Man|pu|ao do DNA Man|pu|ao do DNA

Vetores Vetores Hospedeiros Hospedeiros Utilizao Utilizao

PIasmdeos
Cosmdeos
Virus
Bactrias / Ieveduras
cIonagem
Terapia gnica CIuIas eucariticas
Bacterifagos
PIusmdeos so usodos poro cIonor frogmenfos de DMA de vorios pores de
boses o cenfenos de pores de boses.
Vetores de hospedeiros procuriticos Vetores de hospedeiros procuriticos
Cosmdeos so esfrufuros hbridos que possuem corocfersficos do
bocferiofogo ossociodos do pIosmdeo p8P3ZZ, e so ufiIi;odos poro o
cIonogem dos moiores segmenfos de DMA.
ucterifugos ou fugos so usodos poro cIonor frogmenfos de DMA de
I0.000 - Zb.000 pores de boses. Vrus que ofocom bocfrios.
Cromosomos urtificiuis puru buctrius {AC} e Ievedurus {YACs} podem
ser usodos poro cIonogem de frogmenfos de DMA com cenfenos o miIhes de
pores de boses. YAC escoIhido poro projefo genomo humono.
ov|us So os mals usados nos LesLes de Lerapla
gnlca lnserem o unA curaLlvo dlreLamenLe no cromossomo
onde ele funclona melhor
uesvanLagem pode danlflcar ouLros genes
Adnov|us evam mulLos passagelros o que aumenLa a
posslbllldade de xlLo S que delxam a encomenda em
qualquer lugar da celula e os novos genes nem sempre
Lrabalham bem
Vetores de hospedeiros eucariticos Vetores de hospedeiros eucariticos
ucterifugo - Modo de Ado
osmldeos
A
8ibIiofecos de DMA
CoIeo de frogmenfos de DMA digeridos com endonucIeoses e
cIonodos em vefores.
O n" de cIones depende:Tomonho dos frogmenfos cIonodos eTomonho
do genomo,
8ibIiofeco de E. coIi (3 x I0
o
bp) cIonondo frogmenfos de Z.000 bp
num vefor .000 cIones.
8ibIiofeco do genomo humono (b x I0
9
bp) Z.000.000 cIones.
"uondo o bibIiofeco incIui o fofoIidode do genomo de umo cIuIo ou
orgonismo 8ibIiofeco 0enmico.
ragmenLao enzlmLlca
ou mecnlca
8ibIiofeco de cDMA
cDMA DMA compIemenfor oo mPMA
ceIuIor.
&mo bibIiofeco de cDMA represenfo fodos
os PMA mensogeiros expressos no cIuIo.
Como fo;er esfo bibIiofeco7
Como seIecionor os genes nos bibIiofecos7
Sondos moIecuIores (oIigonucIeofdeos
sinfficos)
cDMA especficos
Anficorpos
efc
SeIeo de cIones com sondos
&sor bibIiofecos de
cDMA poro
expressor
profenos,
AnIise AnIise de de DNA DNA por por Southern Southern bIot bIot
http://highered.mcgraw-hill.com/sites/0072556781/student_view0/chapter14/animation_quiz_5.html
orcoo no rodioofivo de sondos
Esferoide exfrodo dos
pIonfos DigifoIis purpureo e
D. Ionofo.
DIS
Screening de bibIiofecos
Com unticorpos
Anticorpo primrio reconhece o onfgeno
Anticorpo secundrio reconhece o Ac primorio e confm um morcodor

transfer to membrane
Incubao com anti-IgG
Screening de bibIiofecos
Com unticorpos
estern Iotting
PeveIoo W8
FiIme rodiogrofico
embrono frofodo com subsfrofo
SeIeo de cIones recombinonfes
fodos de seIeo de cIonogem
fodos de seIeo de cIonogem
SeIedo de cIones recombinuntes com X-SuI

