III.

NUTRITIA SI METABOLISMUL BACTERIILOR PATOGENE Scopurile cultivrii bacteriilor: - identificarea - testarea sensibilitii la antibiotice - obinerea de: produi de biosintez (antibiotice, aa) produi de bioconversie (hormoni steroizi) fermentare (alcoli, acozi organici) - obinerea de vaccnuri NUTRIIA BACTERIAN Pentru creterea bacteriilor n condiii de laborator este esenial s ndeplinim 2 condiii asigurarea nutrienilor i a condiiilor fizice optime Definiii Nutrienii: substane ale cror soluii pot traversa membrana citoplasmatic pentru a fi utilizai n reacii metabolice ce asigur creterea bacteriei. Nutriia: totalitatea modalitilor prin care un organism asimileaz din mediu substanele necesare. Alimente: materialul din care deriv nutrienii; unii provin prin simpla solvire (e.g. sruri minerale, CO2, O2, etc.) iar alii dup o digestie prealabil (proteine, lipide, polizaharide). Modul de nutriie al bacteriilor este absorbtiv iar digestia , extracelular. Principalele elemente utile creterii sunt: carbonul, hidrogenul, oxigenul, azotul, n cantiti mai mici: sulful, forsforul, iar n cantiti infime: sodiu, potasiu, magneziu, fier, mangan. Hidrogenul i oxigenul pot fi oferite prin intermediul apei care este esenial pentru cretere. 1. Sursa de energie Bacteriile care folosesc lumina ca surs de energie se numesc fototrofe (posed clorofil). Chemotrofe - obin energia prin reacii de oxido-reducere, n care donorul de hidrogen este o substan organic, cu formare de ATP. Aceste reacii de oxido-reducere presupun pe lng un donor de hidrogen i un acceptor Din punct de vedere al donorilor de hidrogen bacteriile chemotrofe pot fi : chemoorganotrofe, cnd donorul de hidrogen este o substan organic chemolitotrofe, cind donorul este o subst anorganic.

Acceptorii de hidrogen Oxigenul pentru bacteriile aerobe; transferul de electroni se face cu participarea unor enzime (dehidrogenaze, citocromoxidaze) pentru a realiza respiraia aerob compui organici (nitrii, nitrai, sulfai) sau anorganici (fumarat) n cadrul respiraiei anaerobe. unii compui organici (sursa de carbon i catabolii ai acesteia) funcioneaz fie ca donor , fie ca acceptor de hidrogen. 2. Mecanismele de producere a energiei a. Fermentaia i. Compui organici funcioneaz unii ca donor, alii ca acceptor de hidrogen. ii. Rezult un amestec de produi finali, unii mai oxidai alii mai redui. iii. Mai puin eficient dect respiraia pentru obinerea energiei. iv. Este utilizat de bacteriile obligat i facultativ anaerobe. b. Respiraia i. Implic lanul respirator de transport al electronilor asociat membranei citoplasmatice, ii. Aerob- oxigenul molecular este ultimul acceptor de hidrogen. Obligat aerobe cnd bacteriile folosesc exclusiv O2 ca acceptor de hidrogen Facultativ anaerobe cultiv aerob dar i anaerob, folosnd alternativ acceptorii de hidrogen iii. Anaerob- ultimul acceptor de hidrogen este un compus anorganic (diferit de oxigen) sau organic. Nitrai, ca ultim acceptor la facultativ anaerobi. Carbonatul, sulfatul, fumaratul pentru bacteriile obligat anaerobe (cnd sunt folosite exclusiv procesele fermentative). SURSA DE CARBON Bacteriile autotrofe folosesc ca surs de carbon, CO2. Bacteriile heterotrofe folosesc un compus organic (carbohidrai sau aa.) pe care-l utilizeaz i ca surs de energie. Bacteriile heterotrofe care necesit pentru cretere concentraii mai mari de CO2 dect cele din atmosfer se numesc carboxifile. 3. Sursa de azot azotul reprezint cam 10% din greutatea unei bacterii. Principala surs sunt sruri de amoniu (NH4) sau produi convertibili n NH4 (e.g. azotul organic din aa. sau polipeptide sau, mai rar, cel din atmosfer sau din nitrii).

