Practica 7

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29/10/2011

Universidad Auto noma de Zacatecas Francisco Garc a Salinas Area de Ciencias de la Salud Unidad Academica de Ciencias Qumicas Qumico Farmaceutico Bio logo
LABORATORIO DE INMUNOLOGIA DIAGNOSTICA

PRACTICA 7

DETERMINACIN DEL ANTGENO ESPECFICO DE

PRSTATA

(PSA)

* Ftima Sarai Lpez Hernndez, Mnica Adriana Rodrguez Zavala, Sarai Ziga Estupian, Abraham Lpez Arellano Docente: Aracely Gmez Corvera

*7Semestre Grupo C Programa educativo Q.F.B. UACQ, ACS, Campus

UAZ Siglo XXI, carretera Zacatecas-Guadalajara Km 6 s/n ejido La Escondida Cp. 98160 Zacatecas Zac. Agosto-Diciembre 2011 OBJETIVO Realizar la determinacin semi-cuantitativa del antgeno especfico de la prstata (PSA) en el suero humano.

INTRODUCCIN Y FUNDAMENTO El antgeno prosttico especfico (PSA), tambin llamado calicrena III, seminina, semenogelasa, -seminoprotein y antgeno P30, es una glicoprotena de 34 kD producida casi exclusivamente por la glndula prosttica. El PSA es producido con el fin de licuar el Campus UAZ Siglo XXI | ACS, UACQ, QFB, Sptimo Semestre grupo C Laboratorio de Inmunologa Diagnostica

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semen eyaculado y permitir un medio para que los espermatozoides se movilicen libremente. Tambin se cree que es til para disolver la capa mucosa cervical, permitiendo la entrada a los espermatozoides. Bioqumicamente, el PSA es una enzima sern-proteasa el gen de la cual est localizado en el cromosoma 19 (19q13). Es una protena cuya sntesis no es exclusiva de la prstata. Una pequesima parte de este PSA pasa a la circulacin sangunea de hombres enfermos, y es precisamente esta PSA que pasa a la sangre, la que se mide para el diagnstico, pronstico y seguimiento del cncer tanto localizado como metastsico y otros trastornos de la prstata, como la prostatitis. Los niveles normales en sangre de PSA en los varones sanos son muy bajos, del orden de millones de veces menos que el semen, y se elevan en la enfermedad prosttica. Los valores de referencia para el PSA srico varan segn los distintos laboratorios, aunque el valor normal aceptado actualmente es de hasta 2,5 ng/ml. Su produccin depende de la presencia de andrgenos y del tamao de la glndula prosttica. El PSA aumenta con el agrandamiento de la prstata, llamado tambin hiperplasia benigna de prstata o HBP, fenmeno que ocurre en muchos hombres conforme van avanzando en edad. Tambin puede aumentar en caso de irritacin, prostatitis una inflamacin de la glndula prosttica y en el infarto prosttico. El PSA tambin puede aumentar normal y lentamente conforme avanza la edad del hombre, incluso si la prstata es normal. La eyaculacin puede provocar un aumento temporal del PSA en la sangre, razn por la que se recomienda abstenerse de relaciones sexuales un mnimo de 2 das antes de la extraccin de sangre para el estudio del PSA. Al contrario de lo que se ha credo durante aos, el tacto rectal no altera significativamente los niveles del PSA. Utilizando conjuntamente el valor del PSA y el tacto rectal se puede descubrir ms del 60% de los cnceres de prstata que todava no estn localizados. FUNDAMENTO La prueba PSA ELISA est basada en el principio de un ensayo inmunoabsorbente vinculado a las enzimas de fase slida. El sistema de ensayo utiliza un anticuerpo Anti-PSA de ratn dirigido hacia el PSA intacto para la inmovilizacin de la fase slida(en los pozos de la microplaca) un anticuerpo Anti-PSA monoclonal conjugado para peroxidasa de rbano (HRPO) se encuentra en la solucin de conjugado de enzima-anticuerpo. La muestra de la prueba es permitida reaccionar primero con el anticuerpo de conejo inmovilizado a T C ambiente por 60los,pozos son lavados para remover cualquier Campus UAZ Siglo XXI | ACS, UACQ, QFB, Sptimo Semestre grupo C Laboratorio de Inmunologa Diagnostica
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antgeno no adherido. El conjugado HRPO Anti-PSA monoclonal es entonces reaccionado con el antgeno inmovilizado por 60a T C ambiente provocando que las molculas de PSA se encuentren entre la fase slida y los anticuerpos vinculados a la enzima. Los pozos son lavados con agua para remover anticuerpos etiquetados no adheridos. Una solucin de reactivo TMB es agregada e incubada a T C ambiente por 20provocando el desarrollo de un color azul. El desarrollo del color es frenado con la adicin de solucin de frenado cambiando el color a amarillo. La concentracin de PSA es directamente proporcional a la intensidad del color de la muestra de prueba. La absorbancia es medida espectrofotomtricamente a 450 nm. INTERPRETACIN En la hiperplasia benigna prosttica, los valores de PSA son directamente proporcionales al tamao de la glndula prosttica. Un valor de PSA mayor de 10 ng/ ml siempre es patolgico, y en un 50 % de los casos se diagnostica un cncer prosttico mediante biopsia. Trabajos de investigacin han descripto que pacientes con hiperplasia benigna prosttica tienen mayor proporcin de PSA libre respecto a aquellos con cncer prosttico. La combinacin de ambos ensayos y la expresin del resultado a travs del ndice de PSA libre/total permitira utilizar el mismo para evaluar el riesgo relativo de CP .El valor de corte de este ndice no ha sido claramente definido. Segn la metodologa utilizada el punto de corte seria de 0.15-0.25 (valores por debajo indicaran mayor probabilidad de cncer). Se ha reportado su utilidad para valores de PSA total entre 4 -10 ng/ml Segn el criterio establecido por Mayo Clinic (USA): PSA < 4 ng/ml el riesgo de Cancer de prostata(CP) es bajo PSA > 4ng/ml y PSAL/PSA total <0,25 indica aumenta del riesgo de CP PSA < 4ng/ml y PSAL/PSA total <0,18 indica aumenta del riesgo de CP

Nota: Los resultados de laboratorios pueden variar segn la metodologa utilizada.

