksa, jumlah sampel, dan kondisi laboratorium. Dari penelitian dijumpai bahwa koefisien variasi meningkat dengan menurunnya kadar analit yang dianalisis. Ditemukan bahwa koefisien variasi meningkat seiring dengan menurunnya konsentrasi analit. Pada kadar 1% atau lebih, standar deviasi relatif antara laboratorium adalah sekitar 2,5% ada pada satu per seribu adalah 5%. Pada kadar satu per sejuta (ppm) RSDnya adalah 16%, dan pada kadar part per bilion (ppb) adalah 32%. Pada metode yang sangat kritis, secara umum diterima bahwa RSD harus lebih dari 2%. (Harmita, 2004) c. Selektivitas (Spesifisitas)

Selektivitas atau spesifisitas suatu metode adalah kemampuannya yang hanya mengukur zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain yang mungkin ada dalam matriks sampel. Selektivitas seringkali dapat dinyatakan sebagai derajat penyimpangan (degree of bias) metode yang dilakukan terhadap sampel yang mengandung bahan yang ditambahkan berupa cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, senyawa asing lainnya, dan dibandingkan terhadap hasil analisis sampel yang tidak mengandung bahan lain yang ditambahkan
(Harmita, 2004).

Selektivitas metode ditentukan dengan membandingkan hasil analisis sampel yang mengandung cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, senyawa asing lainnya atau pembawa plasebo dengan hasil analisis sampel tanpa penambahan bahan-bahan tadi. Penyimpangan hasil jika ada merupakan selisih dari hasil uji keduanya (Harmita, 2004). Jika cemaran dan hasil urai tidak dapat diidentifikasi atau tidak dapat diperoleh, maka selektivitas dapat ditunjukkan dengan cara menganalisis sampel yang mengandung cemaran atau hasil uji urai dengan metode yang hendak diuji lalu dibandingkan dengan metode lain untuk pengujian kemurnian seperti kromatografi, analisis kelarutan fase, dan Differential Scanning Calorimetry. Derajat kesesuaian kedua hasil analisis tersebut merupakan ukuran selektivitas. Pada metode analisis yang melibatkan kromatografi, selektivitas ditentukan melalui perhitungan daya resolusinya (Rs). (Harmita, 2004) Hasil kromatogram standar dan sampel harus menunjukkan waktu retensi yang sama dan pada daerah sekitar waktu retensi tersebut tidak boleh ada gangguan yang dapat dilihat dari kromatogram larutam blanko
(Harmita, 2004).

d.

Linearitas dan Rentang Linearitas adalah kemampuan metode analisis yang memberikan respon yang secara langsung atau dengan bantuan transformasi matematik yang baik, proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel atau kemampuan prosedur analisis untuk memperoleh hasil percobaan yang

berbanding lurus kepada konsentrasi analit di dalam sampel (ICH, 2005). Parameter ini merupakan ukuran seberapa baik kurva kalibrasi yang menghubungkan antara respon (y) dengan konsentrasi (x). Linieritas dapat diukur dengan melakukan pengukuran tunggal pada konsentrasi yang berbeda dan selanjutnya ditentukan nilai kemiringan (slope) dan intersep serta koefisien korelasi (Gandjar dan Rohman, 2007). Rentang metode adalah pernyataan batas terendah dan tertinggi analit yang sudah ditunjukkan dapat ditetapkan dengan kecermatan, keseksamaan, dan linearitas yang dapat diterima. Istilah rentang dapat diterapkan pada kinerja instrument (rentang dinamik) tapi, jika diterapkan pada kinerja suatu penetapan kadar, istilah ini berarti bahwa interval antara konsentrasi atas dan konsentrasi bawah suatu analit yang telah ditetapkan tingkat presisi dan akurasi yang dapat diterima. Rentang tipikal adalah 80120% dari jumlah yang dinyatakan untuk suatu produk jadi; 70-130% dari konsentrasi yang diharapkan, misalnya untuk kandungan tablet tunggal (rentangnya mungkin bahkan lebih lebar untuk beberapa produk, seperti dosis yang dihantarkan dengan suatu inhaler dosis terukur) dan 0-110% untuk uji-uji disolusi terhadap pelepasan obat dari bentuk sediaannya selama satu periode waktu. Dalam beberapa kasus, untuk memperoleh
hubungan proporsional antara hasil pengukuran dengan konsentrasi analit, data yang diperoleh diolah melalui transformasi matematik dulu sebelum dibuat analisis regresinya (Harmita, 2004).