4. Substane minerale a. P asimilat ca ion fosfat (PO43- ) pentru structurarea fosfolipidelor, compuilor macroergici (ATP, GTP), coenzimelor (NADP, flavine). b. S asimilat din compui organici, hidrogen sulfurat, ioni sulfat) (SO42-, H2S, S) pentru structurarea coenzimei A, a unor aminoacizi. c. K+, Mg2+, Ca2+, Fe2+ asimilai din compui anorganici funcioneaz ca activatori enzimatici. Rolul esenial al Fe2+ constituient al citocromilor i peroxidazelor. Mg i K asigur funcionalitatea ribozomilor. Ca intr n compozii adipicolinatului de calcliu din structura sporilor. d. Microelemente: Zn, Mg, Ca, Cu, .a. n cantitii infime sunt asigurate prin apa de robinet sau din unele impuriti ale unor ingrediente ale mediilor de cultur iar uneori chiar din sticlria de laborator. 4. Factori de cretere Metaboliii eseniali pe care o bacterie nu i mai poate sintetiza i trebuie oferii ca nutrieni preformai se numesc factori de cretere. Factorii de cretere sunt de trei tipuri purine i pirimidine necesare sintezei acizilor nucleici (ARN, ADN) aa: necesari sintezei proteinelor vitamine: necesare ca i coenzime sau grupe funcionale pentru unele enzime. a. Bacterii prototrofe- sintetizeaz integral toi metaboliii eseniali. b. Mutante tulpini auxotrofe- pierd capacitatea de a sintetiza unul sau mai muli metabolii de care devin dependente (factori de cretere indispensabili). c. Avantajele selective ale auxotrofiei. In prezena factorului de cretere pentru care este auxotrof, o bacterie se multiplic mai repede dect tulpina parental prototrof. d. Bacteriile patogene sunt multiplu auxotrofe (deci heterotrofe) Auxotrofia extrem - bacteriile necultivabile (Treponema pallidum, agentul etiologic al sifilisului) i bacteriile obligat intracelulare (rickettsiile i chlamydiile). Necesiti fizico-chimice pentru cultivarea bacteriilor Mediul de cultivare trebuie s ndeplineasc anumite cindiii fizico-chimcie cu efecte favorabile asupra creterii bacteriilor. Acestea sunt: temperatura, pH-ul, prezena unor gaze, osmolaritatea. a. Temperatura: bacterii mezofile, psichrofile i termofile. Intre limitele extreme de cretere ale unei bacterii distingem temperatura optim la care rata de cretere este maxim. De aceea d.a.p.d.v. pentru fiecare bacterie se descriu, pentru valoarea temperaturii de cretere, limita minim, maxim i cea optim.

Bacteriile mezofile: au tempt optim ntre 30 37 C. Limitele inferioare sunt 10 15 i respectiv 40-45 C . Staphylococcus aureus minim optim maximum 10 30-37 45 Pseudomonas maltophilia 4 35 41 Bacteriile psichrofile: minim optiom maxim < 0 10 15 < 20, cresc cel mai bine la temp. joase. Temp optim 10-15 dar se multiplic i sub 10C, inclusiv n frigider (atenie la degradarea alimentelor i medicamentelor; unele sunt condiionat patogene); Bacterii psihotrope: minim optim maxim 0 15 30 > 25 , prefer temp. moderat Bacteriile termofile: Minim optim, maxim 40 45 50-85 C 95C. (dar i peste 100) Exist mari variaii la aceste bacterii privind T optim i cea maxim. Thermus aquaticus minim optim maxim 40 70-72 79 b. pH-ul (sau concentraia ionilor de hidrogen) Bacteriile care cresc optim la pH sub 7 se numesc acidofile minim optim maxim Lactobacillus acidophilus 4.0-4.6 5.8 6.8 6.8 Majoritatea bacteriilor patogne cresc n jurul valorii pH-lui de 7 (pn la 7.4). Mediile de cultur vor fi ajustate la aceast valoare; n plus se ine cont de modificarea pH-lui secundar acumulrii de produi de metabolizare n mediu. Pseudomonas aeruginosa 5.6 6.6 7 8.0 Bacteriile care prefer pH-ul alcalin, se numesc alcalofile Vibrio cholerae 9 In ap peptonat, la pH 9.0, crete n 12-14 ore ca o pelicul la suprafaa apei. c. Aerarea: bacterii aerobe vs bacterii facultativ anaerobe sau obligat anaerobe. Bacterii aerobe: pot fi strict aerobe sau facultativ anaerobe Bacterii strict anaerobe (nu tolereaz nici urme de oxigen)

