Adaptasi hipoksia dan Ekspresi mioglobin dalam Jaringan Jantung Embrio Ayam Tibet Abstrak: mioglobin (Mb) adalah

anggota dari keluarga klasik globin dan memainkan peran penting dalam transportasi oksigen atau penyimpanan. Sebagai berkembang biak ayam yang unik asli di dataran tinggi, Tibet ayam memiliki adaptasi yang baik terhadap hipoksia. Di sini kami menyajikan analisis rinci pertama dari ekspresi Mb pada hipoksia beradaptasi dalam hati ayam. Dalam penelitian ini, telur ayam subur dari Tibet, Shouguang ayam dan ayam Silky terkena hipoksia berkelanjutan (13% O2) dan normoxia (21% O2). Ayam hati embrio dikumpulkan pada hari 16 dan 20 dari inkubasi untuk menguji pengaruh hipoksia pada Mb. Hasil penelitian menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan yang signifikan dalam tingkat konten atau ekspresi Mb antara tiga keturunan ayam di lingkungan normoxic. Embrio ayam Tibet memiliki bobot jantung terberat di antara keturunan ayam dan isi Mb dari semua trah ayam telah meningkat hipoksia membandingkan dengan yang di normoxia. Bawah lingkungan hipoksia, tingkat mRNA Mb ayam Tibet lebih rendah dari Shouguang dan ayam Silky, menunjukkan bahwa tingkat hipoksia antara ayam Tibet dan lainnya ayam dataran rendah berbeda. Perubahan kecil dari konten Mb dan tingkat ekspresi di dalam embrio ayam hipoksia Tibet Tibet menunjukkan ayam memiliki kemampuan adaptasi yang lebih baik hipoksia dalam memanfaatkan oksigen dalam jaringan jantung. Hasil penelitian menunjukkan bahwa Mb adalah up-diatur oleh hipoksia dan mungkin memainkan peran penting dalam mediasi adaptasi hipoksia jantung. PENDAHULUAN Mioglobin, protein dengan sejarah yang kaya adalah hemoprotein sitoplasmik, yang dikembangkan di otot merah dalam menanggapi permintaan mitokondria untuk oksigen (Wittenberg, 1970) dan mengangkut oksigen dari sarcolemma ke mitokondria hati vertebrata dan sel otot merah (Wittenberg dan Wittenberg, 1989; Takahashi dan Doi, 1998; Wittenberg dan Wittenberg, 2003), yang reversibel mengikat O2 oleh residu heme-nya (Ordway dan Garry, 2004). Dalam dekade terakhir, teknologi gen gangguan telah digunakan untuk mempelajari fungsi Mb bawah tekanan hipoksia (Garry et al, 1998;. Meeson et al, 2001;.. Schlieper et al, 2004). Hipoksia adalah tantangan fisiologis utama yang mengancam kelangsungan hidup organisme di daerah dataran tinggi. Banyak peneliti menemukan bahwa konten Mb dan tingkat ekspresi di otot rangka manusia telah meningkat pada ketinggian tinggi (Terrados, 1992;. Gelfi et al, 2004) dan Fraser et al. (2006) hipoksia ditingkatkan juga dapat diinduksi ekspresi Mb dalam jaringan nonmuscle. Di dataran tinggi Tibet, ayam Tibet telah mengembangkan mekanisme halus dari hidup dalam lingkungan hipoksia di adaptasi jangka panjang, menunjukkan bahwa adaptasi dari embrio ayam Tibet untuk hipoksia secara signifikan lebih tinggi dari dataran rendah lainnya ayam ras (Gou et al, 2005.; Wang et al, 2007;. Bao et al, 2007;. Zhang et al, 2008;. Li dan Zhao,