Dalam praktek, digunakan satu seri larutan yang berbeda konsentrasinya antara 50 150% kadar analit dalam sampel. Di dalam pustaka, sering ditemukan rentang konsentrasi yang digunakan antara 0 200%. Jumlah sampel yang dianalisis sekurang-kurangnya delapan buah sampel blanko (Harmita, 2004). Sebagai parameter adanya hubungan linier digunakan koefisien korelasi r pada analisis regresi linier Y = a + bX. Hubungan linier yang ideal dicapai jika nilai b = 0 dan r = +1 atau 1 bergantung pada arah garis. Sedangkan nilai a menunjukkan kepekaan analisis terutama instrumen yang digunakan. Parameter lain yang harus dihitung adalah simpangan baku residual (Sy). Dengan menggunakan kalkulator atau perangkat lunak

komputer, semua perhitungan matematik tersebut dapat diukur (Harmita, 2004). Suatu koefisien korelasi > 0,99 dianggap menunjukkan linearitas.
e.

Batas Deteksi (Limit Of Detection, LOD) Batas deteksi didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat dideteksi, meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi. LOD merupakan batas uji yang secara spesifik menyatakan apakah analit di atas atau di bawah nilai tertentu. Definisi batas deteksi yang paling umum digunakan dalam kimia analisis adalah bahwa batas deteksi merupakan kadar analit yang memberikan respon sebesar respon blanko (yb) ditambah dengan 3 simpangan baku blanko (3Sb). LOD seringkali diekspresikan sebagai suatu konsentrasi pada rasio signal terhadap derau (signal to noise ratio) yang biasanya rasionya 2 atau 3 dibanding 1. Terdapat 2 metode pilihan lain untuk menentukan LOD yakni: metode non instrumental visual dan dengan metode perhitungan. Metode non instrumental visual digunakan pada teknik kromatografi lapis tipis dan pada metode titrimetri. LOD juga dapat dihitung berdasarkan pada standar deviasi (SD) respon dan kemiringan (slope, S) kurva baku pada level yang mendekati LOD sesuai rumus, LOD=3,3 (SD/S).

f. Batas Kuantifikasi (Limit Of Quantification, LOQ) Batas kuantifikasi didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan. Sebagaimana LOD, LOQ juga diekspresikan sebagai konsentrasi (dengan akurasi dan presisi juga dilaporkan). Perhitungan LOQ dengan rasio signal to noise 10:1 merupakan aturan umum, meskipun demikian perlu diingat bahwa LOQ merupakan suatu kompromi antara konsentrasi dengan presisi dan akurasi yang dipersyaratkan. Jadi, jika konsentrasi LOQ menurun maka presisi juga menurun. Jika presisi tinggi dipersyaratkan, maka konsentrasi LOQ yang lebih tinggi harus dilaporkan. Terdapat juga 2 metode pilihan lain untuk menentukan LOQ yaitu metode non instrumental visual dan

metode perhitungan. Sekali lagi, metode perhitungan didasarkan pada standar deviasi respon (SD) dan slope (S) kurva baku sesuai dengan rumus: LOQ = 10(SD/S). g. Kisaran (range) Kisaran suatu metode didefinisikan sebagai konsentrasi terendah dan tertinggi yang mana suatu metode analisis menunjukkan akurasi, presisi, dan linieritas yang mencukupi. Kisaran-kisaran konsentrasi yang diuji tegantung pada jenis metode dan kegunaan-kegunaannya. Untuk pengujian komponen utama (mayor), maka konsentrasi baku harus diukur di dekat atau sama dengan konsentrasi kandungan analit yang diharapkan. Suatu strategi yang baik adalah mengukur baku dengan kisaran 25, 50, 75, 100, 125, dan 150 % dari konsentrasi analit yang diharapkan. h. Ketangguhan metode (ruggedness) Ketangguhan metode adalah derajat ketertiruan hasil uji yang diperoleh dari analisis sampel yang sama dalam berbagai kondisi uji normal, seperti laboratorium, analisis, instrumen, bahan pereaksi, suhu, hari yang berbeda, dll. Ketangguhan biasanya dinyatakan sebagai tidak adanya pengaruh perbedaan operasi atau lingkungan kerja pada hasil uji. Ketangguhan metode merupakan ukuran ketertiruan pada kondisi operasi normal antara lab dan antar analis (Harmita, 2004). Ketangguhan metode ditentukan dengan menganalisis beningan suatu lot sampel yang homogen dalam lab yang berbeda oleh analis yang berbeda menggunakan kondisi operasi yang berbeda, dan lingkungan yang berbeda tetapi menggunakan prosedur dan parameter uji yang sama. Derajat ketertiruan hasil uji kemudian ditentukan sebagai fungsi dari variabel penentuan. Ketertiruan dapat dibandingkan terhadap keseksamaan penentuan di bawah kondisi normal untuk mendapatkan ukuran ketangguhan metode. Perhitungannya dilakukan secara statistic menggunakan ANOVA pada kajian kolaboratif yang disusun oleh Youden dan Stainer (Harmita, 2004).

i.