Bacterii carboxifile: cresc n atmosfer de 5-10% CO2 (nu folosesc C02 ca surs de carbon, dar l folosesc n procesele de carboxilare) Bacterii microarofile: se dezvolt numai la concentraii de 5% O2. d. Presiunea osmotic. In genral bacteriile sunt osmotolerante, putnd crete n limite largi ale acesteia. Unele specii, numite halofile, pot crete la concentraii crescute de sare. Puine dintre ele sunt ns patogene (e.g. Vibrio parahaemolyticus). IV. CRESTEREA SI MULTIPLICAREA BACTERIILOR 1. Creterea vs multiplicarea bacterian a. Echilibru - volum celular (consumator de nutrieni, productor de catabolii) i suprafaa celular (aport de nutrieni/eliminare de catabolii). b. Ruperea echilibrului n favoarea volumului cnd protoplastul crete. c. Restabilirea echilibrului prin i. Diviziune, modalitate uzual de nmulire a eubacteriilor, posibil i la alte clase bacteriene. ii. Inmugurire i fragmentare, modalitate uzual la actinomicete i micoplasme. Creterea i multiplicarea bacteriilor este consecina activitii metabolice; creterea n volum se desfoar dup o raie cubic iar creterea n suprafa, dup o raie ptrat. Cnd suprafaa nu mai corespunde volumului asistm la diviziunea binar care are drept consecin obinerea a 2 celule fiice identice, apoi din 2 se formeaz 4, etc. Multiplicarea are loc n progresie geometric cu rat 2. Dup 18-24 ore se formeaz, in medii de cultur i condiii adecvate o cultur bacterian alctuit din celule identince, numit cultur pur. Mediile de cultur: soluii, fluide sau gelificate, care asigur necesitile nutritive i fizico-chimice pentru cultivarea bacteriilor (cretere i nmulire). a. Indicaiile cultivrii i. izolarea bactriilor n cultur pur pentru depistare, studiu i identificarea lor; ii. obinerea unor metabolii bacterieni; iii. obinera de vaccinuri. b. Clasificarea mediilor de cultur i. Dup constituieni: lichide, solide, semisolide. ii. Dup originea ingredientelor: empirice i sintetice. iii. Dup compoziie: simple, mbogite. iv. Dup indicaii: de izolare (difereniale, selective), de mbogire, de identificare.
5

4. Aprecierea cultivrii bacteriilor a. Aprecierea calitativ a creterii i. In medii lichide: opacifiere, depozit, vl, etc. ii. Pe medii solide: colonii cu form, diametru, circumferin, relief, suprafa, culoarea,transparena, consisten, aderen la mediu diferite. b. Aprecierea cantitativ a creterii, i. Cantificarea creterii: masa bacterian (celule viabile + celule moarte) determinat prin densitatea optic n spectrofotometrie. (Uzual n medii lichide.) numrul celulelor viabile determinat prin unitile formatoare de colonii coninute ntr-un anumit volum dintr-o diluie determinat a culturii. 0.1 ml nsmnai din diluia 1/100: obinem un anumit numr de colonii. Pentru calcularea numrului de UFC = Nr. colonii x inversul diluii (100) x cu factorul diluiei (10). Pentru necesitile identificri bacteriilor repicm bacteria n recipiente cu volum redus de mediu (plci Petri). Curba creterii n volum limitat de mediu: Faza: de lag (A), de accelerare a multiplicrii (B), de cretere exponenial (C), de ncetinire (D), staionar (E) i de declin (F).

faza de lag: bacteria se adapteaz la noile condiii de mediu

 faza de accelerare a multiplicrii: scurtarea progresiv a timpului de generaie pn la atingerea unui interval constant, caracteristic pentru faza urmtoare dar i caracteristic fiecrei specii faza exponenial: timpul de generaie i rata de cretere sunt constante, curba evolueaz exponenial pn ce unul, sau mai muli nutrieni din mediu este epuizat sau/i se acumuleaz produi de metabolism toxici. Timpul de genraie pentru unele bacterii: Vibrio = 10 min, E coli = 20 min, M. tuberculosis 27 ore. Se stabilete o relaie linear : timp i concentraia de bacterii. Bacteriile n aceast faz au form caracteristic i dimensiuni constante, puin mai mari dect cele obinuite, citoplasma intens bazofil, omogen, fr incluzii. In aceast perioad bacteriile sunt sensibile la agenii antimicrobieni, de unde i importana utilizrii unei culturi pentru antibiogram cnd bacteriile se afl n faza de cretere exponenial (dup circa 6 ore de cultivare). faza de incetinire: scade concentraia factorului limitant din mediu. faza staionar: rata de cretere nul, numrul bacteriilor vii rmne constant cteva ore. Exist un raport echilibrat ntre numrul bacteriilor care se multiplic i cele care mor cnd factorul limitant din mediu este un nutrient; dac este vorba de acumularea unui produs toxic, cele dou curbe se disociaz. Importana practic: n aceast faz bacteriile au morfologia i dimensiunile caracteristice speciei, exist incluzii, apar endosporii. Sensibilitatea la ageni antimibrobieni scade. Pentru identificarea bacteriilor se folosesc culturi n faz stationar (dup 18-24 ore). faza de declin: bacteriile mor progresiv, morfologic apar forme aberante. Cnd avem necesiti industriale putem apela la ii. Culturi continui- menin bacteriile n faza exponenial a multiplicrii prin aport continuu de mediu nutritiv proaspt cu evacuarea unui volum corespunztor de cultur. Sunt utile n industrie pentru obinerea de vaccinuri sau produi de biosintez. Se folosete un volum mare de mediu. Randamentul este diferit n funie de tipul de cultur: n volum fix sau cultur continu. Cele dou sisteme sunt chemostatul: printr-un factor limitat (nutrient n cantitate minimal) menine cultura la rata subminimal de cretere; turbidostatul: regleaz fluxul de mediu proaspt n raport cu o anumit densitate optic a culturii; menine cultura la rata maxim de cretere.