ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL. EQUIPAMIENTO DISPONIBLE. El trmino Proteoma fue usado por primera vez por Wilkins et al.

(1996) para describir el conjunto de protenas que se expresan a partir de un genoma en un momento dado. El Proteoma es un elemento altamente dinmico, cuyos componentes varan en un organismo, tejido, clula o compartimento subcelular, como consecuencia de cambios en su entorno, situaciones de estrs, administracin de drogas, seales bioqumicas o su estado fisiolgico o patolgico. La Protemica se ha definido como la ciencia o conjunto de tecnologas que estudian el proteoma. La electroforesis bidimensional en geles de poliacrilamida (2D PAGE) es la herramienta ms empleada para el anlisis global y la separacin de los componentes del proteoma. Dicha tcnica permite la separacin de cientos o miles de protenas (spots) en un nico gel, mostrando un patrn caracterstico. La Separacin de Protenas mediante 2D PAGE pasa por las siguientes etapas: Preparacin de la muestra: (Solicitud de anlisis www.proteored.org ). Consultar Gua de Usuario. Es el paso ms crtico y clave en el xito del experimento. En l se emplean agentes caotrpicos, surfactantes y agentes reductores. Los agentes caotrpicos como la urea y tiourea, provocan la desnaturalizacin de las protenas por ruptura de puentes de hidrgeno, dejando expuestos los residuos hidrofbicos que son solubilizados por los agentes surfactantes. Los agentes reductores como el DTT (aunque tambin se emplean otros reductores alternativos no cargados), completan la desnaturalizacin proteica por ruptura de puentes disulfuro. Separacin en la 1 Dimensin (Isoelectroenfoque): (Solicitud de anlisis www.proteored.org ). Consultar Gua de Usuario.

En primer lugar las protenas se separan en base a su punto isoelctrico en gradientes de pH inmovilizados (IPGs).

Equipo de Isoelectroenfoque: Protean IEF cell (BioRad)

Separacin en la 2 Dimensin (SDS-PAGE): (Solicitud de anlisis www.proteored.org ). Consultar Gua de Usuario.

Una vez que las protenas han sido separadas en funcin de sus propiedades elctricas, pasamos a separarlas en funcin de su tamao o peso molecular mediante la electroforesis en geles de acrilamida en presencia de dodecil-sulfato sdico (SDS). Estas dos separaciones sucesivas permiten aislar prcticamente todas las protenas de un proteoma en una matriz bidimensional (electroforesis bidimensional).

Equipo de Electroforesis Bidimensional: Mini Protean System (BioRad)

Equipo de Electroforesis Bidimensional: Protean Plus Dodeca Cell (BioRad)

Tincin: (Solicitud de anlisis www.proteored.org ). Consultar Gua de Usuario.

Para visualizar las protenas en el gel, stas deben ser teidas de alguna manera. La eleccin del mtodo de tincin viene determinado por diferentes factores, como la sensibilidad deseada, rango lineal, facilidad de uso, precio y tipo de equipo de adquisicin de imagen disponible. Los mtodos ms usados son la tincin con Coomassie Blue, la tincin fluorescente con Sypro Ruby y la tincin con Plata, aunque esta ltima no es del todo compatible con el anlisis posterior de las protenas por espectrometra de masas.

Gel Bidimensional: Tincin Coomassie Blue

Adquisicin y Anlisis de Imagen: (Solicitud de anlisis www.proteored.org ). Consultar Gua de Usuario.

La habilidad para adquirir datos en formato digital es uno de los principales factores que hace a los geles bidimensionales ser un prctico medio para recoger informacin sobre un proteoma. Antes de que los geles donde hemos separado las protenas puedan ser analizados con un sistema de evaluacin de imgenes, stos deben ser digitalizados. Los instrumentos de adquisicin de imgenes ms comnmente usados son los densitmetros (GS800) y los escneres de fluorescencia (FX ProPlus). Todos ellos funcionan con softwares de anlisis diseados para detectar y cuantificar spots en las imgenes digitales as como para comparar y analizar estadsticamente los geles de inters. El software de anlisis usado en el Servicio es el PDQuest de Bio-Rad. Se ofrece la opcin de usar el software Decyder de GE para anlisis de imgenes DIGE.

Escner de Fluorescencia: FX ProPlus (BioRad)

Densitmetro : GS-800 (BioRad)

Software de anlisis PDQuest (Bio Rad)

Software de anlisis DeCyder v6.5, GH Healtcare (GE)