mp
mp
-Gal
peron Luc
X-SuI
Subsfrofo cromognico poro 8-goI que produ; cor o;uI
PMA poI
8-goIocfosidose
PMAm
Pepressor
IPTS
+ Iocfose
- gIicose
SeIedo com X-SuI CoI5nius bruncus e uzuis
#esoIveu o probIemu du etupu de desnuturudo
I" fermocicIodor
DesenvoIvido por Cefus Corp.
"r. CycIe"
TermocicIodores ofuois: "fouchscreen"
AppIied 8iosysfems
TermocicIudores
AmpIificudo e detecdo ocorrem simuItuneumente;
UtiIizudo de sondus direcionudus tornum o ensuio uItumente especfico,
A8I 7900 - AppIied 8iosysfems
Vuntugens qPC#
Mo infIuenciodo por ompIificoo inespecfico
AmpIificoo moniforodo em fempo reoI
CicIos mois ropidos
Pequer I.000 X menos DMA que PCP convencionoI
AIS ESPECFICO, SEMSVEL E PEPPOD&TVEL
Desvuntugens
AIfo cusfo do equipomenfo e monufeno
o de obro quoIificodo
Diognosficos CInicos (ensoios quoIifofivos e quonfifofivos) de
doenos porosiforios, virois e bocferionos
Progromo MAT (Triogem de boIsos de songue)
Corgo ViroI
ApIicu5es do qPC#
#T-PC#
Vorioo
PC# como mtodo diugnstico
ILME PC#
rvores fiIogenficos
Sequenciumento de DNA
ApIicu5es
0enomo compIefo de mois de 800 orgonismos (MC8I Z007)
Cincio forense
Sequenciumento de DNA:
Mtodo de Sunger
PoIimeri;oo do DMA o ser sequenciodo (moIde) no preseno de:
DMA poIimerose
Primer
dMTPs
ddMTPs
Lembrundo,,,
MucIeofdeo
DesoxirribonucIefdeo
Penfoses
PMA DMA
PoIimerizudo
DeoinucIeotdeos
Vs
DideoinucIeotdeos
Mtodo de Sunger ou Dideoi ou de TerminuIizudo
+ p|m + p|m + p|m + p|m
dd dd dd
dd
Mtodo de Sunger ou Dideoi ou de TerminuIizudo
Mtodo de Sunger ou Dideoi ou de TerminuIizudo
Mtodo de Sunger ou Dideoi ou de TerminuIizudo
Mtodo de Sunger ou Dideoi ou de TerminuIizudo
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dd
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Mtodo de Sunger ou Dideoi ou de TerminuIizudo
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Mtodo de Sunger ou Dideoi ou de TerminuIizudo
dd dd
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Mtodo de Sunger ou Dideoi ou de TerminuIizudo
Mtodo de Sunger ou Sequenciumento ioqumico
dd
dd dd dd
Mtodo de Sunger
Mtodo de Sunger
Sequenciumento MunuuI
Sequenciumento de DNA:
Mtodo ioqumico
1977 Muum e SiIbert Mtodo du Degrududo Qumicu
Trofomenfo do DMA com subsfncios qumicos que corfom o moIcuIo em
nucIeofdeos especficos
Sequenciumento Semi-Automtico
Anos 80 Subsfifuio do defeco por rodioofividode peIo uso de
nucIeofdeos Iigodos o fIuoroforos e sisfemo de Ieifuro o Ioser,
Preporo de geI e opIicoo dos omosfros,
ddMTPs fIuorescenfes Iidos oufomoficomenfe duronfe o eIefroforese
reoo no mesmo poo de geI.
prlmer
pollmerase
dn1s
LemplaLe
ddn1s
SEQUENCIAMENT AUTMTIC
W Sequenciodores de copiIores ZX mois ropidos
W CopiIores preenchidos com geI
W Sisfemo de defeco por meio de fIuorescncio confocoI excifodo por Ioser
W EIimino efopo de monfogem do pIoco e preporoo do geI
W ApIicoo dos omosfros por eIefroinjeo
W AIfo veIocidode e resoIuo no seporoo dos omosfros
Sequenciomenfo em copiIor
Anos 90
Sequenciumento Automtico
Sequenciumento Automtico
!rogramas
-asecalling
!rogramas
phred
EIefroferogromos
Sequncio "Iimpo"
Sequncio "sujo"
ApIicudoes Tcnicus
Sequenciumento do Senomu Humuno
rusiI
I" orgonismo sequenciodo: XyIeIIo fosfidioso
Projefo concIudo em novembro deI999 e o 8rosiI enfrou
poro o hisforio peIo I" sequenciomenfo de um fifopofogeno
de imporfncio econmico
ILMES