2009). Sampai sekarang, kelompok kami telah mengkonfirmasi bahwa kematian embrio terutama diamati antara Tibet ayam dan ayam dataran rendah lain ketika telur diinkubasi pada hari 18-21, menunjukkan bahwa embrio pada fase akhir inkubasi yang paling sensitif terhadap hipoksia (Bao, 2007; Gou et al, 2007;. Zhang et al, 2007).. Oleh karena itu, kita seharusnya bahwa berbagai tingkat konten Mb dan ekspresi mRNA pada hari 16 dan 20 di jantung di bawah kondisi hipoksia dapat haselpful untuk Tibet ayam untuk beradaptasi lingkungan. Setelah memeriksa peran Mb terkait dengan adaptasi hipoksia antara dataran tinggi dan dataran rendah berkembang biak ayam, maka kami melakukan studi rinci tentang Mb regulasi oleh hipoksia. BAHAN DAN METODE Hewan: Ayam ayam Tibet, Shouguang ayam dan ayam Silky pada usia yang sama dibesarkan di Farm Ayam Percobaan dari China Agricultural University (CAU, Beijing, ketinggian 100 m) dengan prosedur manajemen yang sama. Pada akhir minggu ke-40, mereka dibuahi dengan inseminasi buatan. Tibet ayam (n = 260), Shouguang ayam (n = 300) dan telur ayam Silky subur (n = 300) yang diinkubasi dalam mesin penetasan simulasi hipoksia, menggunakan campuran gas yang mengandung 13% oksigen dan nitrogen 87% simulasi ketinggian 4.000 m. Pada saat yang sama, telur ayam subur Tibet (n = 100), Shouguang ayam (n = 60) dan ayam Silky (n = 60) diinkubasi selama 21 hari dalam mesin penetasan normoxic sebagai kontrol. Prosedur Sampling: Pada hari-hari 16 dan 20 inkubasi, kulit telur dibuka di udarasel embrio dan hidup ditarik keluar dengan sesuatu yg menjentik dan hati dikumpulkan dan segera dimasukkan ke dalam 2 tabung mL microcentrifuge dalam penangas es. Mioglobin konten: Semua hati ditimbang dan homogen (10% b / v homogenat) di es-dingin penyangga (2 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 75 mM Tris, pH7.2, seperti yang dijelaskan oleh Bailey dan Driedzic (1992) dan Reed et al (1994)).. Sampel disentrifugasi pada suhu 4 C dan 12.000 g selama 15 menit. Supernatan dikumpulkan dan Mb konten diuji dengan spectrophotometery ultraviolet. Sebuah panjang gelombang 500-610 nm dilakukan membandingkan supernatan ke buffer. Puncak absorbansi di atas latar belakang menghamburkan cahaya pada 581 nm ditentukan. Mb konsentrasi dihitung dengan menggunakan 12,8 sebagai koefisien kepunahan milimolar (Hardman et al, 1966;. Egginton, 1986) dan dinyatakan sebagai nmolg-1 massa basah. RNA isolasi dan RT-PCR: Hati jaringan dari 10 embrio ayam hidup dari Tibet, Shouguang ayam dan ayam Silky itu sampel masing-masing pada hipoksia dan normoxia. RNA diekstraksi menggunakan TRNzol dan sampel RNA diobati dengan RNaseout dan DNase mengikuti instruksi dari produsen (Qiagen, Jerman). Aliquot total RNA ditranskripsi balik menggunakan primer acak dan M-MLV reverse transcriptase (Promega, AS).