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Figura 1 esquema del Mtodo Elisa tipo sndwich

(1) (2) (3) (4)

Anti-PSA de ratn en fase slida. Inmovilizacin del PSA en la placa Unin del anticuerpo anti-PSA monoclonal conjugado con HRPO Aplicacin del reactivo TMB y desarrollo de color.

MATERIALES REQUERIDOS PARA LA PRUEBA 1. Placa de microvaloracin revestida con anti-PSA de conejo 2 pozos 2. Micropipetas de precisin de 50-100l 3.-Puntas de pipetas desechables 4. Recipiente para residuos 5. Gradilla 6. Papel absorbente 7. Piseta MATERIAL BIOLGICO. Muestra de suero
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REACTIVOS

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1. Estndar de referencia, que contiene PSA 0, 2, 4, 15, 60,120 ng/ml, liofilizado, 1 juego. 2. Buffer Cero, 7ml. 3. Reactivo de conjugado de enzima, 12 ml 4. Reactivo TMB (1 paso) ,11ml. 5. Solucin de frenado (1 N HCl), 11ml. 6. Agua destilada. Nota: Permitir que todos los reactivos alcancen la temperatura ambiente PROCEDIMIENTO Diagrama del mtodo del ensayo

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1. Vertir 50l de estandar 4 y 50l muestra en los pozos apropiados.

2. Depositar en cada pozo 50l de buffer cero.

3. Mezclar durante 30 s

6. Aadimos 50l de reactivo conjugado

5. Lavamos 5 veces con agua

4. Incubamos a 25 C 45

7. Incubamos 45a 25 C

8. Lavamos 5 veces ms con agua destilada

9. Agregamos 100l de TMB

12. Mezclamos y observamos el color comparamos con un estandar.

11. Agregamos por ultimo 100l de solucin de frenado.

10. Incubamos 20

OBSERVACIONES Y RESULTADOS

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Se realiz la observacin macroscpica de la placa para comparar el color desarrollado en el pocillo de muestra con el obtenido en las soluciones estndar de 2, 4 y 15 ng/ml de PSA. TABLA 1. Representacin de la placa y la correlacin con las concentraciones de PSA Contenido de pozo Estndar 15ng/ml Representacin Estndar 4ng/ml Estndar Muestra 2ng/ml

Figura 2 fotografa de la placa en donde se muestra la coloracin obtenida en cada caso. De izquierda a derecha std 15ng/ml , std 4ng/ml, std 2ng/ml y Muestra.

Se observa que la muestra desarrollo una coloracin muy similar a la mostrada en el pocillo de estndar de 2ng/ml. INTERPRETACION Los hombres saludables se les espera tener valores de PSA debajo de 4ng/ml. La concentracin mnima detectable de PSA en este ensayo es calculado ser 0.25ng/ml. Llevamos a cabo una interpretacin semicuantitativa de PSA en la muestra de suero al comparar el color desarrollado en los estndares de concentracin conocida de PSA con el color obtenido en pocillo de muestra con lo que pudimos determinar que el suero del paciente contena una concentracin de aproximadamente 2ng/ml, asentando este resultado en base a que tienen colores casi iguales. Campus UAZ Siglo XXI | ACS, UACQ, QFB, Sptimo Semestre grupo C Laboratorio de Inmunologa Diagnostica

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PSA < 4 ng/ml el riesgo de cncer de prstata es bajo

DISCUSIN El principal tema de discusin en este mtodo es la cuantificacin del PSA ya que no se realiz conforme a lo establecido en el inserto del kit, esto debido a que no se cuenta en el laboratorio con un lector de microplaca, por lo que debi hacerse una consideracin semicuantitativa de comparacin visual del color desarrollado y correlacionarlo con la concentracin aproximada de PSA en la muestra. CONCLUSIONES El resultado aproximado de PSA < 4 ng/ml nos indica que el riesgo de cncer de prstata es bajo en el paciente. Tiene que considerarse el resultado como una aproximacin. Y utilizarse como una adicin a otros procedimientos diagnsticos e informacin disponible por el medico al momento de descartar la presencia de un cncer de prstata.

REFERENCIAS

Harrison Principios de Medicina Interna 16a edicin. Parte V. Oncologa y hematologa. Seccin1: Enfermedades neoplsicas. Mytrle JF (1989). Normal Levels of Prostate-Specific Antigen (PSA). Clinical Aspects of Prostate Cancer. Assessment of New Diagnostic and Management Procedures. Proceedings of a workshop of the Prostate Cancer Working Group of the National Cancer Institute's Organ Systems Program, held October 16-19, 1988 at Prout's Neck, Maine, U.S.A.. New York: Elsevier. pp. 183-9.

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