Kekuatan (Robustness) Kekuatan adalah ketahanan suatu metode analisis mengenai kapasitasnya untuk tetap tidak terpengaruh oleh adanya variasi metode yang kecil. Ketahanan dievaluasi oleh adanya variasi parameter-parameter metode seperti persentase pelarut organik, pH, kekuatan ionik, atau suhu (Gandjar dan Rohman, 2007). Untuk memvalidasi kekuatan suatu metode perlu dibuat perubahan metodologi yang kecil dan terus menerus dan mengevaluasi respon analitik dan efek presisi dan akurasi. Sebagai contoh, perubahan yang dibutuhkan untuk menunjukkan kekuatan prosedur HPLC dapat mencakup (tapi tidak dibatasi) perubahan komposisi organik fase gerak (1%), pH fase gerak ( 0,2 unit), dan perubahan temperatur kolom ( 2 - 3 C). Perubahan lainnya dapat dilakukan bila sesuai dengan laboratorium. Identifikasi sekurangkurangnya 3 faktor analisis yang dapat mempengaruhi hasil bila diganti atau diubah. Faktor orisinal ini dapat diidentifikasi sebagai A, B, dan C. Perubahan nilai faktor-faktor ini dapat diidentifikasi dengan a, b, dan c. Lakukan analisis pada kondisi yang telah disebutkan pada pemeriksaan ketangguhan. Nilai faktor Penetapan eksperimental #1 A atau a B atau b C atau c A B C #2 A b c #3 a B c #4 a b C

Untuk menentukan efek perubahan A, banding rata-rata hasil (#1 + #2)/2 dengan (#3 + #4)/2, Untuk efek perubahan B, bandingkan (#1 + #3)/2 dengan (#2 +#4)/2 dan seterusnya (Harmita, 2004).

j. Stabilitas Untuk memperoleh hasil-hasil analisis yang reprodusibel dan reliabel, maka sampel, reagen dan baku yang digunakan harus stabil pada waktu tertentu. Stabilitas semua larutan dan reagen sangat penting, baik yang berkaitan dengan suhu atau yang berkaitan dengan waktu. Jika larutan tidak stabil pada suhu kamar, maka penurunan suhu hingga 2-80C dapat meningkatkan stabilitas sampel dan standar. Stabilitas juga penting, terkait waktu pengerjaan. Sebagai contoh, analisis secara gradien selama 100 menit tentunya membutuhkan fase gerak yang lebih tinggi dibandingkan dengan analisis secara isokratik selama 5 menit. Fase gerak harus dipilih sedemikian rupa sehingga menghindari masalah-masalah yang terkait dengan stabilitas. Stabilitas sampel, reagen-reagen, dan pelarut-pelarut harus mencukupi untuk dilakukannya metode analisis secara rutin di bawah kondisi percobaaan laboratorium yang normal.

1. Kesesuaian sistem Sebelum melakukan analisis setiap hari, seorang analis harus memastikan bahwa sistem dan prosedur yang digunakan harus mampu memberikan data yang dapat diterima. Hal ini dapat dilakukan dengan percobaan kesesuaian sistem yang didefinisikan sebagai serangkaian uji untuk menjamin bahwa metode tersebut dapat menghasilkan akurasi dan presisi yang dapat diterima. Parameter-parameter yang dapat digunakan untuk menetapkan kesesuaian sistem sebelum analisis meliputi: bilangan lempeng teori (N), faktor tailing, kapasitas (k atau ) dan nilai standar deviasi relatif (RSD) tinggi puncak dan luas puncak dari serangkaian injeksi. Pada umumnya, paling tidak ada 2 kriteria yang biasanya dipersyaratkan untuk menunjukkan kesesuaian sistem suatu metode. Nilai RSD tinggi puncak atau luas puncak dari 5 kali injeksi larutan baku pada dasarnya dapat diterima sebagai salah satu kriteria baku untuk pengujian komponen yang jumlahnya banyak (komponen mayor) jika nilai RSD 1% untuk 5 kali injeksi.

Sementara untuk senyawa-senyawa dengan kadar sekelumit, nilai RSD dapat diterima jika antara 5-15 %.