Real-time PCR: PCR cDNA dilakukan dengan menggunakan campuran tuan SYBR Hijau (ABI Terapan Biosystems, AS) dengan primer-primer ditunjukkan pada Tabel 1. Kurva standar untuk gen target bunga (Mb) dan gen rumah tangga (Hprt, hipoksantin phospho-transferase ribosyl) digambar untuk pengujian masing-masing. Reaksi dijalankan pada ABI PRISM 7900 urutan Dectecor (ABI Terapan Biosystems, AS). Kondisi bersepeda terdiri 2 menit pada 50 C, 10 menit pada 95 C dan 40 siklus pada 95 C selama 25 detik, 57 C selama 30 detik dan 72 C selama 25 detik. Setiap real-time PCR, termasuk kontrol nontemplate dilakukan dalam rangkap tiga. Kurva leleh diperoleh setelah penyelesaian dari siklus untuk memverifikasi sekarang dari amplikon tunggal. Real-time PCR produk tersebut diurutkan pada urutan target yang benar tertentu. Berdasarkan kurva standar untuk setiap gen, menyalin nomor cDNA sampel yang dihitung sesuai dengan sampel Qty berarti. Akhirnya, masingmasing dihitung untuk menyalin nomor Mb adalah dinormalisasi terhadap hprt menyalin nomor yang sesuai. Kurva standar dan ekspresi RNA dianalisis dengan menggunakan perangkat lunak SDS2.2 (ABI Terapan Biosystems, AS). Analisis statistik: Data beban jantung embrio, Mb isi, ekspresi mRNA Mb menjadi sasaran analisis GLM menggunakan software SAS (Versi 8,02, SAS Inc, US) masing-masing. Nilai p <0,05 dianggap signifikan secara statistik dan p <0,01 atau p <0,001 dianggap sangat signifikan secara statistik. HASIL Berat badan jantung embrio ayam: bobot jantung, termasuk ayam Tibet dan keturunan ayam lainnya, yang ditunjukkan dalam Gambar. 1. Perlu dicatat bahwa berat jantung dua ayam ras dataran rendah pada hari 16 di hipoksia secara signifikan lebih rendah daripada di normoxia (p <0,05 pada ayam Silky dan p <0,01 dalam ayam Shouguang), sedangkan keturunan ayam tiga pada hari 20 di hipoksia telah rendah hati berat daripada di normoxia (p <0,001 di semua trah ayam). Di bawah kondisi hipoksia, berat jantung ayam Tibet lebih tinggi dari dataran rendah ayam ras (p <0,001 di Shouguang ayam dan p <0,01 pada ayam Silky pada hari 16 dan p <0,05 di Shouguang dan ayam Silky pada hari 20). Gambar. 1: Berat hati pada jenis ayam yang berbeda di bawah kondisi hipoksia dan normoxic. Setiap batang mewakili mean SE untuk setiap kelompok Tibet dan ayam mengandung 16 sampel dan ayam Shouguang dan ayam Silky mengandung 10 sampel, masing-masing. * Perbedaan Signifikan pada tingkat 5%, ** Perbedaan signifikan pada tingkat 1%, perbedaan *** Signifikan pada tingkat 0,1% Gambar. 2:

Mb konsentrasi pada jenis ayam yang berbeda di bawah kondisi hipoksia dan normoxic. Setiap batang mewakili mean SE untuk setiap kelompok Tibet dan ayam mengandung 16 sampel dan ayam Shouguang dan ayam Silky mengandung 10 sampel, masing-masing Mioglobin isi dari jaringan jantung embrio ayam: Gambar 2 menunjukkan hasil dari isi Mb dari tiga keturunan ayam. Isi ayam dan ayam Silky Tibet pada hari ke16 di normoxia lebih rendah daripada di hipoksia, meskipun perbedaannya tidak signifikan secara statistik. Harus juga dicatat bahwa ayam Shouguang menunjukkan isi jauh lebih tinggi dari Mb daripada ayam Tibet pada hipoksia (p <0,05 pada hari 16 dan 20). Semua ayam ras pada hari 20 juga terjadi lebih tinggi isi Mb dalam hipoksia daripada di normoxia (p <0,001 dalam tiga trah ayam). Gambar. 3: Mb ekspresi mRNA pada jenis ayam yang berbeda di bawah kondisi hipoksia dan normoxic. Setiap batang mewakili mean SE untuk setiap kelompok dan setiap kelompok berisi 10 sampel untuk tingkat ekspresi mRNA Mb tingkat ekspresi mRNA: Seperti ditunjukkan dalam Gambar. 3, tidak ada perbedaan yang signifikan pada interaksi konsentrasi berkembang biak x oksigen ditemukan. Ekspresi mRNA Mb dalam ayam Tibet pada dua tahap yang lebih rendah dari keturunan ayam lainnya di hipoksia (p <0,05 pada ayam Silky dan p <0,01 pada ayam Shouguang). Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekspresi mRNA Mb lebih tinggi dalam kondisi hipoksia daripada lingkungan normoxic dalam tiga ayam ras (p <0,01 di Shouguang ayam dan p <0,05 pada ayam Silky pada hari 16, p <0,001 di Shouguang dan ayam Silky dan p < 0,01 dalam ayam Tibet pada hari 20). PEMBAHASAN Meskipun, tentu Mb antara protein terbaik dipelajari dalam hal fungsi, struktur, genetika dan evolusi, relatif sedikit yang diketahui tentang peran sebenarnya dalam metabolisme burung dataran tinggi. Sebagai model hewan, embrio ayam merupakan bahan yang ideal untuk memeriksa adaptasi hipoksia dalam sikap tinggi. Jantung berat badan dan kadar mioglobin pada jenis ayam yang berbeda: Seperti ditunjukkan dalam Gambar. 1, penurunan berat hati dalam tiga bibit ayam menyarankan bahwa hipoksia mungkin menghambat perkembangan embrio mereka. Data berat hati ayam Tibet pada 16 hari menunjukkan perkembangan jantung di Tibet ayam adalah normal. Signifikansi penurunan berat jantung pada hari ke-20 dalam semua trah ayam menunjukkan pertumbuhan jantung dipengaruhi oleh hipoksia. Wei (2005) juga menunjukkan bahwa pertumbuhan embrio ayam jantung Tibet juga dipengaruhi oleh lingkungan hipoksia tetapi efek merugikan pada ayam Tibet lebih rendah dari embrio ayam Dwarf. Hasil ini mirip

dengan laporan dalam studi hipoksia tikus, di mana tikus rumah dari Morococha juga beban jantung jauh lebih besar daripada yang dari permukaan laut (Reynafarje dan Morrison, 1962). Bandingkan dengan penghuni permukaan laut, konsentrasi Mb permanen penduduk dataran tinggi meningkat pada biopsi otot sartorius tetapi tidak berbeda dalam isi hati Mb (Reynafarje, 1962). Hasil yang serupa diamati oleh Wei (2001). Dalam penelitian ini, ada juga ada perbedaan dalam konsentrasi jantung Mb antara ayam Tibet dan keturunan ayam lainnya dua di normoxia tersebut. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kenaikan tingkat Mb di jaringan jantung dalam kondisi hipoksia pada dua tahap. Sebuah konsentrasi tinggi mioglobin dapat memfasilitasi suplai oksigen di bawah kondisi hipoksia ketika pelatihan atau bersaing di ketinggian (Hoppeler dan Vogt, 2001). Mekanisme yang mungkin untuk meningkatkan aliran oksigen ke dalam otot jantung adalah karena itu untuk meningkatkan konsentrasi Mb (Roesner et al., 2006) dan tuntutan terkait dengan kapasitas mitokondria yang lebih tinggi yang dapat mendorong peningkatan konsentrasi Mb jantung (Lurman et al, 2007.) . Data menunjukkan bahwa Shouguang dan bibit ayam Silky memiliki kadar Mb selalu lebih tinggi dari ayam Tibet pada hipoksia, menunjukkan dua dataran rendah keturunan ayam dapat meningkatkan tingkat Mb untuk menjaga kebutuhan metabolik untuk bertahan hidup. Hipoksia menginduksi ekspresi mRNA mioglobin dalam hati embrio ayam: Tidak ada perbedaan yang signifikan (Gambar 3) ditemukan dalam ekspresi mRNA Mb antara tiga keturunan ayam di lingkungan normoxic menunjukkan bahwa perubahan ekspresi Mb dalam tiga keturunan ayam di bawah hipoksia itu disebabkan oleh efek oksigen. Pada manusia dan tikus, regulasi ekspresi Mb dalam hipoksia telah dianggap sebagai respon adaptif terhadap stres hipoksia (Kanatous et al., 2009). Selama pelatihan ketinggian tinggi, Mb tingkat ekspresi mRNA dalam jaringan otot yang up-diatur dalam menanggapi meningkatnya permintaan oksigen atau selama hipoksia hypobaric (Hoppeler dan Vogt, 2001) dan isi peningkatan mRNA Mb dalam otot rangka adalah membangkitkan (Vogt dkk. , 2001). Dalam hati ikan zebra, ekspresi Mb tingkat mRNA juga meningkat pada hipoksia berat (Roesner et al., 2006). Studi ini menunjukkan Mb ekspresi yang up-diatur oleh hipoksia tetapi tidak semua setuju (Levine dan Stray-Gundersen, 2001). Sampai sekarang, beberapa pekerjaan riset gen Mb dalam jaringan jantung dilaporkan, meskipun studi Mb dalam otot rangka menjadi sebuah proyek hotspot di manusia pada hipoksia ketinggian tinggi (Gelfi et al, 2004;. Robach et al, 2007, 2009. ). Dalam hati embrio ayam, kami mengamati bahwa hipoksia menginduksi ekspresi mRNA Mb. Perubahan ini sejalan dengan peran pasokan oksigen utama Mb untuk jantung. Dalam penelitian ini, hasil pertama menunjukkan respon diferensial dari tiga keturunan ayam untuk hipoksia, yaitu bahwa embrio ayam Silky dan Shouguang lebih sensitif terhadap hipoksia dari embrio ayam Tibet ketika mereka diinkubasi

dalam lingkungan hipoksia yang sama simulasi. MRNA penurunan Mb dalam ayam Silky kurang dari itu ayam Shouguang di hipoksia. Alasannya mungkin bahwa ayam Silky berasal dari daerah pegunungan (ketinggian 750 m, negara Taihe di Provinsi Jiangxi, Cina), sedangkan ayam Shouguang berasal dari daerah dataran (25 ketinggian m, Shouguang negara di Provinsi Shandong, Cina), oleh karena itu ayam Silky memiliki kemampuan beradaptasi sedikit lebih kuat dengan lingkungan hipoksia. Durand (1982) berpikir adaptasi terhadap ketinggian tinggi ditandai oleh perubahan yang berbeda untuk mempertahankan homeostasis dengan energi minimum. Fenomena ini mungkin disebabkan oleh konsumsi oksigen lebih rendah dari embrio ayam Tibet pada lingkungan hipoksia, yang kadar oksigen rendah dapat menyebabkan penurunan aktivitas, ventilasi ditingkatkan dan pengurangan tingkat metabolisme (Smith et al, 1996;. Ton et al. , 2003; Van Der Meer dkk, 2005).. KESIMPULAN Singkatnya, hasil penelitian menunjukkan bahwa ekspresi Mb pada trah ayam meningkat tiga hipoksia pada dua tahap dan itu bisa disimpulkan bahwa ayam Mb adalah up-diatur oleh hipoksia. Isi Mb atau tingkat ekspresi mRNA embrio ayam Tibet pada hipoksia memiliki lebih sedikit perubahan dibandingkan dengan keturunan ayam lainnya, menunjukkan bahwa Tibet embrio ayam memiliki daya tahan yang lebih baik hipoksia. Sampai saat ini, mekanisme yang memberikan kontribusi untuk transfer oksigen dari embrio spesies pegunungan tidak sepenuhnya dipahami belum dan studi lebih lanjut diperlukan untuk menyelidiki mekanisme yang mengatur dari dalam embrio ayam Mb Tibet pada kemampuan beradaptasi terhadap hipoksia.